重组人3型腺病毒六邻体蛋白纯化及抗原性检测

目的纯化重组人3型腺病毒六邻体蛋白并检测其抗原性。方法在原核表达系统中高效表达重组人3型腺病毒六邻体蛋白。利用Ni-NTA琼脂糖亲和层析柱进行蛋白纯化。用纯化的重组六邻体蛋白免疫新西兰家兔,利用免疫印迹技术检测其血清中抗体效价以鉴定该蛋白的免疫原性和反应原性。结果得到纯化的重组人3型腺病毒六邻体蛋白,该蛋白免疫后产生高效价抗体,该抗体能与重组六邻体蛋白、含有该蛋白的重组工程菌株以及人3型腺病毒发生特异性的免疫印迹反应,证明该重组六邻体蛋白具有良好的抗原性和3型腺病毒特异性。结论所获得的重组人3型腺病毒六邻体蛋白具有良好的抗原性和特异性,为开发基因工程疫苗奠定了基础。     

抗腺病毒载体单克隆抗体的制备及其初步鉴定

目的 研制抗腺病毒载体(Adv)表面蛋白的单克隆抗体(McAb).方法 将Adv以Al(OH)3佐剂化,常规免疫BALB/c小鼠.采用细胞融合技术制备抗Adv McAb;采用ELISA、免疫细胞化学及Western blot法对McAb进行筛选与鉴定.结果 共获得6株可稳定分泌特异性McAb的细胞(A4H11、A8C7、F1H5、G1D2、G4E3、H2G8),其染色体数目为102～106条,所分泌McAb均属IgG1亚类,持续3个月适应培养仍能保持其稳定的抗体分泌能力.腹水抗体的ELISA效价在1∶106～1∶108之间;Western blot结果显示6株McAb均与来自腺病毒载体及野生3、5、7型腺病毒抗原提取物中分子量约为114 kD的多肽反应,据此推测它们均是抗ADV-TK六邻体蛋白的McAb.结论 成功制备出6株抗腺病毒载体六邻体单克隆抗体,为腺病毒载体应用于肿瘤基因治疗的临床前研究提供物质基础.     

Isolation and identification of human adenovirus type 3 GZ13 strain and the molecular evolution of hexon protein.

目的 分离鉴定1株引起儿童急性支气管肺炎的腺病毒及分析其主要中和抗原六邻体蛋白的分子进化趋势.方法 采用荧光定量PCR方法,对1例引起严重支气管肺炎的患儿咽拭子进行检测,并从中分离得到1株腺病毒(命名为GZ13).利用型特异性引物PCR进行初步亚型鉴定;克隆该株腺病毒完整的六邻体蛋白基因,测序和序列比对,确定其型别;同时与GenBank上人3型腺病毒的六邻体蛋白进行同源性比对,分析预测六邻体蛋白的分子进化趋势.结果 该临床标本经荧光定量PCR鉴定为腺病毒强阳性,型特异性引物PCR初步鉴定为3型;完整六邻体基因比对最终确定为人3型腺病毒;GZ13株与我们先前分离的GZ01、GZ02株及台湾地区分离株核苷酸及氨基酸的同源性均大于99%.结论 引起该例儿童急性支气管肺炎的病原体为人3型腺病毒,目前在广州以及台湾地区流行的3型腺病毒仍属同一流行株,其主要中和性抗原六邻体蛋白未出现明显变异,这对今后开发研究人3型腺病毒疫苗及药物具有重要指导意义.     

Ⅲ型登革病毒NS1单克隆抗体的制备及鉴定

目的 研制Ⅲ型登革病毒(DV3)非结构蛋白1(NS1)单克隆抗体,鉴定其血清型特异性.方法 以具有良好抗原性的重组DV3-NS1蛋白与DV3交替免疫Balb/c小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合,间接ELISA筛选阳性的杂交瘤细胞,并结合免疫荧光(IFA)和Weatern Blot对抗体的特异性进行鉴定.结果 经交替免疫法免疫Balb/c小鼠,共获得14株抗DV3-NS1单抗,其亚类测定1株为IgG2a,余为lgG1.其中3株特异性结合DV3及DV3-NS1蛋白,4株能同时结合4型登革病毒NS1蛋白,其余7株与其他3型登革病毒NS1蛋白存在交叉反应.结论 成功获得了针对DV3-NS1的特异性单抗及交叉性单抗,将为进一步研究登革病毒NS1蛋白的结构与功能及临床诊断试剂的研发奠定基础.     

人3型腺病毒GZ13株的分离鉴定及六邻体蛋白的分子进化研究

目的分离鉴定1株引起儿童急性支气管肺炎的腺病毒及分析其主要中和抗原六邻体蛋白的分子进化趋势。方法采用荧光定量PCR方法,对1例引起严重支气管肺炎的患儿咽拭子进行检测,并从中分离得到1株腺病毒(命名为GZ13)。利用型特异性引物PCR进行初步亚型鉴定;克隆该株腺病毒完整的六邻体蛋白基因,测序和序列比对,确定其型别;同时与GenBank上人3型腺病毒的六邻体蛋白进行同源性比对,分析预测六邻体蛋白的分子进化趋势。结果该临床标本经荧光定量PCR鉴定为腺病毒强阳性,型特异性引物PCR初步鉴定为3型;完整六邻体基因比对最终确定为人3型腺病毒;GZ13株与我们先前分离的GZ01、GZ02株及台湾地区分离株核苷酸及氨基酸的同源性均大于99%。结论引起该例儿童急性支气管肺炎的病原体为人3型腺病毒,目前在广州以及台湾地区流行的3型腺病毒仍属同一流行株,其主要中和性抗原六邻体蛋白未出现明显变异,这对今后开发研究人3型腺病毒疫苗及药物具有重要指导意义。     

鼠抗早孕因子单克隆抗体的制备及鉴定

目的制备鼠抗早孕因子（EPF）单克隆抗体,纯化并进行鉴定。方法用重组EPF免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术获得抗EPF杂交瘤细胞株,注入BALB/c小鼠腹腔制备腹水型单抗,Protein-G亲和层析纯化后,SDS-PAGE电泳鉴定其纯度,用间接ELISA法测抗体效价,ELISA相加试验测定抗原表位,用Western blotting鉴定其特异性,并进行类及亚类、细胞染色体核型分析。结果筛选出2株具有较高活性和良好稳定性的分泌抗EPF单克隆抗体的杂交瘤细胞株,其腹水的抗体效价均高于2×10^-5,2株单抗均为IgG类IgG1亚类,轻链类型均为κ,细胞核型分析符合杂交瘤细胞特征,特异性良好,2株单抗有不同的抗原表位。SDS-PAGE电泳显示纯化后抗体有较高的纯度,Western blotting表明其与EPF抗原有特异结合性。结论成功制备2株具有较高活性的鼠抗EPF单克隆抗体,为建立检测EPF方法奠定了良好的基础。     

肾综合征出血热病毒大鼠单克隆抗体制备及其对病毒抗原特性的…

用肾综合征出血热病毒（ＨＦＲＳＶ）免疫Ｌｏｕ／ｃ大鼠脾细胞与ＩＲ９８３Ｆ骨髓瘤细胞融合，获得１１株能分泌特异性体的杂交瘤细胞系。用放射免疫沉淀、Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ及免疫酶技术等对这一组大鼠单克隆抗体（单抗）进行了特性鉴定和病毒抗原性分析。发现１１株单抗中，９株为抗核壳蛋白（ＮＰ）特异性，２株为抗Ｇ２糖蛋白。大多数抗ＮＰ单抗无中和活性及血凝抑制（ＨＩ）活性，但有２株例外，具有一定程度的     

肾综合征出血热病毒大鼠单克隆抗体制备及其对病毒抗原特性的鉴定

用肾综合征出血热病毒（ＨＦＲＳＶ）免疫Ｌｏｕ／ｃ大鼠脾细胞与ＩＲ９８３Ｆ骨髓瘤细胞融合，获得１１株能分泌特异性抗体的杂交瘤细胞系。用放射免疫沉淀、Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ及免疫酶技术等对这一组大鼠单克隆抗体（单抗）进行了特性鉴定和病毒抗原性分析。发现１１株单抗中，９株为抗核壳蛋白（ＮＰ）特异性，２株为抗Ｇ２糖蛋白。大多数抗ＮＰ单抗无中和活性及血凝抑制（ＨＩ）活性，但有２株例外，具有一定程度的中和或（和）ＨＩ活性。而抗Ｇ２单抗均只有一定程度的中和或（和）ＨＩ活性。在ＨＦＲＳＶ抗原性分析方面，可初步将１１株大鼠单抗分成组、亚组、野鼠型及亚型特异性单抗，并对上述单抗特性进行了讨论。     

DEN2重组E蛋白单克隆抗体的制备及其生物学活性

[目的]研制登革病毒E蛋白特异性单克隆抗体,鉴定其各种生物学特性.[方法]用纯化的Pichia pastoris酵母表达的DEN2重组E蛋白作为抗原,免疫Balb/c小鼠,采用传统的细胞融合、有限稀释法克隆化杂交瘤细胞,制备稳定分泌McAbs的细胞株.采用硫酸铵沉淀法纯化腹水中的McAbs,用ELISA、IFA、Western Blot和空斑减数中和实验等鉴定McAbs的各种生物学活性.[结果]用ELISA、IFA检测证实5株杂交瘤细胞产生的McAbs与DEN2重组E蛋白和DEN全病毒均有较高的亲和力;Western Blot分析发现其中3株杂交瘤细胞(3G3,6G11,4E3)分泌的McAbs能与其相对分子质量Mr=(66～69)×103的DEN2重组E蛋白结合.空斑减数中和实验证实所获得的单克隆抗体具有中和登革病毒感染C6/36细胞的作用.[结论]成功地制备了5株抗登革病毒E蛋白特异性的McAbs,为进一步研究E蛋白的结构和功能及临床诊断试剂盒研发打下了基础.     

抗ANXA2单克隆抗体的制备及初步鉴定

目的制备ANXA2特异性单克隆抗体(McAb),为研究ANXA2的生物学功能和检测该蛋白提供有力的抗体工具。方法用经IPTG诱导表达的基因重组PGEX-4T-1-ANXA2抗原免疫BALB/c小鼠,利用常规杂交瘤技术和间接ELISA法筛选抗ANXA2杂交瘤细胞,用ELISA法鉴定所得单抗腹水的效价及Western blot鉴定McAb特异性。单抗纯化和Eu3+标记后,分别包被聚苯乙烯板及作为铕标单抗,利用时间分辨荧光免疫分析法(TRFIA)筛选出检测ANXA2蛋白的最佳配伍单抗。结果经细胞融合、筛选、克隆化,获得了16株可分泌高效价单抗的杂交瘤细胞,间接ELISA显示16株McAb与空载体PGEX-4T-1均未发生交叉反应,抗体特异性良好,16株抗体腹水效价为1∶8 000~1∶256 000,培养上清效价为1∶256~1∶512,纯化的腹水单抗经配对试验,2D6和9H9-Eu3+配对最佳。结论获得16株能稳定分泌高特异性抗ANXA2的杂交瘤细胞,能用于后续研究。     

基因免疫制备抗SARS病毒N蛋白单克隆抗体

目的通过基因免疫方法,制备抗SAILS病毒N蛋白的单克隆抗体并对单抗进行初步鉴定。方法将含有N蛋白的编码基因的真核重组质粒pSecTagB／N免疫BALB／c小鼠,然后取鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合,用原核表达的SARS病毒N蛋白筛选阳性克隆。然后通过免疫印迹法进一步证明抗体对N蛋白的特异性,用ELISA方法检测抗体对灭活SARS全病毒的免疫反应。结果筛选得到10株抗N蛋白的单克隆抗体,ELISA和免疫印迹结果表明这些抗体特异性针对N蛋白上的抗原决定簇,且有7株抗体对SARS灭活病毒有阳性反应。结论所得的单克隆抗体特异针对N蛋白。     

抗人凋亡相关蛋白TFAR19的单克隆抗体制备及鉴定

目的：研制鼠抗人凋亡相关蛋白ＴＦＡＲ１９的单克隆抗体,以进一步探讨ＴＦＡＲ１９蛋白的结构与功能。方法：以纯化的重组人ＴＦＡＲ１９蛋白为抗原,免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠,将ＴＦＡＲ１９蛋白免疫的小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞ＳＰ２／０进行细胞融合,经克隆筛选获得鼠抗人ＴＦＡＲ１９蛋白单抗的杂交瘤细胞株,以间接ＥＬＩＳＡ、Ｗｅｓｔｅｒｎ免疫印迹分析等方法进行单克隆抗体的鉴定。结果：获得了３株稳定分泌抗人ＴＦＡＲ１９单克隆抗体的杂交瘤细胞株（Ｃ１,Ｃ１０,２Ｃ１２）,其分泌的单抗效价高,特异性好,亲和力不一,免疫球蛋白亚类均为ＩｇＧ１。Ｗｅｓｔｅｒｎ免疫印迹分析证明ＴＦＡＲ１９蛋白在调亡细胞中高表达。结论：所获单抗能特异识别原核及真核细胞表达的ＴＦＡＲ１９蛋白,为进一步探讨ＴＦＡＲ１９蛋白的生物学效应提供了条件。     

血管生成素样蛋白2单克隆抗体的制备和分析

目的：研制抗人血管生成素样蛋白2（ANGPTL2）单克隆抗体,为进一步进行ANGPTL2的表达分析和功能研究,揭示其在糖尿病肾病发生发展过程中的可能作用创造条件.方法：以纯化的ANGPTL2重组蛋白皮下多点注射免疫BALB/c小鼠,分离脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合,经HAT选择性培养基筛选,克隆和亚克隆化培养,ELISA鉴定,得到能稳定分泌抗人ANGPTL2的杂交瘤细胞;以硫酸铵沉淀法从杂交瘤细胞培养上清中初步纯化、制备抗人ANGPTL2单抗,以Western blot、细胞免疫染色和免疫组化染色相结合的方法对制备的单抗进行滴度和特异性鉴定.结果：得到1株能稳定分泌抗ANGPTL2的杂交瘤细胞,从其培养上清中制备的抗ANGPTL2单克隆抗体具有较好的特异性和较高的滴度,可用于Western blot、细胞免疫染色和免疫组化染色.结论：成功地研制了抗ANGPTL2单克隆抗体,为进一步进行ANGPTL2的表达分析和功能研究,揭示ANGPTL2的功能及其在糖尿病肾病发生发展过程中的可能作用创造了条件.     

抗华支睾吸虫单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立及其初步应用

本文用华支睾吸虫成虫可溶性抗原免疫的BALB/c小鼠与SP_2/o骨髓瘤细胞融合,经筛选和克隆化后获得4株抗华支睾吸虫单克隆抗体杂交瘤细胞。该4株荜克隆抗体与华支睾吸虫成虫抗原作ELISA,结果均为阳性。经交叉试验(ELISA法)证明与日本血吸虫成虫抗原,虫卵抗原和卫氏并殖吸虫成虫抗原均呈阴性反应。4株单克隆抗体免疫球蛋白亚类鉴定除3F_7株为IgG_1外,其余3株均属IgM。初步试用3F_7株单克隆抗体作ELISA双抗体法检测人体华支睾吸虫循环抗原。     

日本血吸虫重组蛋白SjGST的表达纯化及单克隆抗体的制备和特性鉴定

目的：获取高纯度的日本血吸虫重组GST蛋白（rSjGST）,并制备单克隆抗体。方法：纯化rSjGST后,以其作为抗原,免疫Balb/c雌鼠,并用杂交瘤技术制备抗rSjGST的单克隆抗体,以ELISA方法测定抗体的效价,以蛋白质免疫印迹法测定抗体的特异性。结果：纯化出大量的高纯度rSjGST,并且筛选出能够稳定分泌抗rSjGST单抗的杂交瘤细胞株3C12。用试剂盒检测出单抗的亚型为IgG1。结论：依靠大肠埃希菌表达系统,高效表达出rSjGST,成功制备单克隆抗体,为血吸虫病免疫诊断提供了研究基础。     

抗CLCN5单克隆抗体的制备及鉴定

目的：制备抗氯离子通道蛋白5（CLCN5）单克隆抗体（mAb）并对其进行鉴定。方法：用人CLCN5为抗原免疫BLAB／c小鼠，用常规方法进行细胞融合，经筛选及克隆化建立可稳定分泌抗CLCN5 mAb的杂交瘤细胞株；用ELISA及Western blot进行抗体的鉴定。结果：筛选到4株可稳定分泌抗CLCN5 mAb的细胞株；Western blot显示，在4株抗体中有1株在相对分子量为83kDa处出现1条特异性条带．说明该单克隆抗体可与HSG胞浆蛋白中的CLCN5蛋白特异性地结合。结论：本实验成功获得1株可特异性识别CLCN5的单克隆抗体细胞株，可用于肾结石、X-连锁综合征的进一步研究、临床诊断及相关试剂盒等的开发研制。     

抗重组人乳腺珠蛋白单克隆抗体的制备及其特异性鉴定

目的通过杂交瘤技术获得特异性抗hMAM单克隆抗体,为进一步研制基于hMAM的乳腺癌早期诊断试剂盒奠定基础。方法以纯化的重组蛋白为抗原免疫Balb/c小鼠,运用杂交瘤技术制备、间接ELISA法及免疫组化法筛选出能稳定分泌特异性抗hMAM的单克隆抗体细胞株。结果通过杂交瘤技术获得了2株能分泌特异性抗hMAM单克隆抗体的杂交瘤细胞株hMAM-A2及hMAM-B7,其分泌的单克隆抗体亚类均属于IgG1,Western blotting结果显示2株细胞分泌的单克隆抗体特异性强能与34kDa处的hMAM抗原形成单一的蛋白质显色条带,免疫组化结果显示其仅与乳腺癌组织呈阳性反应,与其他肿瘤组织不发生交叉反应。结论利用鼠-鼠杂交瘤技术成功的制备了2株稳定分泌高效价、高特异性抗hMAM的杂交瘤细胞株。     

抗人胰岛素样生长因子-1单克隆抗体的制备与鉴定

目的:制备稳定分泌抗人胰岛素样生长因子-1(hIGF-1)单克隆抗体(mAb)的杂交瘤细胞系,并对其分泌的mAb进行鉴定.方法:用纯化后的hIGF-1重组蛋白免疫Balb/c小鼠,利用杂交瘤细胞融合技术制备抗hIGF-1的mAb,用Western blot法鉴定mAb的特异性,用间接ELISA法检测mAb腹水效价及mAb的亲和力,杂交瘤细胞染色体分析,鉴定Ig亚类.结果:获得2株能稳定分泌抗hIGF-1的mAb杂交瘤细胞系,Western blot分析显示,该mAb能与具有生物学活性的成熟IGF-1蛋白结合.腹水mAb效价可达6×104.mAb相对亲和力为2.1×109/mol～7.8×109/mol.2株单抗属IgM亚类.染色体分析符合杂交瘤细胞特征.结论:成功制备出抗hIGF-1的2株mAb杂交瘤细胞,为进一步用于hIGF-1的临床检测和实验研究创造了条件.     

特异性SARS-CoV N蛋白单克隆抗体的制备及抗原表位初步分析

目的：用分段表达纯化的SARS冠状病毒（SARS-CoV）的核衣壳蛋白（nucleocapsid N蛋白）制备针对该蛋白不同区域抗原表位的高特异性单克隆抗体（McAb）,初步定位单克隆抗体识别表位所在区域。方法：用分段表达纯化的SARS～CoV的N蛋白（分别记为N1蛋白、N2蛋白）分别免疫Balb／c小鼠制备McAb,通过检测其亚类、效价及相对亲和力鉴定McAb的生物学特性,以Western blot鉴定单克隆抗体特异性,并对McAb结合表位进行初步分析。结果：筛选出7株抗SARS-CoV N1蛋白及2株抗SARS-CovN2蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株,IgG亚类鉴定6株为IgG1,2株为IgG2b,1株为IgG3,腹水效价10^5以上;亲和常数达10^8以上。Western blot证实所获的单克隆抗体可与SARS-CoVN蛋白发生特异性反应。ELISA相加实验结果显示2株N1 McAb识别相同的抗原表位,其余均识别不同的抗原表位。结论：通过分段表达纯化的SARS-CoVN蛋白而制备的特异性针对SARS-CoV N蛋白不同区域抗原表位的单克隆抗体中,N1单抗识别N蛋白N端（1-549bp）,N2单抗识别N蛋白C端（496～1269bp）,可初步定位单克隆抗体识别表位所在区域。     

人巨细胞病毒单克隆抗体的制备及其体外中和活性鉴定

目的制备具有中和人巨细胞病毒(HCMV)感染作用的单克隆抗体并对其进行生物学活性鉴定.方法用HCMV抗原免疫Balb/c小鼠5、6次后,取致敏的脾脏B淋巴细胞和HGPRT-SP2/0小鼠骨髓瘤细胞进行融合,在HAT选择培养基中培养2周,间接ELISA法筛选克隆.挑取分泌抗体的杂交瘤株,再用间接ELISA进行鉴定,最终获得抗HCMV的阳性杂交瘤细胞株,用Ouchterlony法鉴定McAb的亚类.小鼠腹腔内接种杂交瘤细胞,取腹水经盐析法提纯IgG.Lowry法测定蛋白质浓度,在第6代HF细胞株及原代培养新生乳鼠脑神经细胞上进行微量中和实验.结果获得了4株杂交瘤细胞株,制备的F9McAbs盐析后蛋白质浓度为11.2 g/L,血清学试验证明该McAbs能和HCMV抗原进行特异性结合,制备的IgG具有高度特异性.且体外实验已证实,该McAb具有中和抗体的性质.结论通过杂交瘤技术制备的HCMV单克隆抗体能在体外中和HCMV致病变效应,为该McAb作为抗人巨细胞病毒治疗药物的研发奠定了基础.