NY-ESO-1/GST融合蛋白在大肠杆菌的表达、纯化及鉴定

目的:构建肿瘤-睾丸抗原NY-ESO-1与GST融合基因的原核表达载体,在大肠杆菌中表达并对融合蛋白NY-ESO-1/GST进行纯化和初步鉴定。方法:设计针对NY-ESO-1的特异性引物,采用聚合酶链反应(PCR)从睾丸组织的cDNA文库扩增NY-ESO-1基因片段,经上下游引物所引入的EcoR I和Xho I双酶切后克隆入原核表达载体pGEX-4T1中GST标签的下游,构建重组表达载体pGEX-4T1-NY-ESO-1,并将该载体转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中,IPTG诱导表达NY-ESO-1/GST融合蛋白,经不同浓度尿素洗脱纯化后,表达产物通过SDS-PAGE和Western blot法进行鉴定。结果:重组质粒经限制性内切酶EcoR I和Xho I双酶切鉴定和IPTG诱导表达NY-ESO-1/GST的SDS-PAGE分析表明,表达产物的相对分子质量(Mr)为44 000,与理论值相符,并主要以包涵体形式存在,灰度扫描分析显示融合蛋白表达量占菌体蛋白总量的90%,Western blot结果证实该NY-ESO-1/GST可与抗GST单克隆抗体(mAb)发生特异性结合反应,提示为融合蛋白。结论:成功构建了NY-ESO-1基因原核表达载体pGEX-4T1-NY-ESO-1,利用大肠杆菌表达系统,获得了较高纯度的包涵体形式NY-ESO-1/GST融合蛋白。     

β-hCG蛋白在大肠杆菌系统的表达、纯化及活性鉴定

目的 获得β-人绒毛膜促性腺激素(β-hCG)融合蛋白β-hCG/GST并验证其抗原活性.方法 利用PCR法扩增β-hCG全长基因,将其克隆至原核表达载体pET-42a中,构建重组质粒pET-42a-β-hCG,将该重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)中IPTG诱导表达,经SDS-PAGE分析,亲和层析法纯化融合蛋白,目的蛋白用Western blot法鉴定,ELISA检测纯化得到的融合蛋白的抗原活性.结果 测序结果证实成功扩增出目的基因β-hCG;酶切和测序结果证实pET-42a-β-hCG原核表达载体构建成功;转化后可以成功诱导并纯化出大小与预期一致的蛋白;Western blot法及ELISA检测证实纯化后的β-hCG/GST融合蛋白具有良好的免疫原性.结论 成功获得β-hCG/GST融合蛋白,该蛋白具有良好的免疫原性,为以β-hCG为靶位的抗肿瘤主动免疫治疗研究奠定了基础.     

MAGE-D4a融合蛋白的原核表达、纯化及鉴定

目的:构建肿瘤相关抗原MAGE-D4a的原核重组体系,表达、纯化融合蛋白。方法:PCR法从胶质瘤组织cDNA中扩增MAGE-D4a基因全长编码区,连接入原核表达载体pMAL-c2,筛选、鉴定阳性克隆并测序。将重组质粒转化至大肠杆菌Rosetta(DE3)诱导表达,表达产物经AmyloseResin亲和层析分离纯化,并且对纯化的融合蛋白进行质谱鉴定。结果:成功扩增了MAGE-D4a基因;重组质粒在Rosetta大肠杆菌中诱导表达出MBP/MAGE-D4a融合蛋白;优化了MAGE-D4a原核表达体系的最适条件;蛋白质谱分析结果显示表达的基因重组蛋白与目的蛋白相符。结论:获得了高效表达、可溶性的MAGE-D4a重组蛋白,为抗体的制备及血清学分析奠定了基础。     

幽门螺杆菌cag4蛋白的原核表达、纯化及鉴定

目的:构建幽门螺杆菌cag4蛋白的原核重组体系,表达、纯化融合蛋白。方法:利用PCR技术从幽门螺杆菌NCTC11637中克隆了cag4基因;经T-A克隆,酶切鉴定,构建了原核表达载体pET-28a-cag4;经测序鉴定正确后,转化进入大肠埃希菌BL21(DE3)进行异源表达。利用IPTG体外诱导后,经SDS-PAGE和Western bolt鉴定目的蛋白表达后,采用Ni2+-NTA柱在变性条件下纯化目的蛋白,并对重组蛋白进行透析复性处理。将SDS煮沸法获得的溶壁微球菌肽聚糖掺入SDS-PAGE作为底物,进行酶谱分析。结果:成功扩增了cag4基因基因;重组质粒在大肠埃希菌BL21(DE3)中诱导表达出pET-28a-cag4融合蛋白;优化了pET-28a-cag4原核表达体系的最适条件;Western bolt分析结果显示表达的基因重组蛋白与目的蛋白相符;酶谱分析显示其具有明显的肽聚糖水解活性。结论:幽门螺杆菌cag4蛋白具有溶菌糖基转移酶活性。     

Nogo-66融合蛋白的原核表达及鉴定

目的原核表达轴突再生抑制蛋白Nogo-66,并对其进行鉴定。方法采用聚合酶链反应方法从含Nogo-66编码序列的质粒DNA中扩增出Nogo-66基因开放阅读框,构建原核表达载体,转化大肠杆菌,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,裂解细菌抽提蛋白,表达产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、Western免疫印迹鉴定。结果测序鉴定Nogo-66开放阅读框成功插入pET-46-EK/LIC质粒;重组质粒在大肠杆菌中成功表达大鼠Nogo-66蛋白,SDS-PAGE测定其相对分子质量(Mr)约7000,WesternBlot结果证实表达产物融合有聚组氨酸标签。结论应用原核表达系统成功表达了Nogo-66蛋白,为下一步制备Nogo-66蛋白疫苗及疫苗功能研究打下了基础。     

氯霉素乙酰基转移酶融合蛋白表达、纯化和鉴定

目的对氯霉素乙酰基转移酶(Chloramphenicol acetyltransferase,CAT)基因进行表达和纯化.方法通过PCR扩增编码CAT氨基酸序列的基因片断,并将之克隆入pGEX-2T载体.IPTG诱导蛋白融合表达,产物经琼脂糖亲和层析树脂纯化.免疫印迹鉴定纯化蛋白的抗原性.结果筛选得到的重组子诱导后表达相对分子质量约为52 600的CAT融合蛋白.树脂纯化及酶切后均得到高纯度的蛋白样品.纯化蛋白能与抗CAT抗体特异结合.结论本研究获得了CAT基因的融合表达蛋白,并对其完成纯化,为制备抗血清和抗体打下基础.     

人survivin蛋白的原核表达、纯化及抗原活性鉴定

目的 构建人肿瘤抗原survivin的原核表达载体,优化在大肠杆菌中的表达条件,并对survivin/His融合蛋白进行纯化和抗原活性鉴定.方法 设计针对survivin基因序列的特异引物,通过聚合酶链式反应(PCR)扩增人survivin全长基因序列(538 bp)克隆至原核表达载体pET28a(+),构建重组表达载体pET28 a-survivin,并将该载体转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达survivin/His融合蛋白,并采用Ni亲和层析凝胶纯化重组蛋白.纯化后的重组蛋白经Western blot法、ELISA鉴定其抗原活性.结果 重组表达载体经BamH Ⅰ和HindⅢ鉴定正确;IPTG诱导后经SDS-PAGE分析表明获得了相对分子质量(Mr)24000大小的重组蛋白;纯化后的蛋白纯度达到90％.Western blot法和ELISA检测证实纯化的survivin蛋白能够与特异性抗体发生反应,表明其具有良好的抗原活性.结论 成功构建了原核表达载体pET28 a-survivin,利用大肠杆菌表达系统实现了融合蛋白的可溶性表达并进行纯化,纯化后survivin蛋白经鉴定具备较高的抗原活性.     

截短型BAP31/GST基因重组质粒的构建及融合蛋白的表达、纯化和鉴定

目的构建编码截短型肿瘤抗原BAP31(△BAP31)与GST融合基因的原核表达载体,在大肠杆菌中表达并对融合蛋白(△BAP31/GST)进行纯化和初步鉴定。方法 PCR扩增编码△BAP31的基因片段,上下游分别引入EcoR I及Xho I酶切位点,亚克隆至含有GST标签的原核表达载体pGEX4T-1中,构建重组表达载体pGEX4T1-△BAP31,将该载体转化大肠杆菌DH5α,IPTG诱导表达△BAP31/GST,用GST亲和层析分离纯化原核表达的△BAP31/GST,表达产物分别用SDS-PAGE和West-ern blot进行鉴定。结果重组质粒经限制性内切酶EcoR I和Xho I双酶切鉴定和IPTG诱导表达△BAP31/GST的SDS-PAGE分析表明,表达产物的相对分子质量为40 000,与理论值相符,并主要以可溶性蛋白形式存在;经过对融合蛋白表达条件的优化,在IPTG浓度为1 mmol/L,诱导6 h目的蛋白表达量最高;灰度扫描分析发现,融合蛋白表达量占菌体蛋白总量的70.6%,纯化产物的纯度最高可达94.5%,Western blot证实该△BAP31/GST可与抗GST单克隆抗体(mAb)发生特异性结合反应,分子量为△BAP31与GST分子量之和,提示为融合蛋白。结论成功构建了编码△BAP31基因原核表达载体pGEX4T1-△BAP31,利用大肠杆菌表达系统和GST亲和层析,获得了较高纯度的△BAP31/GST融合蛋白,为进一步研究肿瘤抗原BAP31的功能及开发以BAP31作为靶点的肿瘤疫苗提供了试验基础。     

人GST-PTEN融合蛋白的原核表达和纯化

目的构建人第10号染色体上磷酸酶和张力蛋白同源缺失的基因(phosphatase and tensin homology deleted on chromosome ten,PTEN)原核表达质粒,使其在原核细胞中高效表达并进行纯化。方法将全长片段插入原核表达载体pGEX-4T-1,构建重组子pGEX-4T-1-PTEN,转化BL-21感受态细胞。经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达PTEN融合蛋白的可诱导性表达,通过SDS-PAGE电泳、Western印迹分析证实蛋白表达的特异性。并用谷胱甘肽-S-转移酶(glutathione-Stransferase,GST)亲和层析对融合蛋白进行纯化。结果成功构建了原核表达载体pGEX-4T-1-PTEN,并将PTEN融合蛋白的成功表达,通过SDS-PAGE电泳、Western印迹分析,证实了蛋白表达的特异性。并对蛋白进行了纯化,获得了GST-PTEN融合蛋白的纯品。结论成功表达、纯化了GST-PTEN融合蛋白,为进一步研究PTEN蛋白的功能及其与其它功能性蛋白的相互作用研究奠定了基础。     

TRPM2蛋白在大肠杆菌的表达纯化和多克隆抗体制备

目的 获得人瞬时受体电位M2(TRPM2)离子通道蛋白N末端的原核表达融合蛋白,制备兔抗人TRPM2多克隆抗体.方法 采用PCR扩增编码人TRPM2蛋白N末端l～334位氨基酸残基(在人与小鼠中高度保守)的cDNA序列,将其克隆至谷胱甘肽硫转移酶(GST)融合蛋白表达质粒pGEX-4T-3上.将原核表达重组质粒转化BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导GST-TRPM2N融合蛋白的表达,并纯化获得相对分子质量(Mr)约70 000的GST-TRPM2融合蛋白.将此融合蛋白与弗氏完全佐剂混合后采用经典的4次免疫法免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,用Western blot法对该抗体进行鉴定.结果 通过PCR扩增获得编码TRPM2蛋白N末端的cDNA片段并将其定向克隆至原核表达载体pGEX-4T3中,采用IPTG诱导、蛋白质的变性与复性纯化获得融合蛋白GST-TRPM2N,将纯化的融合蛋白免疫新西兰大白兔,制备获得特异性抗TRPM2蛋白的多克隆抗体.结论 成功制备了特异性抗人TRPM2蛋白的多克隆抗体.     

Prokaryotic expression, purification and identification of VEGFR2 D3.4/GST fusion protein in E.coli

AIM: To construct a prokaryotic expression vector for the expression of VEGFR2 D3.4/GST fusion protein, Express and purify the fusion protein. METHODS: The coding sequence of the third and fourth extracellular domain of human VEGFR2 gene fragment was synthesized and subcloned into pGEX4T-1 vector downstream of the GST fragment, an E.coli expression vector, to construct a recombinant plasmid pGEX4T-VEGFR D3.4. Then the plasmid was transformed into E.coli BL21 (DE3) pLysS and induced to express fusion protein VEGFR2 D3.4/GST with IPTG. The expressed protein was purified by washing in urea and detected by SDS-PAGE and Western blot. RESULTS: SDS-PAGE analysis showed that a novel protein with the expected molecular mass (M(r);) about 46 000 was expressed with the inducement of IPTG. And it existed mostly in the form of inclusion body. Grayscale scanning showed that the expressed VEGFR2 D3.4/GST fusion protein accounted for 38.6% of the total bacterium protein. After the purified product was washed by urea, its purity reached 87.1%. Western blot confirmed the recombinant protein was VEGFR2 D3.4/GST fusion protein. CONCLUSION: High purification VEGFR2 D3.4/GST fusion protein is obtained through the E.coli expression system.     

重组葡激酶-人HC蛋白融合蛋白的原核表达、纯化及鉴定

目的:表达和纯化重组葡激酶-人HC蛋白融合蛋白,并初步鉴定其生物学活性.方法:利用重叠延伸PCR方法使基因重组获得目的基因片段,插入带有GST标签的原核高效可溶性表达载体pEGX-6P-1中,构建重组表达质粒pEGX-6P-1-SAK-HC,将重组表达质粒转化大肠杆菌B834,经IPTG诱导目的蛋白表达;对融合蛋白用谷胱甘肽琼脂糖凝胶柱(GST)亲和层析柱及DEAE离子交换柱纯化,用PreScission蛋白酶切除GST标签,SDS-PAGE分析该融合蛋白的表达量和纯度,应用纤维蛋白平板溶圈法测定评价其生物学活性.结果:构建的重组表达质粒经PCR、内切酶鉴定及基因序列测定证实,目的蛋白在大肠杆菌中获得表达,SDS-PAGE显示相对分子质量(Mr)为36000;对表达产物进行了亲和层析纯化,从上清中获得了纯度较高的葡激酶-人HC蛋白融合蛋白,体外实验显示其纤溶活性为9.4×104 IU/mg.结论:获得了可溶性的葡激酶-人HC蛋白融合蛋白,且其纤溶活性与尿激酶标准品相当.为下一步进行融合蛋白免疫原性鉴定奠定了基础.     

HPV11型L2E7融合蛋白的原核表达及其免疫效果观察

目的构建人乳头瘤病毒11型L2E7原核表达系统pET9aHPV11L2E7，并纯化蛋白进行小鼠免疫效果研究。方法从尖锐湿疣组织中扩增人乳头瘤病毒11型12、E7基因片段，构建DET9aHPV11L2E7原核表达重组质粒并测序，在大肠埃希菌宿主菌BL21（DE3＋）中经IPTG诱导表达融合蛋白L2E7（553个氨基酸），经SDS—PAGE电泳和Western Blot进行鉴定。CM离子交换介质纯化蛋白免疫BALB／c小鼠，进行细胞免疫水平和体液免疫水平的检测。结果成功构建了pET9 aHPV11L2E7原核表达系统，纯化获得的HPV11L2E7蛋白免疫BALB／c小鼠后能检测到针对HPV11E7特异性的细胞免疫，血清中能检测到高效价抗HPV11L2E7抗体。结论纯化的HPV11L2E7融合蛋白能够引发特异性细胞和体液免疫反应，能作为尖锐湿疣免疫治疗候选疫苗。     

结核分枝杆菌Ag85B/IL-2-GST融合蛋白表达质粒的构建及原核表达

卡介苗（BCG）膀胱灌注是治疗表浅型膀胱肿瘤及预防其复发最有效的方法之一,BCG联合IL-2治疗膀胱肿瘤具有更好的临床疗效。无论是BCG还是IL-2在临床治疗膀胱癌均存在着剂量大、疗程长、毒副作用大等缺点。     

大肠腺癌中Sema4D和VEGFR2的表达及意义

目的探讨Sema4D和血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)在大肠腺癌组织中的表达及其临床意义。方法运用组织芯片和免疫组化SP法检测115例大肠腺癌组织、19例大肠腺瘤组织和12例正常大肠黏膜组织中Sema4D与VEGFR2的表达,并分析其与临床病理特征的关系。结果 Sema4D在正常大肠黏膜表达阳性率8.33%,在腺瘤和腺癌中阳性表达率为15.79%和39.13%,差异有统计学意义且与淋巴结转移、Dukes临床分期明显相关(P<0.05)。VEGFR2在正常大肠黏膜中阳性率16.67%,在腺瘤和腺癌中表达率为21.05%和51.3%,差异有统计学意义其表达与淋巴结转移、浸润程度、Dukes临床分期明显相关(P<0.05)。结论大肠腺癌中Sema4D与VEGFR2的表达可能在大肠腺癌的发生、发展中发挥重要作用。     

胰高血糖素衍生物在大肠杆菌的克隆表达和纯化

 目的 通过基因工程途径获得胰高血糖素衍生物。 方法 根据胰高血糖素基因及凝血酶酶切位点序列，分段合成引物行 PCR 扩增，以 PCR 扩增得到的胰高血糖素-甘氨酸基因序列和 pET-30a 质粒转化 E.coli DH5α，获得重组质粒 pET-G。将重组质粒 pET-G 转化至 E.coli BL21(DE3)，重组菌株命名为 E.coli BL21[pET-G]。以异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达，对表达产物进行SDS-Tricine- PAGE[十二烷基硫酸钠-三（羟甲基）甲基甘氨酸-聚丙烯酰胺凝胶电泳]分析和蛋白质印迹分析。对表达产物行Ni2+-NTA亲和层析纯化、凝血酶酶切和高效液相色谱（HPLC）纯化后，行 SDS-Tricine-PAGE分析和飞行质谱分析，并以 ELISA 方法检测其免疫活性。 结果 PCR 扩增获得的条带与预期的DNA表达片段大小一致，重组质粒 pET-G 测序结果与预期完全一致。SDS- Tricine-PAGE 和蛋白质印迹分析显示 E.coli BL21（DE3）的表达产物相对分子质量与预期相符。经亲和层析纯化、凝血酶酶切和 HPLC 纯化后得到了完整的重组胰高血糖素-甘氨酸衍生物，SDS-Tricine-PAGE 分析显示其相对分子质量约为 3500，飞行质谱分析相对分子质量为 3531，二者基本一致。ELISA 检测表明重组胰高血糖素-甘氨酸衍生物具有胰高血糖素免疫活性。 结论 采用基因工程技术在大肠杆菌中成功表达了胰高血糖素-甘氨酸衍生物，为通过体外酰胺化途径研制酰胺化胰高血糖素奠定了基础。     

小鼠GITRL融合蛋白的表达、纯化及免疫原性的研究

目的:构建含小鼠GITRL基因原核表达载体,经转化E.coli以表达GITRL融合蛋白,纯化蛋白并制备相应的抗血清.方法:将GITRL-pMD18-T重组质粒经EcoRⅠ和SalⅠ双酶切回收目的基因,与原核表达载体PET32a连接,应用电转法转化BL21(DE3)菌.阳性克隆经鉴定后用IPTG诱导GITRL蛋白表达,经Ni+-NTA层析柱纯化融合蛋白,通过SDS-PAGE、Western blot进行特异性鉴定,CD4+CD25+T细胞免疫抑制试验验证其生物学功能.采用弗氏完全佐剂常规免疫方案,制备抗GITRL抗血清,抗血清的效价和特异性测定采用双向琼脂免疫扩散法.结果:经酶切鉴定和测序分析证实原核表达质粒构建正确,SDS-PAGE和Western blot结果显示,在40 kD处呈现单一蛋白条带,该蛋白具有阻断CD4+CD25+T细胞免疫抑制功能的作用,双向免疫扩散结果显示兔抗小鼠GITRL抗血清效价为1∶16.结论:成功构建GITRL原核表达质粒,制备和纯化的GITRL融合蛋白具有较好的纯度和生物学功能,制备并获得特异性抗血清,可用于GITRL融合蛋白生物学活性的进一步研究.