GM-CSF重组腺病毒转染外周血树突状细胞的研究

目的:利用GMCSF重组腺病毒转染外周血单核细胞,诱导培养树突状细胞(dendriticcell,DC),并与细胞因子培养的DC进行生物学特性的比较。方法:将GMCSF重组腺病毒转染正常人外周血单核细胞,或用重组细胞因子GMCSF,诱导培养获得DC,通过相差显微镜观察DC表面形态变化,FACS分析GMCSF基因转染对DC表面免疫分子表达的影响,Westernblot鉴定GMCSF的表达,ELISA检测IL12分泌水平,MTT法检测DC激发同种异体T细胞增殖的能力。结果:GMCSF重组腺病毒转染外周血单核细胞,能扩增获得DC,该DC高表达CD1a、HLADR、CD80和CD86等免疫分子,并表达细胞因子GMCSF和IL12,对同种异体淋巴细胞有更强的刺激活性。结论:用GMCSF重组腺病毒可从外周血单核细胞中扩增到DC,为DC瘤苗临床应用提供实验基础。     

捕获肿瘤抗原的树突状细胞治疗小鼠膀胱肿瘤

目的：研究捕获肿瘤抗原的树突状细胞（dendritic cells,DC)治疗膀胱肿瘤的可行性。方法：分离小鼠脏树突状细胞,外体经粒－巨细胞集落刺激因子（GM－CSF）活化和放射线来活的肿瘤细胞刺激后（D组）,治疗膀胱肿瘤移植模型,并设立空白对照组（A）,单纯GM－CSF活化的树突状细胞组（B）及灭活肿瘤细胞组（C）。结果：D组特异性T淋巴细胞活性、IL－4及IFN－γ水平明显高于其它组（P＜0．01）;所有小鼠长期无瘤存活（＞100天）而其它组小鼠存活期小于30天（P＜0．001）。结论：捕获肿瘤抗原的树突状细胞治疗膀胱肿瘤具有一定的临床应用前景。     

人外周血树突状细胞的体外扩增及鉴定

树突状细胞(DC)作为抗原提呈细胞,在激发T细胞免疫应答及T细胞依赖性抗体生成中起重要作用,骨髓及外周血的CD34造血前体细胞在GM-CSF和TNF-α的作用下,可在体外分化发育,生成树突状细胞.本研究从正常人外周血分离获得单核细胞,加入100ng/ml hGM-CSF、500U/ml hIL-4,体外培养1周后,获得大量高纯度的树突状细胞,其高表达MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ类分子及共刺激分子B7-1和CD40,能强烈激发同种异体T淋巴细胞增殖,培养条件以应用自体血清或胎牛血清为最佳;单独应用hGM-CSF只能生成巨噬细胞;在培养末期加入TNFα可促进DC进一步成熟.本研究为DC的深入研究与临床应用奠定了基础.     

GM-CSF 基因修饰肿瘤细胞疫苗治疗前后黑素瘤患者CD8 +T细胞的变化及其对预后的影响

目的:探讨粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)基因修饰的肿瘤细胞疫苗(GM-CSF modified tumor cell vaccine,GVAX)治疗前后黑素瘤患者外周血免疫指标的变化及其对预后的影响。方法:收集2007年10月至2012年12月期间于天津医科大学肿瘤医院接受GVAX治疗的56例黑素瘤患者,采用流式细胞技术检测患者治疗前后外周血CD3+T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、调节性T细胞(Treg)、自然杀伤细胞(NK)及树突状细胞(DC1和DC2)的比例,分析治疗前后外周血各免疫细胞比例的变化,并探讨其与患者预后的关系。结果:GVAX治疗后患者外周血CD8+T细胞比例较前升高[(37.56±12.76)%vs(34.71±12.30)%,P=0.006],CD4+T细胞比例降低[(53.44±13.36)%vs(56.27±13.15)%,P=0.017],CD4+/CD8+比值降低[1.61(1.37)vs 1.75(0.71),P=0.009]。治疗后CD3+T、NK、Treg、DC1、DC2与治疗前的差异无统计学意义(P>0.05)。晚期患者GVAX治疗前外周血CD8+T细胞比例大于均值组与小于均值组相比,中位生存时间显著延长(29.16 vs 13.34个月,P=0.012)。结论:GVAX治疗黑素瘤可增强CD8+T细胞为主的抗肿瘤免疫应答,晚期患者外周血CD8+T细胞比例可作为预测GVAX疗效的指标,为判断预后起到一定的提示作用。     

IFN-α联合GM-CSF诱导胃癌患者外周血单个核细胞分化为树突状细胞

目的： 探索干扰素-α（interferon-α,IFN-α）联合粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（granulocyte-macrophage colony-stimulating factor, GM-CSF）体外诱导胃癌患者外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell,PBMC）向树突状细胞（dendritic cell,DC）分化的可能性。 方法： 10 例胃癌患者PBMC分别用GM-CSF 100 ng/ml联合IFN-α 500 IU/ml（命名为IFN-α DC） 或GM-CSF 100 ng/ml联合50 ng/ml IL-4（命名为IL-4 DC）体外培养,然后用CD40L、LPS诱导DC成熟。Giemsa染色法观察IFN-α DC和IL-4 DC的形态,流式细胞术分析IFN-α DC和IL-4 DC表面CD1a、CD80、CD83、CD86和HLA-DR的表达情况,同种异体混合淋巴细胞反应（mixed lymphocyte reaction,MLR）检测不同的成熟DC刺激同种异体T淋巴细胞增殖的能力。 结果： IFN-α DC和IL-4 DC均呈现典型DC形态。IFN-α DC和IL-4 DC分别在诱导第3天和第5天时,细胞表面CD1a、CD80、CD83、CD86和HLA-DR表达达到较高水平,成熟IFN-α DC表面CD83\[（78.25±15.36）% vs （50.14±10.24）%,P<0.05\]和CD86\[（84.84±10.12）% vs （62.93±15.12）%,P<0.05\]的表达均高于成熟IL-4 DC。成熟IFN-α DC刺激异体T淋巴细胞增殖能力强于未成熟IFN-α DC（P<005）。在DC与T细胞数量比为1∶40和1∶20时,成熟IFN-α DC刺激同种异体T淋巴细胞增殖的能力明显强于成熟IL-4 DC\[（39.43±9.21）% vs （27.34±10.63）%,（60.31±7.86）% vs （48.63±6.25）%;均P<0.05\]。 结论： 相比常用的IL-4联合GM-CSF诱导方法,IFN-α联合GM-CSF可以在更短时间内将胃癌患者PBMC诱导成具有更强刺激同种异体T淋巴细胞增殖能力的DC细胞,这可能与其表面CD83和CD86表达增高有关。     

脐血与恶性胸腔积液来源树突状细胞的培养及特性的比较研究

目的拟用体外培养的方法，从人脐血及恶性胸腔积液中诱导出功能健全的树突状细胞（DCs）。并探讨DCs的体外培养、增生情况。方法从脐血及恶性胸腔积液中分离出DCs前体细胞，加入IL-4，GM-CSF，TNF-α诱导出DCs。用倒置显微镜观察培养的DCs及用流式细胞仪检测DCs的表面分子。做混合淋巴细胞反应（MLR），了解DCs对T细胞的激活作用。结果两种来源的DCs在形态及细胞表型差异无统计学意义，但两种来源的DCs成熟的时间有差异。两种来源的DCs均可使T细胞扩增．但激发T细胞增生的能力有差异。结诊人脐血及恶性胸腔积液中可诱导出功能饽今的DCs．     

GM-CSF修饰肿瘤细胞疫苗治疗前后肺癌患者Treg的变化及其临床意义

目的:观察GM-CSF基因修饰的肿瘤细胞疫苗(GM-CSF modified tumor cell vaccine,GVAX)治疗前后肺癌患者外周血中CD4+CD25+调节性T细胞(regulatory T cell,Treg)比例的变化,探讨其与肺癌临床病理特征的关系及对患者生存的影响。方法:选择2007年3月至2010年7月天津医科大学附属肿瘤医院接受GVAX治疗的85例肺癌患者,其中鳞癌28例、腺癌47例、小细胞癌10例,早期(Ⅰ～ⅢA期)23例、晚期(ⅢB～Ⅳ期)62例。流式细胞术检测患者GVAX治疗前后外周血Treg的比例,分析治疗前后Treg比例变化与肺癌临床病理特征和患者生存期的关系。结果:接受GVAX治疗的85例肺癌患者1、3年的生存率分别为69.3%、48.2%,治疗后外周血Treg比例明显下降[(4.86±2.52)%vs(5.52±2.68)%,P<0.05]。患者血清LDH水平正常组治疗后Treg比例明显下降[(4.50±2.23)%vs(5.59±2.76)%,P<0.05],而LDH增高组治疗后Treg比例上升[(6.04±3.07)%vs(5.31±2.48)%,P<0.05];GVAX治疗超过1个疗程者较治疗1个疗程者治疗后Treg比例下降更明显[(-0.39±2.39)%vs(-2.11±1.62)%,P<0.05]。治疗前后外周血Treg比例的变化与患者预后相关,治疗后Treg比例下降组患者中位总生存期(overall survival,OS)明显长于升高组(21个月vs 10个月,P<0.05),晚期肺癌患者中Treg比例下降者的OS延长更明显(18个月vs 8个月,P<0.05)。结论:肺癌患者GVAX治疗前后外周血Treg比例变化可能成为评价GVAX疗效及判断患者预后的免疫指标,GVAX治疗后患者Treg比例的下降提示其疗效和预后都较好。     

体外树突状细胞诱导细胞毒T淋巴细胞杀伤肺癌细胞A549的研究

 目的　研究负载有肺癌细胞株A549可溶性抗原并携带外源粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）基因的树突状细胞（DC）在体外激活自身T淋巴细胞形成的细胞毒T淋巴细胞（CTL）对A549细胞的杀伤作用。方法　用肺癌细胞株A549可溶性抗原致敏DC,再用含有GM-CSF外源基因的腺病毒感染DC,将所得的DC与T细胞混合培养以形成对A549细胞有特异杀伤作用的CTL。细胞分为未处理（N-DC）组、加抗原未感染病毒（A-DC）组和加抗原感染病毒（G-A-DC）组。通过测定乳酸脱氢酶（LDH）计算CTL对A549细胞的杀伤率。结果　当CTL与A549细胞,即效应细胞与靶细胞比值（E／T）为5∶1时,N-DC组的杀伤率为（1.9±0.7）%,A-DC组为（21.3±2.6）%,G-A-DC组为（34.5±4.9）%;当E／T为10∶1时,N-DC组的杀伤率为（4.8±0.8）%,U-DC组为（35.4±3.6）%,G-A-DC组为（51.3±2.9）%;E／T为20∶1时,N-DC组的杀伤率为（5.3±0.2）%,A-DC组为（40.5±7.7）%,G-A-DC组为（72.5±4.7）%。3组之间的杀伤率差异有统计学意义（n＝2,F＝356,P＜0.05）,通过两两比较,得出G-A-DC组的杀伤率高于其他两组（P＜0.001）,且A-DC组高于对照组（P＜0.001）。结论　以肺癌细胞株A549可溶性抗原致敏的DC可诱导出对A549具有特异杀伤作用的CTL,当所致敏的DC通过腺病毒感染而带有外源基因GM-CSF时,所诱导的细胞毒杀伤反应进一步增强。     

肺癌患者外周血树突状细胞的生物学特性研究

目的：探讨肺癌患者外周血来源的树突状细胞（dendritic cells, DC）生物学特性。方法：从肺癌患者外周血分离获得单个核细胞，用细胞因子GMCSF (100 μg/L)，IL4 (50 μg/L)体外培养诱导。凋亡肿瘤细胞负载24 h后加入TNFα（10 μg/L）或CD40激发型单抗于培养DC中，继续诱导3～4 d。分别测定DC的表型、DC摄取抗原能力；混合淋巴细胞反应（MLR）对T细胞增殖能力的测定；细胞计数和3HTdR掺入观察DC对T细胞的激发和扩增效应，并与健康志愿者外周血来源的DC进行比较。结果： 患者外周血单个核细胞和正常人外周血单个核细胞来源的DC均高表达CD1α，CD83，CD80，CD86和HLADR等DC的相关抗原和共刺激分子；患者的未成熟DC能有效摄取FITCDextran，经TNFα或CD40激发型单抗激发诱导后，成为成熟和有功能的DC,几乎完全失去对抗原的摄取能力，与健康人外周血来源DC组相比无明显差别(P>0.05)；患者单个核细胞来源的DC在体外具有激发自体和同种异体外周血T细胞增殖的能力。结论：肺癌患者的外周血来源单个核细胞可以诱导成为具有功能的成熟DC。     

肺癌患者外周血树突状细胞的体外扩增及鉴定

目的 探索体外扩增成熟树突状细胞(dendritic cell，DC)的方法，并进一步鉴定Dc的形态及表型，为开展肿瘤临床生物治疗奠定基础。方法 取肺癌患者外周血，经淋巴细胞分离液分离得到DC前体细胞，加入生长因子DCGF诱导DC生成，并加入自体肿瘤相关抗原刺激。收集细胞用透射电镜观察，并用流式细胞仪测定细胞表型。结果 应用该法扩增细胞可以得到大量成熟DC。电镜观察DC具有典型的形态。流式细胞仪细胞表型测定CD80为81．8％，HLA—DR为98．3％，CD86为69．8%，CDla为19．7％，CD14为66．9．1％，CD80和HLA-DR较未成熟DC的表达明显增加。结论 肺癌患者外周血体外培养可成功地获得成熟的DC，进一步为肿瘤临床生物治疗奠定了基础。     

肺癌患者外周血T淋巴细胞亚群变化及其临床意义

[目的]检测肺癌患者T淋巴细胞亚群变化.[方法]采用SAP法检测42例肺癌患者及20例正常对照组的外周血T淋巴细胞亚群,并将肺癌中转移组和未转移组分别与正常对照组进行比较.[结果](1)肺癌转移组CD3 、CD 4阳性率低于未转移组(P＜0.05),CD 4/CD 8比值比正常组及未转移组低(P＜0.05).(2)未转移组CD 8低于正常组及转移组(P＜0.05).[结论]肺癌患者细胞免疫功能低下,并且细胞免疫功能随病情进展逐步受到抑制.     

肺癌患者化疗前后外周血肿瘤标志物水平变化的临床价值

目的 对肺癌患者化疗前后外周血内肿瘤标志物水平改变进行分析.方法 随机选取50例肺癌患者,给予紫杉醇类或联合顺铂方案化疗2个周期,采用放射免疫技术对不同病理类型组化疗前后外周血内肿瘤标志物CEA、NSE、CYFRA 21-1水平进行监测,并结合化疗前后肺部CT影像学变化分析化疗前各病理类型血清肿瘤外周血内肿瘤标志物水平.结果 50例患者经2个周期化疗后,行CT影像学检测评估,肿块PR+ CR者38例,NC+ PD者12例.化疗前,腺癌组血清CEA水平显著高于鳞癌组和小细胞肺癌组;鳞癌组CYFRA 21-1水平显著高于腺癌组和小细胞肺癌;小细胞肺癌组NSE水平显著高于腺癌组和鳞癌组,数据对比差异均具有统计学意义(P＜0.05).腺癌组(CR+ PR)化疗后CEA水平显著低于化疗前;鳞癌组(CR+ PR)化疗后CYFRA 21-1水平显著低于化疗前;小细胞肺癌组(CR+ PR)化疗后NSE水平显著低于化疗前,数据对比差异均具有统计学意义(P＜0.05).结论 通过检测外周血内肿瘤标志物CEA、NSE、CYFRA 21-1水平改变可用于化疗疗效判定,具有简便、经济的特点.     

Ⅲ～Ⅳ期肺癌患者外周血CIK细胞水平及临床意义研究

目的 :探讨Ⅲ～Ⅳ期肺癌患者外周血CIK细胞水平变化及临床意义。 方法 :流式细胞术检测57例Ⅲ～Ⅳ期肺癌患者及27例健康体检者外周血CIK细胞水平,接受化疗的35例患者治疗后2周再次行外周血CIK细胞水平测定。 结果 :肺癌组外周血CIK细胞水平明显高于正常对照组外周血CIK细胞水平;肺癌组外周血CIK细胞水平与病理类型无关,随临床分期进展而升高;35例接受化疗患者化疗后外周血CIK细胞水平明显低于化疗前。 结论 :Ⅲ～Ⅳ期肺癌患者外周血CIK细胞水平显著升高,有较强抗肿瘤作用;与病理类型无关,受临床分期及治疗干预影响,可作为病情监测的一项指标。     

肺癌外周血EGFR突变检测及其临床意义

目的：通过血浆循环DNA的基因突变检测,筛选表皮生长因子受体（E-GFR）突变型肺癌患者,探讨突变特征及其在肺癌靶向治疗中的意义。方法：选取2009年9月至2010年5月苏州大学附属第一医院及上海市三甲类医院收治的96例肺癌患者的血浆以及其中59例相对应的肿瘤组织中提取DNA,采用PCR扩增和基因测序的方法检测EGFR基因的突变。结果：96例肺癌血样中检测出EGFR突变17例,其突变率为17.7%。在这些突变的样本中,外显子19和21突变分别占88.2% （15/17） 和11.8% （2/17）,其中直接测序法检测出EGFR纯合突变3例 ［L858R 2例,del E746-A750 （1）1例］, 杂合突变14例。对14例杂合突变样本进一步通过单克隆基因测序法确定其突变类型为del E746-A750 （2） 9例、 del E746-A750 （1） 3例、del L747-S752 2例。EGFR基因突变多见于肺腺癌 （包括腺鳞癌）患者, 与患者的性别与吸烟史无明显相关性。59例肺癌患者肿瘤组织的进一步分析证明,血浆EGFR基因突变类型与患者自身肿瘤的突变类型相同, 表明血浆DNA检测到的EGFR突变与原发肿瘤检测到的突变相一致。结论：肺癌患者的血浆循环DNA与相对应的肿瘤组织DNA的EGFR基因突变类型一致; 此外, 相对于传统的 “金标准” 直接测序法而言, 单克隆基因测序的方法能够更精确地判断基因的突变类型。这种简便且微创地检测血浆循环DNA的方法可应用于肺癌EG?FR基因突变的诊断, 从而预测靶向治疗的疗效。     

肺癌患者外周血中Chemerin的测定及临床意义

背景与目的 Chemerin是近来发现的一种类似于趋化因子的趋化蛋白,能够通过与其受体ChemR23的结合发挥对树突状细胞和巨噬细胞的免疫趋化作用,研究表明Chemerin的活化能够增强APC的吞噬作用及抗原递呈作用.随着研究的深入,Chemerin在肿瘤的发生发展过程中的作用也引起人们的重视.本实验中我们通过研究Chemerin在肺癌患者外周血中的表达来进一步探索Chemerin与肺癌的关系.方法 实验选取肺癌患者与健康体检者作为研究对象,应用ELISA法检测两组实验对象外周血中Chemerin的浓度,采用t检验比较两组间统计学差异.应用t检验及单因素方差分析比较肺癌患者外周血中Chemerin的浓度与年龄、性别、病理类型、分化程度、淋巴结转移情况、UICC分期等临床病理指标的关系.结果 42例肺癌患者外周血中Chemerin的浓度与31例健康体检者外周血中Chemerin的浓度具有明显统计学差异,肺癌患者外周血中Chemerin的浓度(1 965.81 pg/mL±374.03 pg/mL)显著高于健康体检者(1 111.44 pg/mL±250.72 pg/mL)(P＜0.001).肺癌患者外周血Chemerin浓度与各临床病理指标间均无统计学差异.结论 Chemerin可能具有作为肺癌的诊断标记的潜力.     

Neuropilin-1在非小细胞肺癌患者外周血Treg、PDC细胞中的表达及临床意义

目的 探讨NRP-1在非小细胞肺癌患者外周血Treg、PDC细胞中的表达及临床意义。方法 收集49例确诊为非小细胞肺癌患者的外周血,33例健康体检者作为对照组,流式细胞仪检测Treg、PDC细胞上NRP-l的表达。结果 NRP-1在NSCLC患者外周血Treg细胞的表达率明显高于健康体检者（P<0.05）;NRP-1在NSCLC患者外周血Treg中的表达与肿瘤最大径、有无淋巴结转移、TNM分期、分化程度有关（P<0.05）;NRP-1在NSCLC患者外周血PDC中的表达与肿瘤最大径、有无淋巴结转移、TNM分期有关（P<0.05）。结论 NRP-1在外周血Treg、PDC细胞的表达可能与非小细胞肺癌免疫调节相关,可能作为用于预测NSCLC患者预后的肿瘤标志物,并有可能成为肺癌治疗的新靶点。     

20例肝癌初治患者外周血循环肿瘤细胞计数及其临床意义

摘 要：［目的］ 探讨外周血循环肿瘤细胞(circulating tumor cells,CTCs)计数与肝癌初治患者基线临床资料的关系。［方法］ 选取20 例肝癌患者的外周血液样本,每例7.5ml,通过ClearCell CTC分离仪分离出具有完整生物学活性的CTCs进行DAPI、CD45、CK18染色,然后对DAPI+、CK18+、CD45-的CTCs细胞进行计数,并结合患者的巴塞罗那 (BCLC)分期、有无远处转移、有无门静脉癌栓、甲胎蛋白(AFP)水平等基线临床资料进行分析。［结果］ 20例肝癌患者平均（24.8±17.2）个CTCs/7.5ml外周血。CTCs计数与甲胎蛋白≥400ng/ml(P<0.05),远处转移(P<0.05)及BCLC分期B(P<0.05)有关。［结论］ 外周血CTCs数目的多少与肝癌初治患者的AFP水平、BCLC分期、远处转移等有关。临床上检测患者的外周血CTCs可作为一种辅助诊断工具,但其与患者转移风险及预后的关系有待进一步研究及大规模的样本验证。     

晚期非小细胞肺癌循环肿瘤细胞的测定及其意义

摘 要：［目的］ 分析晚期非小细胞肺癌患者外周血循环肿瘤细胞（circulating tumor cells,CTCs）与临床特征、肿瘤标志物间的相关性。［方法］ 收集2016年7月至2017年4月徐州医科大学第二附属医院经病理证实的36例晚期非小细胞肺癌患者的临床、病理等资料以及10位健康志愿者。所有研究对象均行外周血循环肿瘤细胞检测,采用免疫磁珠阴性富集技术分离CTCs,利用荧光原位杂交和免疫荧光染色鉴别CTCs,在荧光显微镜下观察并统计CTCs。［结果］ 36例非小细胞肺癌患者的循环肿瘤细胞水平明显高于健康志愿者（P=0.000）。单因素分析结果显示,晚期非小细胞肺癌外周血CTCs与临床分期(P=0.010)、远处转移(P=0.006)以及远处转移个数(P=0.018 )相关。多因素回归分析结果则显示,仅远处转移与 CTCs 的阳性表达具有相关性(P=0.011)。CTCs阳性表达与CEA、SCCA、NSE无关( P＞0．05),但CYFRA21-1组的CTCs阳性率明显高于正常组(P=0.034)。［结论］ CTCs在晚期非小细胞肺癌中的表达与远处转移密切相关,且CTCs与传统肿瘤标志物的联合应用可为疾病复发和转移提供依据。     

胃肠肿瘤患者手术前后外周血survivin mRNA定量检测的临床意义

 目的研究胃肠肿瘤患者手术前后外周血survivin mRNA表达量的变化 ,分析其与复发转移的关系。方法采用 实时荧光定量 RT - PCR检测40例胃肠肿瘤患者手术前后外周血survivin mRNA表达量,并进行6月的随访;同时以10 例患胆石症或阑尾炎的非癌手术病人作为对照。结果40例胃肠肿瘤患者,手术前后外周血survivin mRNA阳性率分 别为87.5%和45%,两者比较差异有统计学意义(P<0.01）;5例术前未检出survivin mRNA表达的患者术后均未检出 ;35例survivin mRNA阳性表达的患者中术后17例未检出,12例survivin mRNA水平明显低于术前,6例survivin mRNA水平增高; 6例术后survivin mRNA水平增高的患者在随访6月内有4例出现明显的肝转移。结论检测手术前后 外周血survivin mRNA水平的变化,可作为观察胃肠肿瘤术后复发转移的一种非侵入性、可测量的客观指标。