心肌细胞培养上清诱导骨髓间充质干细胞的分化

背景：前期研究发现,心肌细胞培养上清具有诱导骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞的能力,这可能与培养上清内的某种细胞因子或几种细胞因子有关。 目的：分析大鼠心肌细胞培养上清诱导骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞是否与心肌细胞培养上清内细胞因子含量不同有关。 方法：采用全骨髓贴壁培养法分离骨髓间充质干细胞并在体外培养纯化,酶消化法分离心肌细胞,分别以 1×10⁸ L^-1的细胞浓度培养72 h后收集上清。用酶联免疫吸附试验技术检测心肌细胞和骨髓间充质干细胞培养上清内的肝细胞生长因子、胰岛素样生长因子1、血小板源生长因子、干细胞因子、成纤维细胞生长因子和血管内皮生长因子的水平。 结果与结论：心肌细胞培养上清组内的胰岛素样生长因子1、血小板源生长因子和成纤维细胞生长因子水平明显高于骨髓间充质干细胞培养上清组(P < 0.01),提示心肌细胞培养上清内的胰岛素样生长因子1、血小板源生长因子和成纤维细胞生长因子可能与诱导骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞有关,其中主要的细胞因子是胰岛素样生长因子1。     

胎肝滤液诱导骨髓间充质干细胞向肝细胞分化

目的 探讨胚胎肝组织滤液定向诱导大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)分化为肝细胞的诱导条件,为肝组织工程提供新的种子细胞来源。 方法 在体外培养体系中加入胎肝滤液,模拟体内肝脏微环境,诱导BMSCs向肝细胞定向分化,以免疫细胞化学检测肝细胞标志物;PAS检测糖原表达;靛青绿染色检测转化细胞的分化程度;测定细胞培养上清液中丙氨酸氨基转移酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)的含量以检测其功能状态。 结果 BMSCs经胎肝滤液诱导14d时细胞呈现多角形、卵圆形或圆形细胞的特征性改变;甲胎蛋白(AFP)和白蛋白(ALB)免疫反应、PAS反应和吲哚靛青绿(ICG)摄入实验及上清液中ALT、AST、ALP等酶均在诱导的第7天开始出现,AFP和ALB免疫反应在21d时达高峰;PAS反应和ICG摄入实验随着时间的延长而增强;上清液中的各个酶在14d达高峰,之后呈下降趋势。 结论 胎肝滤液可诱导BMSCs形成具有肝细胞形态和功能特点的细胞。     

兔骨髓间充质干细胞培养及向成软骨细胞的诱导分化

背景：骨髓间充质干细胞没有理想的特异性表面标志物,对其鉴定尚无统一标准,大多数鉴定依赖于其形态水平、功能特征及培养过程中出现的分化表型来协助鉴定。 目的：体外培养扩增、鉴定兔骨髓间充质干细胞,观察其诱导分化为成软骨细胞的可行性。 方法：密度梯度离心法提取兔骨髓间充质干细胞,采用倒置显微镜进行形态学观察;用含体积分数为10%胎牛血清的α-MEM培养液培养细胞,每日定时进行细胞计数,观察细胞生长速度;采用流式细胞学方法分别检测原代及第3代细胞CD44、CD45、CD29的表达情况;取第3代生长良好的兔骨髓间充质干细胞,以特定培养液诱导(含体积分数为10%胎牛血清、转化生长因子1 10 μg/L、胰岛素样生长因子Ⅰ110 μg/L、转铁蛋白6.25 mg/L、地塞米松10 mmol/L、维生素C 0.05 mmol/L),倒置显微镜下观察形态变化,免疫组织化学检测软骨特异性Ⅱ型胶原的表达。 结果与结论：培养的细胞长梭形,呈成纤维细胞样生长,传代细胞生长迅速。流式结果表明,原代细胞有62.4%的细胞表达CD29,有60.3%的细胞表达CD44,有2.79%的细胞表达CD45,第3代有99.9%的细胞表达CD29,有99.6%的细胞表达CD44,有2.62%的细胞表达CD45。骨髓间充质干细胞诱导后体外扩增能力明显降低,诱导21 d后形态变化比较显著,Ⅱ型胶原阳性细胞较多。结果显示应用密度梯度离心法可成功分离并扩增骨髓间充质干细胞,第3代细胞纯度较高,在适当的条件下,具有分化为成软骨细胞的潜能。     

HuR诱导骨髓间充质干细胞成软骨分化的作用探析

目的　观察HuR对骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cell, BMSC）成软骨分化的影响,并初步探讨其作用机制。 方法　选取4周龄 SD大鼠提取骨髓,制备BMSC,取第3代BMSC,分为HuR组和NC组,分别用pAdEasy-HuR-GFP病毒液（HuR组）和pAdEasy-GFP病毒液（NC组）干预,诱导14 d后进行固定、石蜡包埋、切片。行甲苯胺蓝进行染色,免疫组化、qPCR和检测XIAP、HuR、Col2a1的表达差异。 结果　甲苯胺蓝染色结果显示过表达HuR组的蛋白聚糖阳性信号比NC组多,且软骨球直径更大。免疫组化结果显示,XIAP、HuR、Col2a1随着含药血清浓度的提高逐渐上调,XIAP上调趋势比较明显,HuR和Col2a1上调不是很明显。qPCR检测到软骨HuR、XIAP明显升高,col2a1上调不明显。 结论 　过表达HuR有利于BMSC分化成软骨,其机制可能与HuR过表达后调控XIAP转录增加有关。     

低氧促进hMSCs 向多巴胺能神经元分化

目的观察低氧对体外培养的人骨髓间充质干细胞(hMSCs)向多巴胺能神经元分化的影响。方法采用细胞免疫化学法、流式细胞分析和高效液相色谱—电化学法,检测多巴胺能神经元的数量以及诱导分化后培养基中多巴胺的含量。结果低氧处理后,低氧分化组酪氨酸羟化酶(TH)阳性神经元数量明显增多,为常氧分化组的3倍(P<0.01),并且分化后的神经细胞合成的多巴胺(DA)及其代谢产物高香草酸(HVA)含量也高于常氧分化组(P<0.05)。结论低氧可促进hMSCs向多巴胺能神经元方向分化,这为hMSCs临床应用于治疗帕金森病提供了新的思路。     

Functional neuronal differentiation of bone marrow-derived mesenchymal stem cells

Recent results have shown the ability of bone marrow cells to migrate in the brain and to acquire neuronal or glial characteristics. In vitro, bone marrow-derived MSCs can be induced by chemical compounds to express markers of these lineages. In an effort to set up a mouse model of such differentiation, we addressed the neuronal potentiality of mouse MSCs (mMSCs) that we recently purified. These cells expressed nestin, a specific marker of neural progenitors. Under differentiating conditions, mMSCs display a distinct neuronal shape and express neuronal markers NF-L (neurofilament-light, or neurofilament 70 kDa) and class III beta-tubulin. Moreover, differentiated mMSCs acquire neuron-like functions characterized by a cytosolic calcium rise in response to various specific neuronal activators. Finally, we further demonstrated for the first time that clonal mMSCs and their progeny are competent to differentiate along the neuronal pathway, demonstrating that these bone marrow-derived stem cells share characteristics of widely multipotent stem cells unrestricted to mesenchymal differentiation pathways.     

小鼠骨髓多能成体祖细胞的分离、培养及体外诱导分化为胰岛素分泌细胞的研究

目的：探讨培养骨髓多能成体祖细胞的条件和生物学特性及其向胰岛素分泌细胞分化的可能性。 方法： 采用文献报道的条件培养液培养小鼠骨髓多能成体祖细胞，观察其细胞形态、生长情况、细胞表面标志及mRNA水平，检测其oct-4基因表达，并以含胰高糖素多肽-1的无血清培养液诱导分化细胞，基因水平检测与胰岛素分泌细胞有关的基因表达。 结果： 小鼠骨髓多能成体祖细胞类圆形，细胞核大，胞质少；细胞增殖能力尚可；细胞表面CD13+、CD44-、CD45-、MHCⅡ-；有oct-4基因表达；诱导分化后，可见与胰岛素分泌细胞有关的基因表达。 结论： 成功培养小鼠骨髓多能成体祖细胞，具有与文献报道类似的生物学特征；有被诱导分化为胰岛素分泌细胞的可能性。     

5-氮胞苷诱导骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化中的作用

BACKGROUND:Bone marrow mesenchymal stem cells can be differentiated into myocardial cells induced by 5-azacytidine in vitro, which provides an opportunity for cell transplantation in the treatment of heart disease. OBJECTIVE:To study the induction effects of 5-azacytidine at different concentrations on the myocardial differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells in rats. METHODS:Passage 3 bone marrow mesechymal stem cells were incubated with DMEM containing 0, 5, 10, 20 μmol/L 5-azacytidine for 24 hours, and then the induced medium was replaced by DMEM containing 5% fetal bovine serum for subsequent 28-day culture. Afterwards, expression of cardiac troponin I was detected by immunocytochemical method. RESULTS AND CONCLUSION:Cell death occurred at 24 hours after 5-azacytidine induction, which was more obvious in the 20 μmol/L group than the 5 and 10 μmol/L groups. The positive expression of cardiac troponin I was significantly lower in the 5 μmol/L group than the 10 and 20 μmol/L groups (P < 0.05), but there was no significant difference between the 10 and 20 μmol/L groups (P > 0.05). These experimental findings indicate that 5-azacytidine can induce the differentiation of rat bone marrow mesenchymal stem cells into myocardial cells in vitro, and its optimal concentration is 10 μmol/L.     

二甲基亚砜诱导骨髓间充质干细胞向心肌细胞的分化

BACKGROUND: Numerous studies have demonstrated that bone marrow mesenchymal stem cells can be induced to differentiate into myocardial cells under certain conditions. Dimethyl sulfoxide is one of the commonly used inducers, and its mechanism is mainly by inhibiting the c-myc gene expression, thus reducing endogenous poly(adenosine diphosphate nucleotide) level.      

microRNA-1诱导大鼠骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化

目的研究microRNA-1(miRNA-1)能否诱导骨髓间充质干细胞(MSCs)向心肌样细胞分化。方法构建大鼠miRNA-1表达载体,分离扩增培养及鉴定大鼠MSCs。脂质体法转染大鼠第4代MSCs,实时定量RT-PCR(qRT-PCR)检测转染miRNA-1质粒后MSCs的miRNA-1表达水平。分别于转染2、4和6 d后用RT-PCR检测心肌重要转录因子GATA4、NKx2.5和MEF2C的mRNA表达,免疫荧光检测心肌特异蛋白I(cTnI)的表达。结果 90%以上的MSCs表达MSCs重要标志物CD29、CD44;未检测到造血前体细胞标志抗原CD34、白细胞标志抗原CD45的表达。转染miRNA-1质粒后,miRNA-1表达水平明显上调。转染miRNA-1质粒2、4和6 d后,GATA4、NKx2.5和MEF2C的mRNA表达逐渐增强。第4和6天后可见cTnI阳性表达细胞。结论 miRNA-1能诱导大鼠MSCs向心肌样细胞分化。     

全反式视黄酸诱导兔骨髓间充质干细胞向神经细胞的分化

背景：目前,在骨髓间充质干细胞体外向神经细胞分化的实验中,较多采用抗氧化剂法和细胞因子法,但诱导效率低。 目的：探讨全反式视黄酸在兔骨髓间充质干细胞向神经细胞分化中的作用。 方法：体外分离培养兔骨髓间充质干细胞,取第4代骨髓间充质干细胞观察细胞形态,实验组用0.4 μmol/L全反式视黄酸预诱导24 h后,改用神经细胞培养基继续培养。神经细胞培养基培养4,8,16及24 h,免疫组织化学检测巢蛋白、神经元特异性烯醇化酶和胶质纤维酸性蛋白的表达情况,采用RT-PCR的方法检测巢蛋白和神经元特异性烯醇化酶的表达水平。 结果与结论：骨髓间充质干细胞经培养、传代后,细胞贴壁生长,呈长梭形。免疫组织化学检测结果显示：全反式视黄酸诱导组巢蛋白及神经元特异性烯醇化酶呈阳性,诱导后细胞的活力良好。RT-PCR结果显示全反式视黄酸诱导组巢蛋白在诱导前后均有表达,神经元特异性烯醇化酶在诱导后16 h可见明显的扩增条带,24 h后更加明显。提示全反式视黄酸能够在体外促进兔骨髓间充质干细胞向神经细胞分化。     

骨髓间充质干细胞定向分化为软骨细胞

目的:体外定向诱导成人骨髓间充质干细胞(MSC)分化为单一的软骨细胞,探索体外成软骨的必要条件。方法: 采用淋巴细胞分离液密度梯度离心法分离骨髓,体外培养扩增,在较高的细胞密度下加入转化生长因子β1(TGF-β1),以微团培养(micromass culture)方式,诱导MSC分化为软骨细胞。HE染色观察细胞形态,阿新蓝、甲苯氨蓝染色检测软骨基质的分泌,免疫组织化学检测软骨特异性Ⅱ型胶原表达。结果: HE染色呈典型的细胞性软骨结构;阿新蓝染色阳性、甲苯氨蓝异染性;Ⅱ型胶原免疫组织化学检测阳性。结论: 成人骨髓MSC在体外分化为单一的软骨细胞需要高细胞密度、诱导因子TGF-β1及合适的培养条件。     

甲钴胺体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化

背景：目前骨髓间充质干细胞移植到脊髓损伤动物体内后对脊髓损伤的恢复效果非常有限。甲钴胺是治疗神经系统疾病及损伤的常见药物,其对骨髓间充质干细胞的影响尚不清楚。 目的：探讨甲钴胺体外定向诱导骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化的可行性,观察分化后的细胞增殖和生长情况。 方法：取大鼠胫腓骨骨髓,采用密度梯度离心贴壁细胞培养法分离、培养骨髓间充质干细胞,取第四五代骨髓间充质干细胞,分别以25,50,100 mg/L的甲钴胺进行诱导分化24,48和72 h。倒置相差显微镜下连续观察细胞形态学变化,MTT法检测细胞活性,RT-PCR和Western blot法检测特异性标志物Nestin和NSE的表达。 结果与结论：甲钴胺诱导骨髓间充质干细胞后大部分细胞变成神经元样细胞。与对照组比较,甲钴胺诱导后细胞活性无明显变化。不同剂量甲钴胺诱导48 h后,Nestin和NSE在mRNA和蛋白水平表达均上调,其中100 mg/L组表达上调最明显;100 mg/L 甲钴胺诱导24,48和72 h后,Nestin和NSE在mRNA和蛋白水平表达均上调,其中72 h表达上调最明显。说明甲钴胺可定向诱导骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化,100 mg/L为甲钴胺的较佳诱导浓度。     

二甲基亚砜体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞

目的 探索二甲基亚砜（DMSO）体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）向心肌样细胞分化的方法。方法 取SD大鼠四肢骨骨髓,分离培养MSCs,应用终浓度为1.0%的DMSO定向诱导,相差显微镜观察细胞形态学变化,应用免疫细胞化学、激光扫描共聚焦显微镜技术检测结蛋白（desmin）,α-横纹肌肌动蛋白（α-sarcomeric actin）、心肌特异性肌钙蛋白（C-TnT）的表达,透射电镜观察超微结构。结果 MSCs经体外诱导后分化的细胞均阳性表达desmin、α-sarcomeric actin、C-TnT。透射电镜下可见到平行排列的肌丝和丰富的粗面内质网。结论 大鼠骨髓间充质干细胞体外在DMSO诱导下可以定向分化为心肌样细胞。     

Allogeneic bone marrow-derived mesenchymal stromal cells promote the regeneration of injured skeletal muscle without differentiation into myofibers

Half-stratum laceration was performed on the tibialis anterior muscle of Sprague-Dawley (SD) rats as a skeletal muscle injury model. Bone marrow-derived mesenchymal stromal cells (BMMSCs), which were derived from enhanced green fluorescent protein (GFP) transgenic SD rats, were transplanted into the injured site. Tensile strength produced by nerve stimulation was measured for functional evaluation before sacrifice. Specimens of the tibialis anterior muscles were stained with hematoxylin and eosin, and immunohistochemically stained for histological evaluation. Our results showed that transplanted BMMSCs promoted maturation of myofibers histologically and made the injured muscle acquire almost normal muscle power functionally by 1 month after transplantation. However, the results of immunohistochemical staining could not prove that transplanted BMMSCs differentiated into or fused to skeletal myofibers, although it showed that transplanted BMMSCs seemed to differentiate into muscle precursor cells. Therefore, our results indicated that BMMSCs contributed to the regeneration of skeletal muscle by mechanisms other than fusion to myofibers after differentiation.     

BMP12诱导恒河猴骨髓间充质干细胞定向分化为腱细胞

目的：研究骨髓间充质干细胞定向分化为腱细胞的可能性。方法：通过电穿孔法将外源基因BMF12导入骨髓间充质干细胞中，诱导骨髓间充质干细胞定向分化为腱细胞；在形态学和分子生物学水平上对诱导后的细胞加以鉴定。结果：光镜下，诱导后的细胞形态发生明显改变；RT-PCR结果表明，诱导后的细胞有BMP12和Collagen Ⅰ的mRNA的表达，而没有Collagen Ⅲ的mRNA表达；诱导后细胞呈CD44^ 为98．39％，HLA-DR^-。结论：BMF12能够诱导骨髓间充质干细胞定向分化为腱细胞，间充质干细胞有可能成为肌腱组织工程种子细胞来源之一。     

人骨髓间充质干细胞体外分离培养及向血管内皮样细胞分化的研究

目的:研究人骨髓间充质干细胞(hMSCs)的体外分离培养方法及在特定微环境下分化为血管内皮样细胞的潜能,可能为银屑病研究提供实验基础.方法:密度梯度离心法结合贴壁法分离人骨髓间充质干细胞(hMSCs),体外扩增培养并进行鉴定.加入血管内皮细胞生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)定向诱导hMSCs向血管内皮细胞分化,流式细胞仪进行细胞表型鉴定,Dil-ac-LDL摄取实验鉴定血管内皮细胞功能.结果:经流式细胞仪测定分离培养的hMSCs CD71、CD44阳性表达,CD54、CDl06、CD45弱阳性表达,CD34、CD31、VWF、KDR、HLA-DR阴性表达;经bFGF、VEGF诱导后的hMSCs可见类似内皮细胞样改变,经流式细胞术检测,与对照组相比内皮细胞特异表面标志CD34、CD31、VWF、KDR表达转为阳性(P＜0.01),而HLA-DR、CD54、CDl06、CD45表达明显上调(P＜0.01);诱导分化后的内皮样细胞具有摄取Dil-ac-LDL的能力.结论:密度梯度离心法结合贴壁法可获得较纯的MSCs;在bFGF、VEGF诱导作用下,hMSCs具有向内皮细胞分化潜能,产生功能性内皮细胞.     

白细胞介素6体外诱导骨髓间充质干细胞向肝细胞的分化

背景：骨髓间充质干细胞是肝细胞的重要肝外来源,在多种细胞因子和生长因子诱导下可分化为肝细胞,从而参与肝功能的修复和重建。 目的：观察白细胞介素6是否可诱导骨髓间充质干细胞向肝细胞定向分化。 方法：采用贴壁法分离培养昆明种雄性小鼠骨髓间充质干细胞,在无血清肝细胞培养液HEPATOZYME-SFM中分别加入2.5,5,10,20 µg/L白细胞介素6诱导其向肝样细胞分化;诱导培养0,7,14,21,28 d时取出细胞爬片,细胞免疫组织化学法检测细胞角蛋白18、甲胎蛋白表达情况,过碘酸-Schiff糖原染色检测细胞功能,ELISA和硝酸还原酶法分别检测培养液中白蛋白和一氧化氮水平。 结果与结论：当白细胞介素6质量浓度在2.5~10 µg/L范围内,呈浓度依赖性和时间依赖性增加细胞角蛋白18、糖原表达率及细胞培养液中白蛋白水平;甲胎蛋白表达为先升后降直至21d停止。当白细胞介素6质量浓度增加到20 µg/L时上述诱导作用均不及质量浓度10 µg/L组。只有10 µg/L白细胞介素6组诱导到28 d时细胞培养液中测得微量一氧化氮;提示白细胞介素6可诱导骨髓间充质干细胞向肝系细胞分化,且在10 µg/L作用最强,质量浓度再增高时诱导作用反而减弱。