牛眼视网膜和虹膜色素上皮细胞体外培养的生物学特性比较

目的 分离、培养和纯化牛原代视网膜色素上皮细胞(RPE)和虹膜色素上皮细胞(IPE),比较体外培养的RPE与IPE的生物学特性.方法 采用酶辅助显微分离牛眼RPE和IPE,进行体外培养,密度梯度离心法纯化并采用免疫组化法进行鉴定.透射电镜观察体外培养RPE、IPE的超微结构,比较两种细胞体外培养下的生长状况.结果 纯化后体外培养牛RPE和IPE的角蛋白表达强阳性,细胞阳性率分别达到94%和88.7%.原代培养的牛RPE和IPE外形类似,为多角形,具有相似的生长曲线.电镜显示两种细胞都具有细胞极性,顶端有大量微绒毛,原代细胞内含有大量色素颗粒和内质网,RPE含有较多与其吞噬功能相适应的溶酶体.结论 通过酶辅助显微分离色素上皮细胞,结合密度梯度离心的方法可以获得较纯的牛RPE和IPE,该方法同样适用于周切虹膜材料.两种色素上皮细胞具有相似的形态和生物学性状,但仍然存在与功能相适应的超微结构差异.     

异体恒河猴视网膜色素上皮细胞移植探讨

目的 观察供体视网膜色素上皮细胞(retinal pigment epithelium,RPE)在视网膜下腔生长情况,为视网膜色素上皮细胞移植的临床应用提供实验基础.方法 体外获取恒河猴视网膜色素上皮细胞经传代培养至第3代,用5-溴脱氧尿嘧啶标记后经外路将供体色素上皮细胞移植到受体恒河猴视网膜下腔,用光镜和电镜观察移植细胞的存活情况.结果 供体细胞在受体视网膜下腔形成有极性的单细胞层,贴附于Brueh膜上,并形成微绒毛和基底内褶,细胞内可见吞噬体.结论 外路法是一种切实可行的视网膜色素上皮移植方法,移植后的细胞可存活并恢复正常的结构和功能.     

牛眼视网膜和虹膜色素上皮细胞体外培养的生物学特性比较

目的分离、培养和纯化牛原代视网膜色素上皮细胞(RPE)和虹膜色素上皮细胞(IPE),比较体外培养的RPE与IPE的生物学特性。方法采用酶辅助显微分离牛眼RPE和IPE,进行体外培养,密度梯度离心法纯化并采用免疫组化法进行鉴定。透射电镜观察体外培养RPE、IPE的超微结构,比较两种细胞体外培养下的生长状况。结果纯化后体外培养牛RPE和IPE的角蛋白表达强阳性,细胞阳性率分别达到94%和88.7%。原代培养的牛RPE和IPE外形类似,为多角形,具有相似的生长曲线。电镜显示两种细胞都具有细胞极性,顶端有大量微绒毛,原代细胞内含有大量色素颗粒和内质网,RPE含有较多与其吞噬功能相适应的溶酶体。结论通过酶辅助显微分离色素上皮细胞,结合密度梯度离心的方法可以获得较纯的牛RPE和IPE,该方法同样适用于周切虹膜材料。两种色素上皮细胞具有相似的形态和生物学性状,但仍然存在与功能相适应的超微结构差异。     

色素上皮细胞移植的研究现状

目前,视网膜变性疾病还没有一种真正有效的治疗方法,色素上皮细胞移植取得了初步成效,对此进行综述。1色素上皮细胞移植手术方法目前主要限于动物实验,临床只有小样本的实验报告。细胞来源包括视网膜色素上皮细胞(retinalpigmentepithe lium,RPE)和虹膜色素上皮细胞(irispigmentepithelium,IPE)。移植方法主要有两种[1]:(1)外路法:分离并剪断上直肌,暴露近黄斑区的后巩膜,作厚近全层的巩膜瓣,用特制针头刺破其下的脉络膜约4mm,将RPE细胞注入视网膜下腔。(2)内路法:经睫状体扁平部作切口,先行玻璃体切割,再用特制针头刺破中央凹颞上方的视网膜,注入平衡液造成小范围的网脱,然后植入RPE细胞。2色素上皮细胞移植结果2.1视网膜色素上皮细胞的移植动物实验:运用上述方法将RPE细胞移植于视网膜下,10天后感光细胞内节变长,14天后外节变长,21天后大多数RPE细胞贴附于Bruch膜上,28天后移植区视网膜外核层增厚,感光细胞数目增加。RPE细胞和宿主感光细胞外节紧密接触,具有顶部和基底部的极性特征,且能吞噬感光细胞脱落的外节膜盘。临床实验:Algvere[2]将人胚胎视网膜色...     

人胚虹膜色素上皮细胞的初步培养和鉴定

目的:建立人胚虹膜色素上皮细胞(IPE)分离、纯化培养体系并进行鉴定,为进一步研究IPE提供实验基础.方法:取胎龄为15周左右新鲜水囊引产的人胚眼球,取下虹膜组织,用胰蛋白酶消化,将虹膜色素上皮细胞置于培养瓶中,2周后传代,倒置相差显微镜观察,并取对数生长期细胞分别用透射电镜和扫描电镜检查,用单克隆鼠抗角蛋白抗体(AE1/AE3)标记培养细胞进行鉴定.结果:用胰酶分离消化法,人胚虹膜色素上皮细胞易分离和贴壁.细胞形态与视网膜色素上皮细胞形态极为相似,表现为多边形和梭形两种形态,胞质内含色素颗粒,传代细胞内的色素颗粒比原代细胞的色素颗粒少.免疫细胞化学染色阳性,胞质内见棕黄色染色.结论:人胚虹膜色素上皮细胞分离、纯化的实现为IPE细胞生理功能和IPE移植的深入研究提供了可能.     

人眼虹膜色素上皮细胞体外培养及超微结构观察

中华眼科杂志，1994；30(5）：376应用体外培养传代对10例人尸眼虹膜色素上皮细胞进行观察分析。结果表明：直接刮取的细胞进行培养较酶消化法更易存活传代，直接培养的6只眼中，5只眼有细胞生长，经胶原酶消化后培养的4只眼中，1只眼有细胞生长。原代细胞在光镜下呈多角形单层生长,胞浆内有丰富的的色素颗粒，核相对透明，有1～2个核仁。传代后的细胞色素颗粒减少；电镜下见胞浆富含色素，细胞膜有明显微绒毛;免疫组化检查细胞胞浆内角蛋白抗原呈阳性反应，符合虹膜色素上皮细胞的特点。虹膜含有某些生物活性物质,因此虹膜色素上皮细胞的体…     

活体染料标记原代IPEC眼内移植的研究

目的 探讨应用活体染料羧基荧光素乙酰乙酸(CFDA-SE)标记原代的兔自体虹膜色素上皮细胞(iris pigment epithelial cell,IPEC),并移植于视网膜神经上皮层下的可行性.方法 取原代兔眼自体虹膜色素上皮细胞消化分离,经CFDA-SE染色后移植到视网膜神经上皮层下.术后不同时间应用彩色眼底照相、激光扫描检眼镜(SLO)、光学相干断层扫描(OCT)进行活体观察,不同时间点对移植眼进行切片并常规染色及免疫组化,用光学显微镜对移植细胞进行观察和评价.结果 自体移植术后观察显示移植区界限清晰;SLO可观察到移植区内荧光分布;OCT和HE染色均显示移植区神经上皮层下有移植物堆积,并随时间推移逐渐变平.免疫组化显示移植区ZO-1、Actin呈棕色点,有规律地间断分布在Bruch膜上,IPEC嵌插在原始的视网膜色素上皮细胞(retinal pigment epithelial cell,RPEC)间,且形成完整的单层.结论 CFDA-SE作为活体染料标记自体IPEC进行移植时,是一种快捷、稳定、安全的活体细胞染料,可作为理想的标记物应用.     

直接检眼镜直视下冷凝外路治疗视网膜脱离复位术

目的:探讨直接检眼镜直视下冷凝外路治疗视网膜脱离的手术方法与效果。方法:收集了2009年1月至2010年12月间,入住我院眼科行直接检眼镜直视下冷凝外路视网膜脱离术的资料完整的78例患者,具体描述了手术过程,并对手术的效果进行了分析。结果:所有患者经直接检眼镜直视下定位视网膜裂孔并实施冷凝,结合环扎、外加压治疗,视网膜复位率高。结论:在不具备双目间接检眼镜设备及技术的条件下,直接检眼镜直视下冷凝外路治疗视网膜脱离有直视下冷凝封闭视网膜裂孔的优势,这一手术方式对广大的基层医院有一定的借鉴作用。     

兔眼虹膜色素上皮细胞向晶状体上皮细胞转分化的实验研究

目的：在体外成功分离培养虹膜色素上皮细胞,并观察其在特定条件下转分化为晶体上皮细胞的现象.方法：采用酶辅助机械分离法分离并培养兔眼虹膜色素上皮细胞.传代过程中在DMEM培养基内加入苯硫脲、透明质酸酶、重组人成纤维细胞生长因子-4及L-抗坏血酸-2-磷酸完成转分化过程.分别对培养起始和终末的细胞进行光镜、电镜观察和免疫组化染色鉴定.结果：成功分离并培养出原代的虹膜色素上皮细胞,经过特定条件的培养最终转分化为晶体上皮细胞,免疫组化鉴定虹膜色素上皮细胞和晶状体上皮细胞均有其各自特异染色.结论：酶辅助机械分离法是进行虹膜色素上皮细胞原代培养较好的方法.在体外培养条件下,虹膜色素上皮细胞可转分化为晶状体上皮细胞,而透明质酸酶、苯硫脲、L-抗坏血酸-2-磷酸、重组人成纤维细胞生长因子-4等因素可能参与了对上述转分化过程的调节.     

人、猪虹膜色素上皮细胞培养的比较研究

目的建立人、猪虹膜色素上皮细胞培养的方法,比较人、猪虹膜色素上皮细胞形态及生长特性.方法用酶辅助的显微刮除 酶消化法获得的人、猪IPE细胞进行培养,行组织学观察.结果原代培养的人、猪IPE细胞在形态及生长特性上存在一定的差异,但随着传代差异减小或无差异.结论在IPE细胞的培养中,酶消化时间的长短对单层IPE细胞的获得和细胞活力的保持非常重要.     

Tracking of CFSE-labeled endothelial progenitor cells in laser-injured mouse retina

Background  Endothelial progenitor cells (EPCs) transplantation is a promising therapeutic strategy for ischemic retinopathy. The current study aimed to establish a simple, reliable and fluorescent labeling method for tracking EPCs with 5-(and-6)-carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) in laser-injured mouse retina.

Methods  EPCs were isolated from human umbilical cord blood mononuclear cells, cultivated, and labeled with various concentrations of CFSE. Based on fluorescence intensity and cell morphology, a 15 minutes incubation with 5 μmol/L CFSE at 37°C was selected as the optimal labeling condition. The survival capability and the apoptosis rate of CFSE-labeled EPCs were measured by Trypan blue staining and Annexin V/PI staining assay respectively. Fluorescence microscopy was used to observe the label stability during the extended culture period. Labeled EPCs were transplanted into the vitreous cavity of pigmented mice injured by retinal laser photocoagulation. Evans Blue angiography and flat mounted retinas were examined to track the labeled cells.

Results  EPCs labeled with 5 μmol/L CFSE presented an intense green fluorescence and maintained normal morphology, with no significant changes in the survival capability or apoptosis rate after being labeled for 2 days, 1 and 4 weeks. The fluorescence intensity gradually decreased in the cells at the end of 4 weeks. Evans Blue angiography of the retina displayed the retinal capillarity network clearly and fluorescence leakage was observed around photocoagulated spots in the laser-injured mouse model. One week after transplantation of labeled EPCs, the fluorescent cells were identified around the photocoagulated lesions. Four weeks after transplantation, fluorescent tube-like structures were observed in the retinal vascular networks.

Conclusion  EPCs could be labeled by CFSE in vitro and monitored in vivo for at least 4 weeks, and participate in the repair of injured retinal vessels.

     

新生猪缺氧后心肌连接蛋白Cx43表达的变化

目的探讨新生猪缺氧后心肌连接蛋白Cx43 mRNA和蛋白含量的变化。方法对照组(C组):新生猪6头,未吸入低氧;缺氧组(H组):新生猪6头,吸入低氧(FiO2=0.1)维持1 h。于缺氧结束后5 h,免疫荧光染色检测心肌组织细胞缝隙连接蛋白Cx43蛋白的表达,实时荧光定量逆转录多聚酶链式反应(RT-PCR)检测心肌组织Cx43 mRNA的表达。结果H组心肌组织Cx43蛋白的表达显著低于C组(P<0.01),但两组心肌组织Cx43 mRNA表达差异无统计学意义(P>0.05)。结论缺氧可导致心肌Cx43蛋白的表达或分布发生变化。     

成年大鼠骨骼肌卫星细胞的原代培养、鉴定及体外增殖

目的探讨成年大鼠原代骨骼肌卫星细胞体外培养方法,观察细胞的增殖、成肌分化特性。方法采用改进的两步酶消化法结合差速贴壁技术,获得较高纯度的骨骼肌卫星细胞。免疫组化鉴定所获取细胞的肌源性标志desmin。MTT法观察骨骼肌卫星细胞的体外增殖特性并绘制生长曲线图。同时观察不同培养条件下骨骼肌卫星细胞的成肌分化特性。结果所分离的原代骨骼肌卫星细胞纯度在90%以上。细胞体外培养时在第3天进入对数生长期,5～6d进入增殖平台期。细胞体外培养时无须特殊诱导可以自发出现成肌定向分化,相互融合形成具有自发收缩特性的肌管细胞。结论体外培养获取的骨骼肌卫星细胞数量可以满足组织工程研究的需要。     

羊膜细胞培养液对胎儿卵巢组织雌二醇分泌的实验研究

目的观察胎儿卵巢在体外培养条件下及羊膜细胞培养液条件培养液对分泌雌二醇(E2)的影响,旨在为卵巢移植提供较好的供体培养方法。方法取20～28周妊娠水囊引产的胎儿卵巢,将其切成碎块进行一般培养液直接培养(A组)及加羊膜细胞培养液培养(B组)。培养后测定两种不同培养液中E2含量并进行比较。结果胎儿卵巢在一般培养液和加羊膜细胞培养液培养条件下能产生E2,随培养时间延长,E2分泌量增加。而加羊膜细胞培养液组E2分泌量高于一般培养液直接培养(P<0.05)。结论胎儿卵巢在一般培养液培养条件下能分泌E2,而加羊膜细胞培养液能促进培养的卵巢组织的E2分泌,可作为卵巢移植的供体培养的较好培养液。     

T细胞疫苗诱导异种胰岛移植免疫耐受的实验研究

目的体外制备供体特异性T细胞疫苗（T cell vaccine）,探讨T细胞疫苗免疫（T cell vaccination）诱导异种胰岛细胞移植免疫耐受的作用。方法腹腔注射链脲佐菌素诱导建立Balb／c小鼠Ⅰ型糖尿病模型,用酶消化法和密度梯度离心法无菌分离纯化Wistar大鼠胰岛细胞。制备Balb／c小鼠针对Wistar大鼠的T细胞疫苗：实验随机分为三组,G1：糖尿病小鼠对照组;G2：胰岛细胞移植组,糖尿病小鼠＋胰岛细胞移植＋1640培养液（对照组）;G3：胰岛细胞移植加T细胞疫苗免疫组,糖尿病小鼠＋胰岛细胞＋T细胞疫苗（实验组）,于d1,d7,d14,d21实验组Balb／c小鼠接种TCV（1×107／mL）,对照组用1640替代。接种前和每次接种后第5d分别进行混合淋巴细胞反应。胰岛细胞移植：将Wistar大鼠的胰岛按1200。1500IEQ／kg经肝门静脉导入小鼠体内,移植后观测血糖和体重变化。结果异种胰岛细胞移植可以诱导I型糖尿病小鼠血糖降至正常水平且维持一段时间,对照组小鼠移植后（5．12±1．36）d即发生排斥,实验组移植物存活时间达（20．25±3．45）d。结论TCV能够有效延长异种胰岛移植物的存活时间,是一种潜在诱导异种胰岛移植免疫耐受的方法。     

胰岛细胞移植前处理的研究进展

在移植前对移植胰岛细胞及供体进行相关处理,包括优化分离纯化胰岛细胞的条件,找到更加适合的细胞培养液,发明更加良好的免疫隔离方法及找到更加安全的移植途径等,可提高移植物产量,节约供体数量,降低免疫原性,延长在受体体内存活时间,增强胰岛细胞功能,使胰岛细胞能够更有效地控制血糖,改善糖尿病患者的生活质量。     

Gadd45a基因对小鼠造血干细胞功能的影响

目的 Gadd45a基因对小鼠造血干细胞功能的影响.方法 流式细胞仪分选小鼠骨髓造血干细胞、体外单克隆培养,竞争性骨髓移植,放射线照射观察生存曲线.结果 Gadd45a基因缺失的小鼠造血干细胞克隆形成能力增强,短期造血重建能力无差异,8.5Gy放射线照射后生存情况无差异.结论 Gadd45a基因对小鼠造血干细胞功能起重要作用.     

大鼠骨髓间充质干细胞的体外分离与原代培养

目的探讨大鼠骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）的体外分离与原代培养过程中应注意的问题。方法全骨髓贴壁培养筛选法分离和培养大鼠BMSCs,通过不断换液及传代纯化培养的细胞。结果大鼠BMSCs传至P3代后,形态为均匀分布的梭形成纤维样细胞。结论全骨髓贴壁培养筛选法操作简便,需要的骨髓量少,原代培养时更符合细胞生长的微环境,是培养大鼠BMSCs的理想方案。     

成人胰岛细胞的分离与纯化

目的 探讨体外分离与纯化成人胰岛细胞的方法与可行性,为胰岛细胞移植治疗1型糖尿病提供大量高质量的胰岛细胞。方法获取的成人胰腺组织称重后,采用V型胶原酶消化法分离;再用Ficoll间断密度梯度离心纯化法纯化;在DTZ染色显微镜下,评价胰岛细胞的数量、纯度;并用体外培养、放射免疫测定胰岛素法鉴定胰岛细胞活性。结果成人胰腺经胶原酶消化分离后,胰岛平均收获量（3600±447）个／g胰腺;Ficoll间断密度梯度离心纯化后,胰岛平均收获量（2140±207）个／g胰腺,纯度〉70％;成人胰岛细胞培养2、4、6d后,测定其培养液中基础胰岛素浓度（mIU·L^-1·100^-1）分别为（3．302±1．63）、（3．504±1．10）、（2．921±1．13）。结论胶原酶消化法、Ficoll间断密度梯度离心纯化法分离纯化成人胰岛是有效的方法。