兔血管平滑肌细胞三维培养模型的建立

目的 观察兔血管平滑肌细胞（VSMCs)在三维培养系统中的生物学特性,方法 在兔主动脉中膜来源的VSMCs单层培养系统的基础上,将VSMCs培养在胶原凝胶中,形成VSMCs三维培养系统,并对细胞的形态结构,生长增殖及其影响因素进行研究。结果（1）三维培养VSMCs在凝胶形成后3－4h,形成多个细胞突起,呈星状,后继续伸展,呈梭 ,纺锤形,（2）张力条件下,三维培养VSMCs可呈一定的方向性排列。（3）三维培养VSMCs与经典的单层培养相比,细胞活力无统计学差异,但细胞增殖受到一定程度的抑制。结论 运用VSMCs三维培养系统不仅可以观察和研究细胞的形态结构,生长增殖等方面,还可研究在力条件下的撑特征,对组织工程化血的研究将产生积极的影响。     

与血管平滑肌细胞联合培养的内皮细胞外基质构筑及含量的变化

目的：探讨联合培养的血管平滑肌细胞（ＶＳＭＣ）对内皮细胞（ＥＣ）粘附能力的影响。方法：应用免疫荧光细胞化学、激光共聚焦扫描显微镜和图像分析等技术,以静态条件下单独培养的ＥＣ为对照组,观察与ＶＳＭＣ联合培养的ＥＣ细胞外基质Ｆｎ,Ｌｎ和ＣｏｌⅣ的构筑方式及其含量的变化。结果：与单独培养的ＥＣ相比,联合培养的ＥＣ细胞外基质各组分的构筑有明显的变化,且含量也发生变化,Ｆｎ,Ｌｎ增多,ＣｏｌⅣ减少。结论：与ＶＳＭＣ联合培养的ＥＣ的粘附能力可能增强,为改进血管ＥＣ种植的组织工程技术提供了部分实验依据。     

血管内皮和平滑肌细胞联合培养构建组织工程化血管的方法

目的：探讨组织工程血管种子细胞原代培养、传代扩增、鉴定的方法，为组织工程血管的构建提供理想的种子细胞。方法：无菌条件下取正常产妇分娩的脐带动静脉，ROSS法（即组织贴块法）原代培养混合血管细胞。倒置相差显微镜、免疫组化法对细胞进行鉴定。结果：倒置显微镜显示原代细胞及经传代培养后的细胞，呈现内皮样细胞、平滑肌样细胞混合生长的特征。免疫组化法检测示内皮细胞Ⅷ因子、平滑肌细胞α-肌动蛋白呈阳性反应。细胞经3次～5次传代，数量可增殖达到8×10^6—10×10^6。结论：使用组织贴块法原代培养可获得内皮细胞、平滑肌细胞混合体，细胞经体外联合培养、传代可以达到组织工程血管种子细胞所需的数量。     

切应力作用下与血管平滑肌细胞联合培养的内皮细胞的形态学

目的：观察生理切应力作用下与血管平滑肌细胞联合培养的内皮细胞的抗应力能力。方法：应用内皮细胞与血管平滑肌细胞联合培养模型和流动腔系统,以倒置相差显微镜及电镜观察生理切应力作用下的联合培养的内皮细胞的形态及超微结构。结果：０．２ｍＮ／ｃｍ＾２和０．４ｍＮ／ｃｍ＾２切应力作用２４ｈ,绝大多数内皮细胞均沿切应力方向发生重排,细胞内肌动蛋白微丝形成与切应力方向平行的应力纤维。２４ｈ后,内皮细胞未见明显脱落。结论：联合培养条件下,内皮细胞重排程度与切应力大小有关。切应力越大,重排程度越高,提示内皮细胞抗应力能力增强。     

切应力作用下与血管平滑肌细胞联合培养的内皮细胞的前列环素分泌变化

目的：研究切应力作用下与血管平滑肌细胞联合培养的内皮细胞的抗凝血功能。方法：应用流动腔系统,对与平滑肌细胞联合培养的同皮细胞施加生理大小的切应力,以放免分析法检测内皮细胞分泌ＰＧＩ２的变化。结果：ＰＧＩ２峰值释放速率及稳定释放速率随切应力的增大而增高,峰值释放速率的衰减常数（ｔ１／２）随切应力的增大而减小。结论：切应力作用下,与平滑肌细胞联合培养的内皮细胞的抗凝血功能增强。     

联合培养的内皮细胞对平滑肌细胞增殖和形态的影响

目的探索体外培养和扩增同一来源内皮细胞和平滑肌细胞的有效方法,研究联合培养的内皮细胞对平滑肌细胞形态和增殖的影响。为研究内皮细胞和平滑肌细胞相互关系和体外构建组织工程血管提供理论和实践基础。方法在体外用酶消化法和组织块贴壁法分别建立内皮细胞和平滑肌细胞的原代,并应用胰蛋白酶和乙二胺四乙酸钠传代培养。应用光镜、透射电镜、细胞计数和MTY法对内皮细胞和平滑肌细胞的形态和代谢进行研究。模拟血管壁的内层结构及内皮细胞和平滑肌细胞间的相互影响途径,建立以聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）膜为介质的内皮细胞与平滑肌细胞联合培养模型。分3组：内皮细胞／平滑肌细胞、平滑肌细胞／平滑肌细胞和空白／平滑肌细胞,应用。H—TdR掺入法研究联合培养的内皮细胞对平滑肌细胞增殖的影响。结果酶消化法和植块培养法可以有效地建立起内皮细胞和平滑肌细胞的原代。内皮细胞对联合培养的平滑肌细胞早期增殖有促进作用,晚期则增殖缓慢。结论以PET膜为介炙联合培养同一来源的内皮细胞和平滑肌细胞的新模型是研究两者间相互影响的良好模型。内皮细胞和平滑肌细胞作为血管构成的基本细胞,对于它们的形态学、体外培养和扩增以及相互关系的研究具有重要的意义。     

血管内皮细胞对血管平滑肌细胞影响的研究进展

血管内皮细胞(VECs)和血管平滑肌细胞(VSMCs)是血管壁的主要组成细胞。VECs能够保护血管内环境、维持血压以及调节血管运动,是维持血管生理功能平衡的关键。VSMCs可通过舒张和收缩改变血管直径使血管保持适当血压。VECs与VSMCs相邻,它能最先感知血液中的刺激影响VSMCs,进而影响血管的生理状态。在病理条件下,VECs发生损伤和功能失调,导致VSMCs表型转换、增殖及凋亡,进而引发多种心血管疾病。目前,VECs对VSMCs的影响受到越来越多学者的关注,而VECs功能失调对VSMCs的影响与动脉粥样硬化形成之间的关系是今后研究的重点。     

小鼠血管平滑肌细胞原代培养方法的改良

目的建立一种简单方便但高效的血管平滑肌细胞原代培养方法。方法改良酶消化法。结果用该法培养细胞传代生长快,细胞纯度达98%以上,足以满足各种细胞试验需求。结论与传统方法相比该法简单经济,试验成功率高,节省材料和时间,而且可获得更多纯度较高的细胞。     

动脉粥样硬化模型小鼠血管平滑肌细胞原代培养及鉴定

目的:介绍动脉粥样硬化模型小鼠血管平滑肌细胞(VSMC)原代培养及鉴定的方法。方法:分离载脂蛋白E基因敲除小鼠主动脉,组织贴块法获得原代平滑肌细胞,免疫荧光及免疫组化方法检测细胞的纯度和分化状态。结果:培养第3天时,可见自组织块周围长出少量梭形或长梭形细胞,至培养2周细胞融合成片,呈"峰、谷"状生长。肌动蛋白免疫组化及荧光染色显示,细胞传至第6代后纯度在98%以上,证实应用此方法分离原代VSMC可以满足平滑肌体外功能实验的需求。结论:应用组织贴块法培养小鼠VSMC,操作简单,结果稳定,纯度较高,具有推广应用价值。     

内皮细胞和平滑肌细胞在微孔聚碳酸酯膜上共培养模型方法

目的 探讨主动脉内皮细胞（EC）和平滑肌细胞（SMC）共培养模型，为下一步研究两之间的电生理活动提供基础。方法 采用微孔聚碳酸酯膜（polycarbonate filter membrane）作为载体，将EC和SMC接种于微孔膜的两侧，建立EC和SMC联合培养模型，模拟血管壁EC和SMC间的结构关系，采用倒置显微镜和透射电镜进行观察。结果 共培养的EC和SMC组织结构关系类似于体内，EC呈单层生长，而SMC呈多层生长，同类和异类细胞间都有缝隙连接形成，缝隙连接的形成与培养的时间有关，在SMC接种后24h，EC可以通过微孔与SMC形成缝隙连接。结论 此种EC和SMC共培养模型模拟了在体时EC和SMC之间的结构关系，可以用来研究两种细胞间的相互影响。     

人原代肺动脉内皮-平滑肌接触式共培养方法的技术改进

目的：改进人肺动脉内皮细胞（human pulmonary artery endothelial cells,HPAECs）-人肺动脉平滑肌细胞（human pulmonary artery smooth muscle cells,HPASMCs）接触式共培养方法,为更好模拟体内两种细胞间相互作用提供研究平台。方法：采用微孔聚碳酸酯膜为载体,将HPAECs和HPASMCs接种于微孔膜两侧,建立HPAECs-HPASMCs联合培养模型以模拟正常血管壁两种细胞的结构关系,通过调整细胞种植密度、培养时间、培养液体系、培养基种类、血清浓度等,倒置相差显微镜、Hoechst染色及流式细胞术比较不同条件下接触式共培养模型中细胞贴壁、生长和凋亡的差异,免疫荧光染色观察优化共培养条件后细胞标记物的表达变化。结果：①明胶预包被Transwell膜可促进内皮细胞的黏附和生长;②渗透压升高增加内皮细胞凋亡;③内皮细胞培养基较DMEM、RPMI1640更有利于接触式共培养模型的建立;④内皮细胞生长因子为1%、胎牛血清为2%时两种细胞生长稳定;⑤优化共培养条件对两种细胞的自身特性无显著影响。结论：当培养体系为内皮细胞培养基、维持1%内皮细胞生长因子及2%胎牛血清组分条件,可建立稳定的HPAECs-HPASMCs接触式共培养模型,为体外模拟人肺动脉血管壁结构功能和研究两种细胞间相互作用构建了良好平台。     

诱导小鼠胚胎干细胞分化获取血管平滑肌和内皮细胞

目的 探讨从诱导分化的小鼠胚胎于细胞中获取体外构建组织工程化血管种子细胞的可行性.方法 利用Flk-1作为小鼠胚胎干细胞分化来源的血管前体细胞标志,流式细胞仪分选分化的类胚体中Flk-1阳性细胞,分别添加血小板源生长因子(PDGF)、血管内皮生长因子(VEGF),诱导血管前体细胞向血管平滑肌细胞和血管内皮细胞分化.免疫荧光染色鉴定诱导分化后细胞的相关标志表达;流式细胞仪分析诱导分化后细胞的分化效率和纯度.结果 流式细胞仪分析显示,在分化第4天类胚体中有50%左右的细胞表达Flk-1,经分选的Flk-1阳性细胞通过进一步诱导,可以得到(95.9±3.5)% α-SMA阳性的血管平滑肌细胞和(59.1±4.8)%CD31阳性的血管内皮细胞.结论 成功应用流式细胞分选法从诱导分化的小鼠胚胎干细胞中获取血管平滑肌细胞和血管内皮细胞,实验为组织工程化血管构建中种子细胞来源提供了新途径.     

诱导小鼠胚胎干细胞分化获取血管平滑肌和内皮细胞

目的 探讨从诱导分化的小鼠胚胎于细胞中获取体外构建组织工程化血管种子细胞的可行性.方法 利用Flk-1作为小鼠胚胎干细胞分化来源的血管前体细胞标志,流式细胞仪分选分化的类胚体中Flk-1阳性细胞,分别添加血小板源生长因子(PDGF)、血管内皮生长因子(VEGF),诱导血管前体细胞向血管平滑肌细胞和血管内皮细胞分化.免疫荧光染色鉴定诱导分化后细胞的相关标志表达;流式细胞仪分析诱导分化后细胞的分化效率和纯度.结果 流式细胞仪分析显示,在分化第4天类胚体中有50%左右的细胞表达Flk-1,经分选的Flk-1阳性细胞通过进一步诱导,可以得到(95.9±3.5)% α-SMA阳性的血管平滑肌细胞和(59.1±4.8)%CD31阳性的血管内皮细胞.结论 成功应用流式细胞分选法从诱导分化的小鼠胚胎干细胞中获取血管平滑肌细胞和血管内皮细胞,实验为组织工程化血管构建中种子细胞来源提供了新途径.     

成骨细胞与血管内皮细胞直接混合培养的体外实验研究

目的　通过观察不同比例和不同时间成骨细胞和血管内皮细胞直接混合培养时细胞增殖和功能的变化 ,选择适宜的两种细胞直接混合培养比例及时间 ,为骨组织工程血管化研究提供理论基础。方法　取兔骨膜成骨细胞 (RPOB)和肾血管内皮细胞 (RRVEC) ,以成骨和内皮细胞数目比 1∶2 ,1∶1和 2∶1直接混合培养 4 ,8,12d ,通过细胞计数、碱性磷酸酶 (ALP)活性测定及　3 H -脯氨酸掺入试验观察细胞增殖分化能力及功能状态。结果　 2∶1组细胞 4d增殖最活跃 (P <0 .0 5 ) ,8d和 12d细胞增殖减慢。ALP活性和　3 H -脯氨酸掺入呈时间依赖性增长 ,其中共培养 12dALP活性组间无差异 ,但　3 H -脯氨酸掺入较高 ,与其他各组差异显著 (P <0 .0 5 )。结论　成骨细胞和血管内皮细胞 2∶1直接混合培养 12d ,功能活跃 ,适宜组织工程研究。     

Different responses of cell cycle between rat vascular smooth muscle cells and vascular endothelial cells to paclitaxel

Summary： Although previous reports showed dmg-eluting stent （DES） could effectively inhibit neointima formation, in-stent restenosis （ISR） remains an important obstacle. The purpose of this study was to investigate different effects of paclitaxel on proliferation and cell cycle regulators between vascular smooth muscle cells （VSMCs） and vascular endothelial cells （VECs） of rats in vitro. The cultured VSMCs and VECs of rats from the same tissues were examined by using immunohistochemistry, flow cytometry and Western blotting in control and paclitaxel-treated groups. The results showed paclitaxel could effectively inhibit proliferation of VSMCs and VECs. However, as compared with VECs, prolif- eration of VSMCs in paclitaxel-treated group decreased less rapidly. The percentage of cells in G0-G1 and G2-M phases was reduced, and that in S phase increased after treatment for 72 h. The expression of cyclin D1 and B1, p27 and PCNA in VSMCs of paclitaxel-treated group was up-regulated, but that of p21 down-regulated as compared with VECs. It is concluded that there are significant differences in the expression of cell cycle regulators and proliferation rate between paclitaxel-treated VSMCs and paclitaxel-treated VECs, suggesting that the G1 S checkpoint regulated by paclitaxel may play a critical role in the development of complications of DES, which provides new strategies for treatments of ISR.     

人脐动脉内皮细胞-平滑肌细胞共培养模型的建立及鉴定

 目的 建立人脐动脉内皮细胞-平滑肌细胞共培养模型,以体外模拟人动脉壁,为动脉粥样硬化及炎症等疾病的发病机制和治疗研究打下基础。方法 采用胶原酶灌注消化法从人脐动脉中原代培养获得人脐动脉内皮细胞（human umbilical artery endothelial cell,HUAEC）,采用组织块贴块法从人脐动脉中原代培养获得人脐动脉平滑肌细胞（human umbilical artery smooth muscle cell,HUASMC）。用含有抗坏血酸（≥50 μg/mL）的培养基孵育平滑肌细胞,使之合成并分泌胶原蛋白,形成内皮细胞的生长基质;然后将内皮细胞以饱和密度接种到平滑肌细胞上,使内皮细胞和平滑肌细胞直接接触并整合形成内皮细胞-平滑肌细胞共培养（EC-SMC co-culture）模型。分别用免疫荧光染色和Dil-Ac-LDL吞噬实验对共培养模型进行形态学和功能学的鉴定。结果 形态学鉴定结果显示,两种细胞已成功整合,模拟出体内动脉壁的形态。Dil-Ac-LDL吞噬实验的结果显示共培养模型的内皮细胞中有荧光信号,并且共培养模型中内皮细胞Dil-Ac-LDL的内吞量显著高于单纯内皮细胞（EC monoculture or EC monolayer）,证明共培养模型中内皮细胞与平滑肌细胞已建立联系。结论 本实验成功建立人脐动脉内皮细胞-平滑肌细胞共培养模型,可在体外更好地模拟人动脉壁形态和基本功能。     

内皮祖细胞对血管平滑肌细胞增殖的影响

目的：观察内皮祖细胞(endothelial progenitor cell,EPCs)对血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell,VSMCs)增殖的影响。方法：采用6%羟乙基淀粉沉降红细胞和密度梯度离心法分离人脐血单个核细胞,EGM-2细胞培养基进行培养,诱导单个核细胞贴壁并向EPCs分化;采用荧光显微镜双染色、流式细胞术鉴定EPCs,间接免疫荧光检测VSMCs收缩表型标志物α-SM-actin和calponin的表达;Transwell培养板建立早期EPCs和大鼠VSMCs共培养模式,以20%胎牛血清刺激VSMCs增殖,分别共培养6,12,24,48,72 h后收集VSMCs,采用BrdU标记法、蛋白定量、流式细胞术分析VSMCs DNA合成能力、细胞总蛋白含量以及细胞周期进程。结果：从脐血单个核细胞成功培养了EPCs。EPCs和大鼠VSMCs共培养12,24,48,72 h后,VSMCs DNA合成能力、细胞总蛋白含量均较对照组明显降低(P＜0.05),其中以48 h最明显;流式细胞术显示,共培养组VSMCs细胞周期中S期细胞所占百分率较对照组显著降低(P＜0.05),而细胞周期中G1期细胞所占百分率均相应高于对照组(P＜0.05),其中均以48 h最明显。结论：早期EPCs能够抑制VSMCs增殖。