α-突触核蛋白过表达对黑质多巴胺能神经元酪氨酸羟化酶表达的影响

目的 研究α-突触核蛋白(α-synuclein，α-SYN)过表达对多巴胺能神经元酪氨酸羟化酶(TH)表达的影响。方法 在α—SYN基因转染的MES 23．5大鼠黑质多巴胺能神经元细胞系，分别用免疫组织化学、免疫荧光、Western blot等方法分析α-SYN和TH的表达以及两者之间的关系。通过绘制生长曲线和MTT测试细胞氧化还原活性，观察α—SYN基因转染细胞的生长和损伤情况。结果 α-SYN过表达明显抑制MES 23．5多巴胺能神经元的TH表达，但对该细胞的生长和增殖无明显影响，也不引起该细胞损伤。结论 α-SYN过表达对多巴胺能神经元的TH表达具有抑制作用。     

氯胺酮对帕金森病小鼠模型α-突触核蛋白表达的影响

目的:观察氯胺酮(ketamine,Ket)对1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine,MPTP)诱导的帕金森病(Parkinson's disease,PD)小鼠模型黑质-纹状体区α-突触核蛋白(α-synuclein,α-Syn)异常表达的影响。方法:选取48只健康雄性小鼠随机分为3组:对照组(NaCl组)、模型组(MPTP组)和治疗组(MPTP+Ket组)。采用rotarod实验和gait analysis system评价3组小鼠行为学差异;免疫组化染色观察黑质区酪氨酸羟化酶阳性神经元数目变化;免疫荧光染色和Western blot检测小鼠脑黑质-纹状体区α-Syn的表达。结果:(1)Rotarod实验及gait analysis system结果显示,MPTP组较NaCl组转棒仪圈数减少,步距减小(P0.05),MPTP+Ket组较MPTP组转棒仪圈数增加,步距增宽(P0.05);(2)免疫组化及免疫荧光实验结果表明,MPTP组较NaCl组多巴胺能神经元数目减少,黑质-纹状体区荧光强度增加(P0.05),MPTP+Ket组较MPTP组多巴胺能神经元数目增多,荧光强度减少(P0.05);(3)Western blot实验结果显示,MPTP组较NaCl组黑质-纹状体区的α-Syn表达增多(P0.05),而MPTP+Ket组较MPTP组的α-Syn表达量减少(P0.05)。结论:氯胺酮对PD小鼠黑质-纹状体区α-Syn异常表达具有抑制作用。     

α-突触核蛋白调控大鼠线粒体复合体Ⅰ活性

目的 研究α-突触核蛋白(α-SYN)在大鼠不同脑区线粒体的表达及对线粒体呼吸链复合体Ⅰ活性的影响.方法 用免疫印迹方法检测不同脑区线粒体中α-SYN表达量的变化并测定α-SYN向分离线粒体的转运;通过观察340 nm处NADH吸收值的变化测定线粒体呼吸链复合体Ⅰ的活性.结果 线粒体α-SYN在不同脑区的表达量不同.人重组α-SYN与分离线粒体进行孵育后,以剂量依赖的方式转运到线粒体内.将不同浓度人重组α-SYN与线粒体孵育后,线粒体复合体Ⅰ活性下降,并且呈明显的量-效关系.结论 线粒体α-SYN在不同脑区的表达量不同.线粒体的α-SYN有可能来源于胞质α-SYN向线粒体的转运,并调节复合体Ⅰ的活性.     

α-突触核蛋白调控大鼠线粒体复合体I活性

目的研究α-突触核蛋白（α-SYN）在大鼠不同脑区线粒体的表达及对线粒体呼吸链复合体I活性的影响。方法用免疫印迹方法检测不同脑区线粒体中α—SYN表达量的变化并测定α-SYN向分离线粒体的转运；通过观察340nm处NADH吸收值的变化测定线粒体呼吸链复合体I的活性。结果线粒体α-SYN在不同脑区的表达量不同。人重组α-SYN与分离线粒体进行孵育后，以剂量依赖的方式转运到线粒体内。将不同浓度人重组α-SYN与线粒体孵育后，线粒体复合体I活性下降，并且呈明显的量．效关系。结论线粒体α-SYN在不同脑区的表达量不同。线粒体的α—SYN有可能来源于胞质α-SYN向线粒体的转运，并调节复合体I的活性。     

影响人α-突触核蛋白基因在原核细胞中表达因素的研究

目的　研究影响人α 突触核蛋白 (α synuclein)基因在原核细胞中表达的常见因素 ,以提高其在原核细胞中的表达量。　方法　将重组质粒ProEXNACP转化进入到DH5α 大肠杆菌体内 ,观察诱导剂IPTG浓度、诱导时间、诱导温度、诱导培养基、诱导初始菌浓度及诱导中pH值变化等因素对蛋白表达产量的影响 ,用SDS PAGE梯度胶电泳分析 ,考马斯亮蓝染色进行比较研究 ,同时检测pH值 ,观察其变化。　结果　诱导剂IPTG浓度对诱导蛋白产生的影响不大 ,诱导过程中pH值变化较小 ,而诱导时间、温度、初始菌浓度和培养基的种类对诱导产生α 突触核蛋白有较大影响。其中 ,以LB培养基 ,37℃ ,180r min诱导 1～ 2h产生α 突触核蛋白的量最大。　结论　诱导剂IPTG诱导ProEXNACP/DH5α大肠杆菌产生α 突触核蛋白的量与诱导时间、温度、初始菌浓度和培养基的种类有明显的关系。初始菌A590 =0 5～ 0 8,LB培养基 ,37℃ ,大通氧量 (180r min以上 ) ,1～ 2h诱导可作为大量提取、纯化α 突触核蛋白的首选条件。     

α-突触核蛋白在帕金森病患者血清中的磷酸化修饰

背景：α-突触核蛋白翻译后修饰后形成的聚集体是帕金森病主要的病理学改变。α-突触核蛋白可通过血脑屏障由中枢进入外周血分布至机体各部,这成为帕金森病病理播散的重要途径。因此研究血液中的α-突触核蛋白变化对揭示帕金森病的机制以及早期诊断尤为重要。目的：拟分析α-突触核蛋白在帕金森病患者血清中的磷酸化修饰位点及生成聚集体间的结构稳定性的差异。方法：构建重组人α-突触核蛋白原核表达系统,亲和层析法纯化蛋白,采用SDS-PAGE电泳和Western blot方法检测α-突触核蛋白单体纯度和特异性。收集北华大学附属医院神经内科住院的26例帕金森病患者血清和26例正常人血清,完成各组血清中α-突触核蛋白聚集体的制备;采用质谱SWATH方法检测帕金森病患者血清中α-突触核蛋白发生磷酸化修饰的修饰位点,并对不同位点的蛋白聚集体进行定量分析。将不同磷酸化修饰的蛋白聚集体免疫亲和层析法纯化后,Western blot方法检测帕金森病患者血清中各磷酸化修饰后聚集体的稳定性。结果与结论：(1)实验通过SDS电泳和Western blot方法检测显示得到纯度较高、特异性较高的α-突触核蛋白单体。(2)质谱SWAT...     

小泛素样修饰蛋白-1对α-突触核蛋白基因突变或过表达诱导的细胞包涵体形成及细胞凋亡的影响

目的 探讨α-突触核蛋白(α-synuclein)的小泛素样修饰蛋白(small ubiquitin-like modifier,SUMO)-1对α-synuclein基因过表达或突变诱导的细胞包涵体形成及细胞凋亡的影响.方法 构建野生型(WT)、A53T突变型和缺失SUMO-1互作氨基酸的K96R突变型、K96R-A...     

小泛素样修饰蛋白-1对α-突触核蛋白基因突变或过表达诱导的细胞包涵体形成及细胞凋亡的影响

目的 探讨α-突触核蛋白(α-synuclein)的小泛素样修饰蛋白(small ubiquitin-like modifier,SUMO)-1对α-synuclein基因过表达或突变诱导的细胞包涵体形成及细胞凋亡的影响.方法 构建野生型(WT)、A53T突变型和缺失SUMO-1互作氨基酸的K96R突变型、K96R-A53T突变型α-synuclein真核表达质粒.应用脂质体介导转染方式将构建好的质粒转入HEK293细胞;48 h后Hoechst 33258染色,采用Axiovert200型倒置荧光显微镜观察对细胞的影响,应用四甲基偶氮唑盐检测细胞活力,Annexin V-PE流式细胞仪检测细胞凋亡.结果 将构建所得真核表达质粒经双酶切鉴定及DNA测序证实;将WT型、A53T型、K96R型、K96R-A53T型α-synuclein真核表达质粒转染HEK293细胞,48 h后伊红染色显示转染野生型α-synuclein- pEGFP组及A53T突变型组某些细胞胞浆内出现圆形的嗜酸性小体(类Lewy小体)形成,分别占细胞总数的9.4％和11.7％,转染K96R及K96R-A53T融合表达载体组细胞内嗜酸性小体形成比率为10.2％和9.8％,两两相比差异无统计学意义(P＞0.05).Hoechst染色结果显示,WT组、A53T组细胞核变大,出现着色不均,染色质聚集成斑点状,未见核浓缩或核碎裂.K96R组及K96R-A53T组胞核着色基本均匀.采用四甲基偶氮唑盐法结果显示转染空质粒组细胞活力为96.2％,转染WT组、A53T组细胞活力下降至53.4％及56.1％,转染K96R组及K96R-A53T组细胞活力为72.3％和69.8％;转染48 h后,WT组、A53T组细胞凋亡率分别为32.2％和34.1％,转染K96R组及K96R-A53T突变组细胞凋亡率下降为19.4％和20.3％,两两相比差异有统计学意义(P＜0.05).结论 SUMO-1对α-synuclein基因过度表达及α-synuclein基因致病突变A53T诱导的细胞包涵体的形成无明显影响;SUMO-1可加强α-synuclein基因过度表达及α-synuclein基因致病突变A53T诱导的细胞毒性及细胞凋亡,提示SUMO-1参与了细胞凋亡过程.     

人野生型和A53T突变型α-突触核蛋白慢病毒表达载体的构建及在PC12细胞中的转染

为构建长期稳定表达人野生型和A53T突变型α-突触核蛋白的PC12细胞株,我们首先制备了慢病毒表达载体,经测序鉴定正确后转染PC12细胞,然后通过细胞的免疫荧光染色检测α-synuclein-V5融合蛋白,PCR法扩增转基因PC12细胞的SNCA片段后进行测序检测突变基因,以及Western blot法检测PC12细胞α-synuclein的表达,从而鉴定转基因细胞能否稳定表达目的基因。结果显示:经测序,pLenti6/V5-SNCA-WT和pLenti6/V5-SNCA-A53T表达质粒构建成功;免疫荧光染色示基因转染后,超过95%的PC12细胞中有α-synuclein-V5融合蛋白表达;转基因细胞的SNCA片段测序结果显示,慢病毒表达载体成功整合入PC12细胞基因组;Western blot法检测结果示转基因PC12细胞能够过表达α-synuclein蛋白。以上结果表明我们已成功构建了人野生型和A53T突变型α-突触核蛋白慢病毒表达载体,并且成功建立了稳定的过表达人野生型和A53T突变型α-突触核蛋白的PC12细胞株,这为进一步研究α-突触核蛋白的生理功能及其在Parkinson病发病机制中的作用奠定了基础。     

α-共核蛋白基因启动子区微卫星多态与晚发散发性帕金森病的关联研究

目的　探讨α 共核蛋白基因启动子区微卫星多态与晚发散发性帕金森病 (Parkinson’sdis ease ,PD)发病风险间的关系。方法　采用扩增片段长度多态方法和微卫星荧光标记 半自动基因分型技术 ,对上海汉族 13 5例晚发性散发性PD患者和 170名正常人进行α 共核蛋白基因微卫星多态分析 ,并通过比值比 (oddsratios ,OR)与PD进行相关分析。结果　病例 对照组间各等位基因频率分布差异有显著性( χ2 =14 .73 ,df =7,P =0 .0 4)。PD组 2 69bp等位基因频率最高 ( 0 .3 89) ,对照组中 2 71bp等位基因频率最高 ( 0 .3 5 9)。≤ 2 67bp等位基因与PD呈正关联 (OR =5 .2 2 8,95 %CI :1.2 48～ 2 7.2 0 2 ,χ2 =6.416,P =0 .0 11) ,而 2 73bp等位基因与PD呈负关联 (OR =0 .63 8,95 %CI :0 .44 0～ 0 .92 6,χ2 =5 .64 4,P =0 .0 18) ;病例 对照组间各基因型的分布差异无显著性 ( χ2 =16.3 68,df =12 ,P =0 .175 )。但含有≤ 2 67bp等位基因的基因型可增加PD的发病风险 (OR =4.5 94,95 %CI :0 .94～ 2 2 .49,χ2 =4.2 2 4,P =0 .0 4)。PD组杂合度为 40 % ,对照组为 5 0 %。结论　α 共核蛋白基因启动子区的微卫星多态与晚发性散发性PD的发病风险有关。     

CYP17A1基因新突变致17α-羟化酶/17,20-裂解酶部分性缺陷症

目的研究1例17α-羟化酶/17,20-裂解酶部分性联合缺陷症患者CYP17A1基因突变特点,并结合患者的临床表现与基因突变类型初步探讨P450C17酶蛋白的结构与功能的关系。方法收集1例17α-羟化酶/17,20-裂解酶部分性联合缺陷症患者的临床资料及其亲属血标本,提取基因组DNA,设计7对引物扩增CYP17A1基因的8个外显子及外显子与内含子的连接区域,琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物,产物胶回收后直接做为DNA双链模板测序。DNA双链模板不一致的PCR产物经克隆后测序。测序结果在核苷酸序列数据库进行比较分析。结果患者CYP17A1基因突变检测结果为5994-5995delAT/7541C>T复合杂合子。这两种突变均未见报道。推测5994-5995delAT导致I259H,274X,突变形成的截短蛋白质缺少血红素结合区域,因此是没有功能的;而通过人类P450C17酶计算机模型分析显示7541C>T导致的A398V远离酶的活性中心,推测突变可能使酶的活性减弱,而不是完全地丧失。患者临床表现为有自发不规则月经及轻度高血压、低血钾,结合激素测定结果提示肾上腺和性腺保留部分功能。因而患者的基因型与其临床表型是一致的。结论应进行突变P450C17酶的功能学研究来进一步明确结构改变对功能的影响。