人肝细胞臌孔聚丙烯杂化界面的生物相容性

背景：生物反应器膜材料不仅具备双向物质交换、良好的理化特性，还要具有良好的生物相容性。目的：评价人肝细胞／微孔聚丙烯杂化界面，即接枝改性微孔聚丙烯超滤膜的生物相容性。设计、时间及地点：动物实验观察，于2005—09-007-10在上海交通大学医学院附属瑞金医院器官移植中心（上海消化外科研究所）实验室和浙江大学高分子材料研究所共同完成。材料：选用孔径为0．2um，分子截流量为M50000～100000的微孔聚丙烯超滤平面薄膜为实验模型，利用光化学接枝聚合改性技术，在聚丙烯超滤膜表面通过化学键的形式接枝亲水性丙烯酰胺基冈，成功地构建一种人肝细胞／微孔聚丙烯杂化界面，即新型的生物人工肝生物反应器膜——接枝改性微孔聚丙烯超滤膜。方法：参照国际标准化组织ISO10993-1：1992医疗器械生物学评价标准和要求进行溶血试验、细胞毒性试验、全身急性毒性试验、热原试验、皮肤和皮内刺激试验，评价接枝改性微孔聚丙烯超滤膜的生物相容性。主要观察指标：接枝改性微孔聚丙烯超滤膜浸提液的溶血试验、细胞毒性试验、全身急性毒性试验、热原试验、皮肤和皮内刺激试验结果。结果：接枝改性微孔聚丙烯超滤膜的溶血率为1．90％〈5％，表明其无致溶血性；其浸提液对L929细胞增殖活性无明显的抑制作用；注射接枝改性微孔聚丙烯超滤膜浸提液后24，48，72h，所有小鼠无死亡，体质量无明显变化，未观察到眼睑下垂、呼吸困难、发绀、腹部刺激症、腹泻、运动减少、震颤等全身急性毒性反应。热原试验中兔体温变化范围-0．2～0．4，符合生物医学材料无热原的评价标准。皮肤刺激实验中仅1例有极轻微的红斑，积分1分，其原发刺激指数为0．25〈0．4，皮内刺激试验结果原发刺激指数为0．2，平均原发刺激指数为O．068，均〈0．4，无皮肤刺激性。结论：人肝细胞／微孔聚丙烯杂化界面，即接枝改性微孔聚丙烯超滤膜无致溶血性、细胞毒性、致热原性和皮肤刺激致敏性，证实通过光化学接枝丙烯酰胺后具有良好的生物相容性。     

人肝细胞/微孔聚丙烯杂化界面的生物相容性

背景:生物反应器膜材料不仅具备双向物质交换、良好的理化特性,还要具有良好的生物相容性。目的:评价人肝细胞/微孔聚丙烯杂化界面,即接枝改性微孔聚丙烯超滤膜的生物相容性。设计、时间及地点:动物实验观察,于2005-09/2007-10 在上海交通大学医学院附属瑞金医院器官移植中心(上海消化外科研究所)实验室和浙江大学高分子材料研究所共同完成。材料:选用孔径为 0.2 μm,分子截流量为Mr 50 000~100 000 的微孔聚丙烯超滤平面薄膜为实验模型,利用光化学接枝聚合改性技术,在聚丙烯超滤膜表面通过化学键的形式接枝亲水性丙烯酰胺基团,成功地构建一种人肝细胞/微孔聚丙烯杂化界面,即新型的生物人工肝生物反应器膜——接枝改性微孔聚丙烯超滤膜。方法:参照国际标准化组织 ISO10993-1:1992医疗器械生物学评价标准和要求进行溶血试验、细胞毒性试验、全身急性毒性试验、热原试验、皮肤和皮内刺激试验,评价接枝改性微孔聚丙烯超滤膜的生物相容性。主要观察指标:接枝改性微孔聚丙烯超滤膜浸提液的溶血试验、细胞毒性试验、全身急性毒性试验、热原试验、皮肤和皮内刺激试验结果。结果:接枝改性微孔聚丙烯超滤膜的溶血率为 1.90%< 5%,表明其无致溶血性;其浸提液对 L929 细胞增殖活性无明显的抑制作用;注射接枝改性微孔聚丙烯超滤膜浸提液后24,48,72 h,所有小鼠无死亡,体质量无明显变化,未观察到眼睑下垂、呼吸困难、发绀、腹部刺激症、腹泻、运动减少、震颤等全身急性毒性反应。热原试验中兔体温变化范围-0.2~0.4,符合生物医学材料无热原的评价标准。皮肤刺激实验中仅 1 例有极轻微的红斑,积分 1 分,其原发刺激指数为 0.25 < 0.4,皮内刺激试验结果原发刺激指数为0.2,平均原发刺激指数为 0.068,均< 0.4,无皮肤刺激性。结论:人肝细胞/微孔聚丙烯杂化界面,即接枝改性微孔聚丙烯超滤膜无致溶血性、细胞毒性、致热原性和皮肤刺激致敏性,证实通过光化学接枝丙烯酰胺后具有良好的生物相容性。     

接枝改性微孔聚丙烯超滤膜的生物相容性评价

背景：生物反应器膜材料不仅具备双向物质交换、良好的理化特性,还要具有良好的生物相容性。目的：通过溶血试验、细胞毒性试验、全身急性毒性试验、热原试验、皮肤和皮内刺激试验来评价接枝改性微孔聚丙烯超滤膜（modified micropore polypropylene semipermeable ultrafiltration membrane,Modified MPP）的生物相容性。设计、时间及地点：动物实验观察,于2005-09/2007-10在上海交通大学医学院附属瑞金医院器官移植中心（上海消化外科研究所     

多种半透膜材料肝细胞相容性的对比研究

目的筛选出与肝细胞有较好生物相容性的半透膜材料,以用于生物人工肝支持系统中空纤维型反应器的制备。方法选择聚醚砜(PES)、聚砜(PSF)、醋酸纤维素(CA)、聚偏二氟乙烯(PVDF)、聚丙烯(PP)、混合纤维素酯(CNA)等有代表性的6种半透膜材料进行肝细胞(L02细胞)培养,同时以聚苯乙烯培养板作为对照组,检测细胞LDH漏出量和DNA Ladder细胞凋亡评价膜材料的细胞毒性,观察各种膜材料上L02细胞的贴壁率、细胞活性、DNA总量等。结果各种膜材料未见明显细胞毒性;L02细胞在PES膜上的贴壁率显著高于CA、PVDF、PP、CNA膜(P<0.05),与对照组和PSF膜无显著差异;PES膜上贴壁细胞数明显较CA和CNA膜多;PES和PSF膜上细胞DNA总量显著高于CA、PP、CNA膜(P<0.05);在7天的培养时间内,PES膜上和对照组的细胞活性最高,显著高于CA、PVDF、PP、CNA膜(P<0.05)。结论在6种半透膜材料中,PES是肝细胞相容性最佳的半透膜材料,适宜用于生物反应器中空纤维的制备。     

聚丙烯酰胺接枝改性聚丙烯膜的血液相容性(英文)

背景:绝大多数高分子材料在与血液接触时都导致不同程度凝血,使其应用受到限制.因此研制有优良抗凝血性能的高分子材料成为生物人工肝材料临床研究中的关键问题.目的:体外检测新型人工肝反应器材料--聚丙烯酰胺接枝改性聚丙烯膜(PP-g-AAm)的血液相容性.方法:对改性前、后的聚丙烯膜行溶血试验、凝血酶原时间和活化部分凝血激酶时间试验,用流式细胞术检测血小板CD62P和CD63的表达率,扫描电镜观察两种膜上血小板的黏附情况.结果与结论:聚丙烯膜和PP-g-AAm膜的溶血率分别为1.32%和1.46%;聚丙烯膜的凝血酶原时间和活化部分凝血激酶时间较PP-g-AAm 膜明显缩短(P<0.05);PP-g-AAm 膜激活血小板表达CD62P、CD63的百分率都明显少于聚丙烯膜(P<0.05);扫描电镜观察两种材料表面黏附的血小板都有明显变形,但PP-g-AAm膜表面黏附的血小板明显少于聚丙烯膜.提示PP-g-AAm膜具有良好的血液相容性.     

聚醚砜绒毛膜培养L02细胞的初步研究

目的初步观察一种聚醚砜(polyethersulfone,PES)绒毛膜对人肝细胞系L02细胞培养的支持作用,以探讨该种PES膜材料用于生物人工肝的可行性。方法 PES绒毛膜材料利用非对称性冷却成型技术制备而成。将L02细胞以7.0×104的密度接种于该膜上,分别用悬浮细胞计数法、MTT法、激光共聚焦显微镜、扫描电镜和RT-PCR法来观察L02细胞在该材料上的贴壁率、细胞活性、生长特性及AFP和CYP1A1的基因表达,并以无绒毛型平板膜材料和普通培养板做为对照。结果①PES绒毛膜上L02细胞生长良好,在10h内贴壁率由57.7%增高到91.7%,优于平板膜,与培养板相似;细胞活性8d内增长4至5倍,优于平板膜和培养板。②激光共聚焦显微镜下观察L02细胞在绒毛膜上粘附呈多细胞聚集生长,保持活性;扫描电镜证实了该结果,且逐渐融合形成紧密连接,并见部分细胞呈三维立体生长。③培养于PES绒毛膜上的L02细胞AFP和CYP1A1的表达优于平板膜,与培养板一致。结论 PES绒毛膜能够有效的支持L02细胞在其表面粘附、生长、增殖和AFP及CYP1A1基因的表达,可成为生物人工肝支持系统的膜材料。     

聚N-异丙基丙烯酰胺改性聚苯乙烯培养皿:以温度变化控制细胞的分离

背景:在组织工程研究中,最常用的细胞分离方法是胰蛋白酶消化,但是这种方法可能破环细胞外基质蛋白造成细胞活性降低,因此研制一种避免酶消化的细胞分离技术将有重要的意义.目的:利用聚N-异丙基丙烯酰胺能够随温度变化疏水性的特性,建立一种基于温度敏感性控制细胞分离技术.方法:配制质量浓度为55%的异丙基丙烯酰胺异丙醇溶液,均匀涂抹在聚苯乙烯培养皿表面,然后通过电子束照射的方法接枝于培养皿表面.用原子力显微镜观察接枝前后聚苯乙烯培养皿表面微观结构,静滴法测量不同温度下接枝前后聚苯乙烯培养皿表面的水接触角,聚N-异丙基丙烯酰胺接枝后培养皿在不同温度下细胞分离能力变化.结果与结论;原子力显微镜观察发现聚苯乙烯培养皿表面上形成薄层致密的聚N-异丙基丙烯酰胺聚合物;在37℃时聚N-异丙基丙烯酰胺接枝培养皿与未接枝培养皿水接触角差异无显著性意义,在20℃时聚N-异丙基丙烯酰胺接枝培养皿的水接触角明显低于未接枝培养皿;在37℃时细胞能正常的在温度敏感性培养皿上贴壁生长,在20℃时大量细胞从培养皿底面脱离悬浮在培养基中.结果说明聚N-异丙基丙烯酰胺接枝培养皿表面可以利用温度的改变控制细胞的分离,此技术有望在组织工程中发挥重要的作用.     

聚对苯二甲酸乙二醇酯表面接枝改性及其血液相容性的研究进展

背景：聚对苯二甲酸乙二醇酯是一种具有优良的力学性能、化学惰性的聚酯材料,但由于聚合材料的血液相容性不高,因此需对其表面进行修饰,改善其血液相容性。目的：结合凝血机制简要介绍聚对苯二甲酸乙二醇酯材料表面接枝改性方法及其改性后的血液相容性。方法：检索1990/2009PubMed、SDOS及CNKI数据库有关凝血发生机制、抗凝血药物的种类和其对凝血发生的影响以及聚对苯二甲酸乙二醇酯材料本体性质、材料表面接枝的方法及其血液相容性评价等方面的文献。结果与结论：目前聚对苯二甲酸乙二醇酯表面接枝改性的方法局限性在于表面接枝的分子只能改变材料某种特性,而生物材料在人体内所处环境极为复杂,通过单一的改变材料某些性质很难使材料血液相容性得到根本性的改善。因此从仿生学角度通过接枝特殊分子诱导具有生理活性的血管内皮细胞黏附和生长,构建一种类似于天然血管壁模式的材料表面势必成为未来提高生物材料血液相容性的重要方向。     

低温等离子体技术在生物医用材料改性中的应用

低温等离子体辐照是生物医用材料表面改性的重要方法,其通过刻蚀、活化、接枝等方法增加生物材料的组织相容性,为组织工程化血管的构建提供了新途径。     

透明质酸改性的聚乳酸支架

背景：聚乳酸材料不具备细胞外基质材料的良好细胞亲和性能,采用化学方法将透明质酸交联制得的水凝胶具有良好的生物相容性。目的：以透明质酸对新型多孔隙率聚乳酸支架的进行改性,观察改性后支架的细胞相容性的改变。方法：采用盐析法制备出高孔隙率聚乳酸支架,采用低浓度NaOH进行表面轻度水解后,利用EDC和透明质酸进行支架的改性。结果与结论：透明质酸改性聚乳酸支架在扫描电镜下显示为多微孔的三维立体结构,孔壁及界面平滑,孔隙之间可见更细小微孔相连。改性聚乳酸支架水滴渗入较快,改性后多孔支架的保水能力与吸水能力得到明显的改善;透明质酸改性聚乳酸支架上细胞黏附及增殖优于未改性聚乳酸支架。透明质酸改性聚乳酸组软骨细胞生长密度及基质分泌更加旺盛。表明透明质酸改性聚乳酸多孔支架仍保持多孔的三维结构,其水亲和力、吸水能力、保水能力和细胞相容性均得到明显改善。     

壳聚糖球形多孔微载体支持下人肝细胞L-02的高浓度细胞培养

背景:微载体培养技术作为一项体外高浓度细胞培养技术,近年来已在肝细胞的体外培养中得到应用。目的:对壳聚糖球形多孔微载体培养的人肝细胞L-02进行定时的形态学观察。方法:以自制的壳聚糖球形多孔微载体样本为支架来培养人肝细胞L-02设为实验组;无壳聚糖球形多孔微载体支持下人肝细胞的培养设为对照组。对两组细胞进行定时的细胞计数,并对实验组进行形态学观察,包括倒置相差生物显微镜观察和扫描电子显微镜观察。结果:两组培养的细胞数量均呈现前3d增长,在第3天细胞数量达到最高值;而且实验组3个样本培养的细胞数明显高于对照组无微载体培养的细胞数量(P<0.05),实验组各样本之间差异无显著性意义(P>0.05);倒置相差生物显微镜下动态观察,可见前3d微载体表面黏附生长的肝细胞则逐渐增多,第3天可见大部分微载体表面有许多肝细胞黏附成团,总的存活率均在90%以上,且肝细胞保持着良好的形态学结构;扫描电子显微镜观察,微载体表面、切面和内部均可看到有许多球状肝细胞紧密黏附。提示,以自制的壳聚糖球形多孔微载体作为一种支架,在体外三维环境下可以进行高浓度细胞培养。     

壳聚糖球形多孔微载体支持下人肝细胞L-02的高浓度细胞培养

背景：微载体培养技术作为一项体外高浓度细胞培养技术,近年来已在肝细胞的体外培养中得到应用。目的：对壳聚糖球形多孔微载体培养的人肝细胞L-02进行定时的形态学观察。方法：以自制的壳聚糖球形多孔微载体样本为支架来培养人肝细胞L-02设为实验组;无壳聚糖球形多孔微载体支持下人肝细胞的培养设为对照组。对两组细胞进行定时的细胞计数,并对实验组进行形态学观察,包括倒置相差生物显微镜观察和扫描电子显微镜观察。结果：两组培养的细胞数量均呈现前3d增长,在第3天细胞数量达到最高值;而且实验组3个样本培养的细胞数明显高于对照组无微载体培养的细胞数量（P〈0.05）,实验组各样本之间差异无显著性意义（P〉0.05）;倒置相差生物显微镜下动态观察,可见前3d微载体表面黏附生长的肝细胞则逐渐增多,第3天可见大部分微载体表面有许多肝细胞黏附成团,总的存活率均在90%以上,且肝细胞保持着良好的形态学结构;扫描电子显微镜观察,微载体表面、切面和内部均可看到有许多球状肝细胞紧密黏附。提示,以自制的壳聚糖球形多孔微载体作为一种支架,在体外三维环境下可以进行高浓度细胞培养。     

壳聚糖球形多孔微载体支持下培养的肝细胞功能及其代谢活性检测

背景:在肝细胞移植及生物型人工肝研究中,肝细胞培养仍然是其关键,如何方便地获取足够数量、活性较好、功能良好的肝细胞已经成为其首要问题。微载体培养技术作为一项体外高密度细胞培养技术,近年来已在肝细胞的体外培养中得到应用。目的:对壳聚糖球形多孔微载体培养的人肝细胞L-02进行定时的细胞功能和代谢活性检测。方法:对以自制的壳聚糖球形多孔微载体样本为支架培养的人肝细胞L-02进行定时的细胞功能检测(包括测定谷草转氨酶,谷丙转氨酶和乳酸脱氢酶质量浓度)和代谢活性检测(包括检测培养基中白蛋白、尿素、葡萄糖含量),其中实验组为壳聚糖球形多孔微载体支持下培养人肝细胞L-02,对照组为无壳聚糖球形多孔微载体支持下培养人肝细胞L-02,检测时间点为人肝细胞L-02培养的第1,2,3,4,5天。结果与结论:实验组和对照组测定的谷草转氨酶、谷丙转氨酶和乳酸脱氢酶活性在前3d持续下降,第3天降到最低,而从第4天开始重新反弹上升;但白蛋白、尿素和葡萄糖水平在前3d持续上升,第3天升到最高值,而从第4天开始逐渐下降,实验组每天测定上述各项水平始终明显高于对照组(P<0.05),提示实验组中的人肝细胞L-02代谢活性较对照组增强。     

壳聚糖球形多孔微载体支持下培养的肝细胞功能及其代谢活性检测

背景：在肝细胞移植及生物型人工肝研究中,肝细胞培养仍然是其关键,如何方便地获取足够数量、活性较好、功能良好的肝细胞已经成为其首要问题。微载体培养技术作为一项体外高密度细胞培养技术,近年来已在肝细胞的体外培养中得到应用。目的：对壳聚糖球形多孔微载体培养的人肝细胞L-02进行定时的细胞功能和代谢活性检测。方法：对以自制的壳聚糖球形多孔微载体样本为支架培养的人肝细胞L-02进行定时的细胞功能检测（包括测定谷草转氨酶,谷丙转氨酶和乳酸脱氢酶质量浓度）和代谢活性检测（包括检测培养基中白蛋白、尿素、葡萄糖含量）,其中实验组为壳聚糖球形多孔微载体支持下培养人肝细胞L-02,对照组为无壳聚糖球形多孔微载体支持下培养人肝细胞L-02,检测时间点为人肝细胞L-02培养的第1,2,3,4,5天。结果与结论：实验组和对照组测定的谷草转氨酶、谷丙转氨酶和乳酸脱氢酶活性在前3d持续下降,第3天降到最低,而从第4天开始重新反弹上升;但白蛋白、尿素和葡萄糖水平在前3d持续上升,第3天升到最高值,而从第4天开始逐渐下降,实验组每天测定上述各项水平始终明显高于对照组（P〈0.05）,提示实验组中的人肝细胞L-02代谢活性较对照组增强。     

脐带血单个核细胞体外培养分化为肝细胞的实验观察

目的探讨脐带血单个核细胞在体外定向分化为肝细胞的条件及能力,为建立脐血干细胞移植治疗慢性肝衰竭提供实验依据。方法采集脐带血分离单个核细胞后,在实验组加入成纤维细胞生长因子(FGF)及促肝细胞生长因子(HGF)、或FGF加胎肝上清液培养,对照组只加FGF培养,观察细胞生长分化状况,免疫组化检测两组人甲胎蛋白(AFP)和白蛋白(Alb)。结果实验组可见类圆形及多边形细胞,呈类肝细胞形态,对照组大多为梭形细胞,未见多边形细胞;实验组细胞AFP、Alb免疫组化染色为阳性,对照组未见AFP,Alb阳性细胞。HGF的诱导分化效果优于胎肝上清液。结论脐带血单个细胞在HGF或胎肝上清液的诱导下可以定向分化为能分泌Alb及AFP的类肝细胞。     

不同纲(罗非鱼/大鼠)肝细胞异种移植的排斥反应

背景:大多数异种移植的研究仍局限在两个不同种属间的哺乳动物,两个不同纲间的肝细胞移植却罕有报道.目的:观察不同纲间(罗非鱼/大鼠)肝细胞移植的排斥反应及其途径.设计、时间及地点:对照观察实验,于2007-09/2008-09在同济大学医学院完成.材料:健康成年尼罗罗非鱼.健康成年SD大鼠20只,体质量200～250 g,随机分为实验组和对照组.方法:采用胶原酶冷消化法分离罗非鱼肝细胞,以生理盐水重悬,细胞浓度调整为2×10~(10)L~(-1).实验组脾内注射提纯后的罗非鱼肝细胞2×10~7,对照组脾内注射生理盐水.主要观察指标:苏木精-伊红染色法观察不同时段移植物组织学改变及免疫组织化学法检测移植物周围IgM及IgG.结果:实验组移植后2 h可见红髓内弥散分布的成簇、小灶状肝细胞,肝细胞呈圆形,细胞边界清晰,胞核呈圆形或椭圆形,胞质染色较淡.肝细胞移植物在移植后很快的被排斥,移植后4 h,部分肝细胞边界不清.核固缩、核溶解,存活肝细胞明显减少,周围炎性细胞浸润,移植后8 h只能见到少许正常肝细胞,24 h后未见到完整肝细胞.移植后3 d可见肉芽肿样区域,大量淋巴细胞及单核细胞浸润.对照组术后早期可见小出血灶、炎性细胞浸润较轻.实验组移植后1 h大鼠脾内移植物周围可见少量的IgM,移植后4 h移植物周围IgM明显聚集,一直持续到移植后3 d时反应程度减弱,IgG在移植后24h开始出现,3d后反应程度减弱及消失.对照组大鼠脾内始终未见IgM和IgG出现.结论:罗非鱼肝细胞移植于大鼠体内可能发生了超急性排斥反应,可能是大鼠天然抗体和罗非鱼肝细胞表面的异种抗原反应后,通过补体依赖的细胞毒作用和抗体依赖细胞介导的细胞毒作用对罗非鱼肝细胞造成的损伤.     

共价交联水蛭素/海藻酸钠涂层抗凝血修饰膨体聚四氟乙烯人工血管

背景：对于直径小于6mm的血管，血栓形成或内膜增生等原因限制了小口径膨体聚四氟乙烯人工血管的使用。目的：实验拟用共价交联的海藻酸钠和水蛭素层层自组装后对小口径膨体聚四氟乙烯人工血管进行表面修饰和改性，观察其血液相容性。设计：观察性实验。单位：实验于2006-03／2007-06在哈尔滨工业大学生物医学工程中心纳米医药与生物传感器实验室完成。材料：膨体聚四氟乙烯人工血管（W．L Gore＆Associates，Inc．，Flagstaff.AZ，直径4mm）；海藻酸钠购于美国Sigma公司；水蛭素购于Calbiochem公司。方法：首先用全氟磺酸修饰膨体聚四氟乙烯表面，通过静电吸引层层自组装吸附多层海藻酸钠／重氮树脂／水蛭素提供锚定位点，应用BCA法推算吸附在人工血管表面的水蛭素质量。主要观察指标：①材料表面吸附蛋白浓度。②接触角。③衰减全反射．傅立叶变换红外光谱。④扫描电镜表征材料表面形貌及血小板黏附情况。⑤活化部分凝血激酶时间、凝血酶原时间。⑥溶血度。结果：①修饰后的人工血管表面吸附的水蛭素浓度为16-35μg／cm^2。②衰减全反射．傅立叶变换红外光谱结果显示出特征峰位，证明水蛭素成功固定到人工血管表面。③修饰后人工血管的接触角降低，亲水性能增强。④修饰后的人工血管与未修饰的人工血管相比，活化部分凝血激酶时间和凝血酶原时间延长、血小板黏附情况减少，具有更好的血液相容性。结论：共价交联水蛭素，海藻酸钠涂层抗凝血修饰可提高膨体聚四氟乙烯人工血管的表面性能及血液相容性。