双亚型(H5/H7)流感病毒DNA疫苗的构建及其免疫原性检测

目的：构建双亚型（H5/H7）流感病毒DNA疫苗,并检测其免疫原性。方法： 构建共表达流感病毒H5亚型血凝素(HA)和H7亚型HA的DNA疫苗,采用间接免疫荧光法(IFA)检测目的蛋白在幼仓鼠肾细胞(BHK cell)中的表达。分为pVAX1-H5-H7、pVAX1-H5、pVAX1-H7和pVAX1空质粒对照组4组（每组15只）进行小鼠免疫实验,并应用ELISA法检测小鼠血清抗体,流式细胞术检测小鼠脾T淋巴细胞亚群数量。结果：所构建的双亚型（H5/H7）流感病毒DNA疫苗在BHK细胞中的表达产物可激发荧光抗体产生绿色免疫荧光,且对照pVAX1空载体转染BHK细胞无免疫荧光产生。使用双亚型（H5/H7）流感病毒DNA疫苗免疫小鼠后,小鼠产生了针对H5和H7抗原的血清特异性抗体,流式细胞术检测免疫组小鼠脾T淋巴细胞亚群CD4+和CD8+的数量显著高于对照组（P<0.05）。结论： 成功构建的双亚型（H5/H7）流感病毒 DNA疫苗可以诱导小鼠产生特异性的细胞免疫和体液免疫应答。     

BCG载体携带恶性疟MSP-1和MSP-2基因免疫小鼠实验研究

目的研究恶性疟原虫FCC-1／HN株裂殖子表面蛋白-1（MSP-1）和表面蛋白-2（MSP-2）与BCG多价疫苗在小鼠体内诱导的免疫应答的特性及抗感染的保护性免疫机制。方法将重组pBCG／MSP-1和pBCG／MSP-1—2多价疫苗经皮下注射BALB／c小鼠，经多价疫苗免疫8周后，用流式细胞仪分析脾脏T淋巴细胞的分化，并体外培养脾细胞，用夹心ELISA法测定IFN-γ和IL-2的产生；用血清学方法测定免疫鼠IgG抗体的动态变化，体外测定了抗体介导的抑制实验。结果与对照组相比，疫苗组CD^4＋和CD^8＋T淋巴细胞有显著性增高，体外培养的牌细胞IFN-γ有一个高浓度的分泌。同时，免疫鼠血清对疟原虫抗原都表现了一个较高水平的IgG类抗体反应，抗体对原虫的增殖产生明显抑制。结论恶性疟原虫FCC-1／HN pBCG／MSP-1和pBCG／MSP-2价疫苗诱导了一个以细胞免疫为主的免疫应答类型。     

SARS冠状病毒S蛋白多价核酸疫苗的构建和免疫学原性

目的构建以SARS冠状病毒（severe acutere spiratory syndrome coronavlrus,SARs．c0V）S蛋白3个保守片段基因的组合为抗原基因DNA疫苗,采用肌肉注射的方法接种小鼠后观察机体产生免疫应答的情况。方法将人工合成的S蛋白3个保守片段基因组合（称为Sa）克隆至真核表达载体pcDNA3、1（-）,随之将重组质粒进行小鼠肌肉免疫,定期检测血清中抗SARS—CoV的病毒特异性抗体水平,流式细胞仪观察其淋巴细胞表型变化,PCR法检测质粒分布,免疫组化检测抗原表达。结果疫苗注射后15d就能在血清中检测出病毒特异性抗体,并且疫苗能在机体中持续表达抗原引发机体持续的免疫应答,直到注射后45d免疫应答都不见减弱;以CTLT淋巴细胞为主的CD8＋T淋巴细胞的百分比含量增加极显著,引起强大的体液免疫和细胞免疫;而空载体质粒对照组未检测出明显的特异性免疫应答。结论以S蛋白3个保守片段基因组合为抗原基因的DNA疫苗通过肌注能诱导小鼠针对SARS病毒强大的免疫应答。     

肺炎链球菌CbpA基因疫苗的构建及免疫学特性

目的：构建含有肺炎链球菌（SPN）毒力因子CbpA抗原编码基因的重组质粒pcDNA3.1/CbpA,测定其诱导特异性免疫应答的能力并评价其保护效果.方法：PCR扩增SPN CbpA编码基因,将该编码基因克隆到pcDNA3.1（＋）真核表达载体中,构建pcDNA3.1/CbpA重组质粒,经测序鉴定后转染COS-7细胞,WesternBlot鉴定目的蛋白的表达,重组质粒免疫BALB/c小鼠,TIGR4型SPN攻击后,监测其生存时间.结果：CbpA能在COS-7细胞中表达;pcDNA3.1/CbpA重组质粒主动免疫BALB/C小鼠后,体内产生特异性IgG抗体,并诱导小鼠对SPN感染产生有效的保护.结论：成功构建了重组真核表达质粒pcDNA3.1/CbpA,可为SPN基因疫苗的研制提供依据.     

严重急性呼吸综合征冠状病毒2 DNA疫苗与重组亚单位疫苗在小鼠中诱导中和抗体的效力分析

目的 探讨以严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）受体结合区（RBD）和表面刺突蛋白（S蛋白）S1亚基为疫苗靶抗原诱导中和抗体的效果。方法 构建SARS-CoV-2 RBD与小鼠IgG1 Fc段（mFc）融合蛋白表达质粒pVRC-RBD-mFc,转染人胚肾细胞293T并进行培养。用蛋白质印迹法检测细胞培养上清中的RBD-mFc融合蛋白,用微量中和实验检测细胞培养上清中的RBD-mFc及CHO细胞重组表达的SARS-CoV-2 S1与人IgG1 Fc段（S1-hFc）融合蛋白对SARS-CoV-2感染的抑制作用。分别用质粒pVRC-RBD-mFc及S1-hFc融合蛋白通过肌内注射接种BALB/c小鼠,用ELISA检测小鼠血清中的抗-S1 IgG,用微量中和实验检测小鼠血清的病毒中和活性。结果 pVRC-RBD-mFc质粒转染293T细胞的培养上清中可检测到RBD-mFc融合蛋白,超滤浓缩的细胞培养上清及S1-hFc融合蛋白均呈浓度依赖性抑制SARS-CoV-2对Vero E6细胞的感染;经pVRC-RBD-mFc质粒及S1-hFc融合蛋白免疫的小鼠血清中均可检测出抗-S1 IgG,且能中和SARS-CoV-2的感染;S1-hFc融合蛋白免疫小鼠血清的抗体滴度及病毒中和活性均高于质粒pVRC-RBD-mFc免疫小鼠血清（P均<0.01）。结论 SARS-CoV-2 RBD和S1蛋白均可能作为有效的疫苗抗原,重组亚单位疫苗较DNA疫苗能更有效地诱导中和抗体。     

结核病DNA疫苗pVAX1/ESAT-6的构建、鉴定及免疫效应评价

目的构建结核病DNA疫苗pVAX1/ESAT-6并探讨其诱导的免疫效应。方法将扩增自结核杆菌基因组的ESAT-6基因装入pVAX1载体构建pVAX1/ESAT-6重组质粒;经酶切、测序鉴定后,利用阳离子聚合物介导将重组质粒pVAX1/ESAT-6转染Hela细胞,分别以RT-PCR法检测ESAT-6 mRNA的表达、间接免疫荧光法检测ESAT-6蛋白表达。重组质粒经体内电转染免疫小鼠后,采用ELISA法测定小鼠血清中IFN-γ及抗ESAT-6特异性抗体IgG的水平;流式细胞术检测小鼠淋巴细胞增殖水平;ELISPOT检测产生IFN-γ的淋巴细胞频数。结果构建的重组质粒pVAX1/ESAT-6经双酶切于3000 bp和300 bp处各见1条带,测序结果显示插入序列与ESAT-6基因序列无差异。重组质粒转染Hela细胞后,RT-PCR产物经琼脂糖凝胶电泳于约300 bp处见目的条带,间接免疫荧光检测显示特异性绿色荧光。重组质粒免疫小鼠后,血清中抗ESAT-6特异性抗体IgG水平较对照组(空质粒组和生理盐水对照组)明显升高;血清中IFN-γ水平、小鼠脾淋巴细胞增殖水平及产生IFN-γ的淋巴细胞数明显均高于对照组(空质粒组和生理盐水对照组)。结论成功构建了结核病DNA疫苗pVAX1/ESAT-6,该疫苗可有效诱导小鼠产生特异性细胞免疫和体液免疫效应。     

SARS病毒N蛋白真核表达质粒构建及诱导的体液免疫

目的构建SARS病毒核衣壳蛋白（N）的真核表达质粒，并研究其在小鼠体内诱导的体液免疫应答。方法采用PCR方法体外扩增SARS病毒N蛋白基因片段，定向克隆入真核表达栽体pVAC，构建pVAC-N重组质粒；大量制备该重组质粒，经基因枪腹部皮内注射免疫BALB／c小鼠三次，间接ELISA法测定免疫鼠IgG抗体效价。结果成功构建了重组表达质粒pVAC-N，免疫小鼠后可诱导产生出特异性的IgG抗体。结论构建的真核表达质粒pVAC-N能诱导小鼠产生特异性抗体，为SARS疫苗的进一步研究打下基础。     

犬传染性肝炎病毒Hexon蛋白Loop1、Loop2基因的克隆与表达

腺病毒主要的中和抗原表位位于六邻体蛋白Loop1、Loop2上，目前的研究主要集中在人腺病毒，犬传染性肝炎病毒（即犬腺病毒Ⅰ型）尚未见报道。本次研究参考Genebank发表的基因序列设计引物，提取ICHV基因组DNA，分别PCR扩增六邻体蛋白（Hexon）的Loop1、Loop2基因片段，用T4酶连接在一起，克隆入原核表达载体pET28a中，测序显示本室保存病毒分离株Loop1与CLL株、RI261株和TorontoA26/61株核苷酸序列同源性分别为100%、100%和83.8%；Loop2与CLL株、RI261株和TorontoA26/61株核苷酸序列同源性分别为88.1%、88.1%和99.3%，推导的氨基酸序列同源性分别为93.6%、93.6%和98.6%。转化BL21工程菌，实现了重组Loop蛋白在大肠杆菌中的高效表达，分子质量约为36kDa，并且利用镍柱纯化重组蛋白，纯度达95%以上。用重组蛋白免疫BALB/c小鼠后，以间接ELISA法测定血清抗病毒抗体效价达1：320以上，western blot鉴定免疫血清与ICHV特异性结合。本实验为建立新的犬传染性肝炎病毒基因工程产品奠定了良好的基础。     

恶性疟原虫谷氨酸脱氢酶的表达及免疫活性鉴定

目的：在大肠杆菌中表达恶性疟原虫谷氨酸脱氢酶（GDH）与谷胱甘肽S-转移酶融合蛋白，测定重组蛋白的免疫活性。方法：采用PCR方法特异性扩增恶性疟原虫（海南株）GDH基因，双酶切后克隆入pGEX-4T-1载体中进行诱导表达，重组蛋白纯化后免疫小鼠制备特异性血清，并用琼脂双向扩散法检测效价，ELISA、Westernblotting检测重组抗原的免疫活性。结果：获到了重组表达的抗原蛋白，表达产物能与鼠抗恶性疟原虫血清发生特异反应，并能诱导小鼠产生特异性体液免疫应答，免疫琼脂扩散法检测抗体滴度为1：16。结论：恶性疟原虫GDH在大肠杆菌中获得高效表达且表达产物具有良好的抗原性。     

仙台病毒Tianjin株及其HN／F基因真核表达质粒对人副流感病毒I型的血清中和实验研究

目的：探讨仙台病毒Tianjin株（SeV）及其核酸制备预防人副流感病毒I型（hPIV—1）疫苗的可行性。方法：（1）用sev免疫小鼠3次后取血清,间接ELISA法检测免疫血清抗体效价。（2）将倍比稀释的免疫血清与100TCID~0．1ml的hPIV一1进行中和实验,观察细胞病变（CPE）并计算50％血清中和终点。（3）构建SeV真核表达质粒pVAX1-F、DVAX1-HN,分别单独或联合免疫小鼠,取免疫血清检测对hPIV一1的中和终点。结果：SeV免疫血清抗体的50％中和终点分别为39．8、12．6、16．0、44．7、25．1;质粒免疫血清抗体的中和作用按pVAX1-HN＋pVAX1-F组〉pVAX1-HN组〉DVAX1-F组依次递减。结论：仙台病毒Tianjin株及其HN基因、F基因真核表达质粒能诱导机体产生抗hPIV-1抗体,有可能成为制备预防hPIV-1疫苗的有效毒株。     

SAGl和R0P1混合基因真核表达质粒接种小鼠诱导产生拮抗致死性弓形虫感染的保护性免疫

目的 检测混合SAGl和ROP1编码基因真核表达质粒疫苗诱导小鼠的免疫应答，评价其抗弓形虫感染的保护性免疫效果。方法 将SAGl和ROP1编码基因片段克隆入pEGEP—N3表达载体，构建重组质粒；RT—PCR体外验证重组质粒在N1H3T3细胞中的表达；通过检测抗体、抗体分型及细胞因子来评价体液免疫和细胞免疫；流式细胞仪测定脾脏淋巴细胞亚群；腹腔内注射毒性株弓性虫速殖子攻击免疫小鼠。结果 RT-PCR结果显示重组质粒能在哺乳动物细胞内表达；SAGl和ROP1混合重组质粒疫苗诱导小鼠产生很强体液免疫和细胞免疫，对于毒性株弓形虫感染攻击具有免疫保护作用。结论 不同候选抗原编码基因混合重组质粒能够诱导小鼠产生抗弓形虫感染保护性免疫，提示含有多种成份的混合DNA疫苗的研制可作为核酸免疫研究的策略之一。     

DNA防龋疫苗诱导长期免疫反应及机制初探

目的：观察编码pac结构基因A-P片段的重组质粒pCIA-P以经肌肉和颌下腺周围区域皮下注射（TSG）两种途径免疫BALB/c小鼠后的特异性免疫反应,并观察表面蛋白抗原PAc在小鼠颌下腺中的表达。方法：将20只BALB/c小鼠随机分为4组,分别以重组质粒pCIA-P经肌肉、颌下腺区周围区域皮下注射两种途径免疫小鼠及pCI质粒和生理盐水肌肉免疫小鼠,ELISA法检测血清和唾液中特异性抗体水平动态变化。将pCIA-P经颌下腺区周围区域皮下注射以免疫组化技术观察表面蛋白抗原PAc的表达。结果：颌下腺区皮下注射法免疫后唾液IgA型特异性抗体和血清IgG型特异性抗体均明显升高,并持续24周以上。肌肉注射法后血清IgG型特异性抗体明显升高,但未有效诱导产生唾液IgA型特异性抗体。在小鼠颌下腺中检测到PAc蛋白的表达。结论：DNA防龋疫苗经颌下腺周围区域皮下注射免疫是可诱导长期黏膜免疫的有效途径。     

特异性靶向的戊肝嵌合DNA疫苗的构建及免疫效果研究

目的 制备特异性靶向的嵌合DNA疫苗，并探讨其诱导机体产生免疫应答的效果。方法 用基因重组技术构建细胞毒T淋巴细胞抗原4（CTLA4）与戊肝病毒抗原HEVE2嵌合基因的真核表达质粒。同时构建不带CTLA4的pHEVE2作为平行对照质粒，体外转染COS-7细胞，Western blotting法检测细胞培养上清表达并且 物；于BALB/c小鼠皮内注射，每隔2周1次，共免疫3次，100μg/次，于免疫的第3、5和10周ELISA检测抗体效价。结果 获得pHEVE2和pCTLA4-HEVE2嵌合基因真核表达质粒，测序证实各连接点阅读框序列正确；体外转染COS-7细胞，证明真核质粒以分泌形式表达；接种pCTLA4-HEVE2小鼠产生高滴度的特异性抗HEVE2抗体，比接种pHEVE2的对照组高50-100倍；pCTLA4-HEVE2诱导高水平的IgG2a,IgG2bTh1型抗体和IgG1Th2型抗体应答，pHEVE2则以IgG1Th2型抗体应答为主。结论 CTLA4-HEVE2嵌合DNA疫苗有效地增强动物对HEVE2抗原的免疫应答，为进一步研究抗原靶向性的嵌合DNA疫苗奠定基础。     

兔抗破骨细胞蛋白质酪氨酸磷酸酶多克隆抗体的制备和应用

目的：采用已构建的pET28a-ΔPTP-oc重组质粒纯化重组蛋白,制备兔抗破骨细胞蛋白质酪氨酸磷酸酶（PTP-oc）多克隆抗体并鉴定其性能。方法：将构建的pET28a-ΔPTP-oc重组质粒转化至BL21（DE3）中,应用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导重组蛋白表达。表达产物经过Q柱阴阳离子交换和Ni柱亲和层析获得纯化的PTP-oc重组蛋白,将纯化的重组蛋白作为抗原免疫家兔,获得PTP-oc多克隆抗体。采用间接ELISA法检测抗体效价,Western blotting法检测抗体的特异性。结果：成功纯化出PTP-oc重组蛋白。间接ELISA法检测,采用纯化诱导后的重组蛋白免疫家兔获得了兔抗PTP-oc多克隆抗体,多克隆抗体效价达1∶32000以上,Western blotting法检测,所得多克隆抗体有较高的特异性。结论：成功纯化了PTP-oc重组蛋白,制备出PTP-oc多克隆抗体。     

柯萨奇病毒A16粘膜疫苗的制备及其免疫效果研究

目的利用同源重组技术将柯萨奇病毒A16型(Coxsachievirus A16,CA16)VP1基因重组入枯草芽孢杆菌基因组,进而将VP1蛋白展示在芽孢表面制备CA16粘膜疫苗。将疫苗滴鼻方式免疫小鼠,检测小鼠血清中VP1特异性抗体滴度,体外中和实验检测抗体的保护作用。方法将枯草芽孢杆菌CotB基因与VP1基因连接后插入整合质粒pDG1662得到重组质粒pDG1662-CotB-VP1,电转化法将线性化重组质粒转化枯草芽孢杆菌1A771,抗生素抗性筛选,PCR、Western-Blot、免疫荧光鉴定VP1基因重组及蛋白表达情况。将该疫苗滴鼻免疫小鼠,ELISA法检测血清抗体滴度,体外中和实验分析该抗血清的中和活性。结果 VP1基因成功重组入枯草芽孢杆菌基因组中并将蛋白展示在芽孢表面。该疫苗免疫小鼠后有效的诱导了小鼠体液免疫反应,并且该抗血清在体外中和实验中表现了较好的中和活性。结论 CA16 VP1蛋白展示在枯草芽孢杆菌芽孢表面制备的疫苗能刺激小鼠产生具有保护作用的中和抗体,为研制CA16粘膜疫苗奠定了基础。     

人类CD252基因片段在大肠杆菌中的表达、纯化及免疫原性分析

目的优化表达含人类CD252胞外段的融合蛋白,纯化目的蛋白,为单克隆抗体的制备打下良好的基础。方法将测序正确的pET32a（＋）－CD252胞外段重组质粒转入表达菌株BL21感受态细菌中,用SDS－PAGE电泳鉴定重组菌的诱导表达情况,通过改变pET32a（＋）－CD252阳性菌株的诱导时间、温度,以优化出最佳表达条件。采用包涵体纯化法纯化目的蛋白。用纯化的重组蛋白免疫BalB／C小鼠,采用ELISA法测定血清中抗体效价。结果成功获得表达pET32a（＋）－CD252的阳性菌株。转化有pET32a（＋）－CD252胞外段重组质粒的表达菌经IPTG诱导后,在蛋白分子量标准的31．0～42．7kD之间出现了新的蛋白条带,新的蛋白主要存在于包涵体中。优化表达条件分析表明,在诱导4h、温度37℃、IPTG浓度为1．0mmol／L时,融合蛋白的表达量最高。包涵体洗涤纯化后,经SDS-PAGE电泳证明可得到较纯的目的蛋白。免疫小鼠后测得的平均抗体效价为1：3200。结论pET32a（＋）-CD252胞外段原核表达载体能够表达CD252蛋白,并获取了目的蛋白的优化表达条件,表达蛋白具有良好的免疫原性。     

重组登革病毒1-4型包膜蛋白EDIII的融合表达和免疫学特性研究

目的：构建含登革病毒（DENV）1-4型包膜蛋白（E蛋白）EDIII区的融合蛋白,并通过动物实验分析该融合蛋白的免疫机制。方法：通过生物信息学分析获得具有广泛代表性的DENV 1-4型EDIII区的氨基酸序列;将编码DENV 1-4型EDIII区的基因序列通过GS linker进行串联后插入原核表达载体pColdIII的多克隆位点,并将构建的重组质粒pColdIII-EDIII转化至大肠杆菌BL21（DE3）;通过SDS-PAGE及Western blot法鉴定目的蛋白表达,采用镍柱亲和层析法纯化目的蛋白。将纯化的蛋白免疫BABL/c小鼠,初次免疫之后再加强免疫2次。通过ELISA法检测血清中的抗体效价和细胞因子的分泌情况来评价其免疫效应。结果：重组蛋白EDIII免疫小鼠后可以诱导产生高滴度的特异性抗体,抗体效价为1:40 000。抗原刺激小鼠脾淋巴细胞可以诱导Th1和Th2细胞免疫应答。结论：成功表达了含DENV 1-4型E蛋白EDIII的融合蛋白,并通过动物实验证实该融合蛋白能诱导小鼠产生特异性的体液和细胞免疫应答,为DENV四价重组疫苗的研制奠定了基础。     

基于HEV中和表位的基因免疫诱导特异性抗体及中和作用研究

目的:观察基于戊型肝炎病毒中和表位(p179)的基因免疫是否能在小鼠体内诱导具有中和作用的抗体应答。方法:构建含HEV中和表位p179编码基因的真核表达质粒pVAX-179,以肌肉注射法对BALB/c小鼠实施基因免疫,实验组每只小鼠给pVAX-179 100μg,并设立空质粒pVAX和HEV-p179蛋白两个对照组。定期采集小鼠血清,ELISA法检测其特异性抗HEV-IgG抗体及其亲合力;以基于PCR的体外中和实验检测抗体的中和活性。结果:pVAX-179质粒基因免疫诱导小鼠体内产生了特异性抗-HEV-IgG抗体,抗体水平于第10周达高峰,OD值为0.55±0.13,与空质粒pVAX组(0.15±0.07)比较差异有统计学意义(P<0.001)。第6周实验组抗体亲合力(ED50为2.5 mo.lL-1)高于蛋白对照组(ED50为2.0 mol.L-1),基因免疫促进了抗体亲合力的成熟;体外中和实验证实产生的特异性抗体能够阻止HEV感染人肝癌细胞7721,具有中和HEV的活性。结论:基于戊型肝炎病毒中和表位(p179)的基因疫苗pVAX-179能够在小鼠体内诱导产生具有中和作用的抗体应答。     

小鼠OX40原核表达载体的构建及表达

目的构建小鼠OX40胞外段基因的原核表达载体并进行诱导表达。方法PCR扩增OX40胞外段基因并将其插入原核表达质粒pET32a（＋），重组pET32a—OX40经测序鉴定后转入表达菌株BL21（DE3）进行融合蛋白的小量诱导表达。结果出现新增蛋白条带，融合蛋白主要存在于包涵体中；Western Blotting分析表明该融合蛋白可与相应抗体发生特异性结合。结论构建了小鼠OX40基因的原核表达载体，获得OX40胞外段融合蛋白。     

DNA防龋疫苗经TSG途径免疫BALB／c小鼠实验研究

目的 观察编码PAc结构基因A—P片段的重组质粒pCIA—P以经肌肉和颌下腺周围区域皮下注射(TSG)两种途径免疫BALB／c小鼠后的特异性免疫反应，并观察表面蛋白抗原PAc在小鼠颌下腺中的表达。方法 将25只BALB／c小鼠随机分为4组，分别以重组质粒pCIA—P经肌肉、颌下腺区周围区域皮下注射两种途径免疫小鼠及pCI质粒和生理盐水肌肉免疫小鼠，ELISA法检测血清和唾液中特异性抗体水平动态变化。将pCIA—P经颌下腺区周围区域皮下注射以免疫组化技术观察表面蛋白抗原PAc。结果 颌下腺区皮下注射法免疫后唾液IgA型特异性抗体和血清IgG型特异性抗体均明显升高，并持续数周。肌肉注射法后血清IgG型特异性抗体明显升高，但未有效诱导产生唾液IgA型特异性抗体。在小鼠颌下腺中检测到PAc蛋白的表达。结论 重组质粒pCIA—P是一种有效的免疫原，该DNA防龋疫苗经颌下腺周围区域皮下注射免疫是可诱导长期粘膜免疫的有效途径。