基于ITS2序列的三棱及其混伪品的分子鉴定

摘 要 目的：通过分析三棱及其混伪品的ITS2条形码序列,探索鉴定三棱及其混伪品的新方法。方法: 采集三棱及其混伪品共5个物种8个样本,并从Genbank网上下载三棱及其混伪品共6个物种23条ITS2序列,用MEGA5.0软件计算上述ITS2序列的种间、种内遗传距离,并构建系统发育树。结果: 三棱种内最大K2P距离为0.038,与混伪品种间最小K2P距离为0.697。由所构建的系统发育树可以看出,正品三棱的不同样品聚在一支,并能很好地与混伪品区分开。结论:ITS2条形码序列能够成功鉴定三棱与其混伪品,为三棱及其混伪品的鉴别提供了新的方法。     

巴戟天饮片及其混伪品的鉴别研究

目的:基于DNA条形码技术、传统经验鉴别和理化鉴别技术区分巴戟天饮片及其混伪品。方法:通过聚合酶链式反应(PCR),对巴戟天的内部转录间隔区2(ITS2)序列进行扩增;通过与GenBank数据库进行BLAST比对,以及利用构建NJ树的方法推断巴戟天饮片及其混伪品的基原;比较巴戟天饮片及其混伪品的种内、种间差异;比较巴戟天饮片及其混伪品的性状和薄层色谱行为差异。结果:巴戟天饮片及其混伪品经NJ树聚类分析和与GenBank进行BLAST比对,结果显示巴戟天饮片与其混伪品分支明显,11批巴戟天混伪品被鉴定到7个种,分别为印度羊角藤(羊角藤)、蔓虎刺、硃砂根、木通、黑老虎、合蕊五味子(铁箍散)、南五味子;种内、种间变异分析结果显示,5批巴戟天饮片的种内遗传距离为0.000,巴戟天饮片与其他7个混伪品的最小种间遗传距离为0.037;巴戟天饮片及其混伪品的性状和薄层色谱行为存在差异。结论:基于DNA条形码技术可有效区分巴戟天饮片及其混伪品,为巴戟天饮片正伪品的鉴别以及标准提升工作提供了一定的依据。     

基于ITS2序列鉴别维吾尔药材薰衣草及其混伪品

建立了基于ITS2序列鉴别维吾尔药材薰衣草及其混伪品(全叶青兰和夏枯草)的方法.对维吾尔药材薰衣草及其混伪品的ITS2 序列进行PCR扩增和双向测序,使用CodonCode Aligner软件对测序峰图进行序列拼接,用MEGA 6.0 软件对拼接后的序列进行多重比对.并计算种内、种间遗传距离,构建NJ 系统聚类树,预测...     

ITS2+psbA-trnH复合序列鉴定徐长卿、白薇和白前

目的：建立以ITS2+psbA-trnH复合序列鉴定徐长卿、白薇和白前及其同属近缘混伪品的DNA条形码鉴定方法。方法：搜集徐长卿、白薇、白前及其近源混伪品,采用改良的CTAB法提取DNA,通过实验分别获得ITS2和psbA-trnH序列,将同一样本的ITS2序列与psbA-trnH序列整合得到43条ITS2+psbA-trnH复合序列,从GenBank数据库中下载来源于同一样本的ITS2序列与psbA-trnH序列整合得到14条ITS2+psbA-trnH 网上复合序列,用MEGA 6.05软件分析徐长卿、白薇、白前及其近源混伪品的复合序列变异位点,计算种内、种间的K2P距离,并构建NJ系统聚类树。结果：徐长卿、白薇和白前药材ITS2+psbA-trnH复合序列比对后产生17个变异位点;徐长卿、白薇和白前基源物种种内最大K2P距离均小于其与混伪品的种间最小K2P距离;系统NJ树能准确将徐长卿白薇和白前及其近缘混伪品。结论：该研究建立了应用ITS2+psbA-trnH复合序列鉴定徐长卿、白薇、白前及其近缘混伪品的DNA条形码鉴定方法。     

基于ITS2条形码鉴定粤产竹根薯及其易混淆品

目的 采用DNA条形码分子鉴定技术鉴定粤产竹根薯（又名竹芋）Marantak arundinacea L.与及其易混淆品（包括飞羽竹芋、苹果竹芋和双线竹芋）,以确保竹根薯药材质量。方法 收集药材样品,对其ITS2序列进行PCR扩增并正向测序,所得序列用Codon Code Aligner软件校对拼接后,利用MEGA 6.05对序列进行分析比对,计算种内、种间遗传距离,利用邻接法（NJ）构建系统聚类树。结果 竹根薯种内遗传距离明显小于它与其同属的种间遗传距离,基于ITS2序列建立了NJ树,能准确将竹根薯与其混淆品区分。结论 基于ITS2序列可以科学准确地对竹根薯及其易混淆品进行鉴定,为竹根薯的生药鉴别提供新的科学依据。     

基于matK和ITS2及二级结构对药材香薷及其混伪品的鉴别研究

目的 快速、准确鉴别药材香薷及其混伪品，保障香薷的药材质量和用药安全。方法 收集石香薷、江香薷和香薷植物材料分别进行matK和ITS2序列的扩增与测序，测序结果经Codon Code Aligner软件校对，同时从GenBank下载石香薷、江香斋及其易混品种海州香薷、香薷、密花香薷、牛至等物种的matK和ITS序列。其中，ITS序列经隐马尔可夫模型去除两端的5.8S和28S序列，共得到16个物种的ITS2序列50条；经Clustal软件校对共获得9个物种的matK序列28条。通过Mega7.0软件分析matK和ITS2序列，计算所有物种种内和种间遗传距离，构建邻接法(neighbor joining，NJ)聚类树，通过ITS2 Database预测ITS2二级结构，采用4Sale软件比对二级结构，通过ProfDistS软件构建基于联合ITS2一级序列及其二级结构的剖面邻接(profile neighbor-joining，PNJ)系统发育树。结果 基于matK和ITS2序列的遗传距离均表明香薷正品与其各种混伪品之间存在明显barcoding gap。NJ和PNJ进化树的拓扑关系一致，可以区分药材香薷及其混伪品。香薷的ITS2二级结构与其各混伪品具有显著差异。结论 建议matK和ITS2序列均可以作为鉴别香薷与其混伪品的DNA条形码，ITS2二级结构信息的加入可丰富鉴定结果，为香薷药材的准确鉴别、香薷属与石荠苎属植物的科学分类提供参考。     

艾叶及其常见混伪品的分子鉴定

目的：对艾叶及其几种常见混伪品进行分子鉴定。方法：通过聚合酶链式反应（PCR）法直接测序,对艾及其8种混伪品进行核糖体DNA内转录间隔区片段2（ITS2）扩增并双向测序,所得序列经CodonCodeAligner拼接后,用系统发育软件MEGA4．0进行相关数据分析,同时利用邻接（NJ）法构建系统聚类树。结果：艾叶基原植物艾ITS2序列长度为225bp,种内平均Kimura．双参数（K2P）遗传距离（0．000）小于其与混伪品的种间平均K2P遗传距离（0．022）;由所构建的系统聚类树图可以看出,艾具有单系性,同时又与其他混伪品明显分开。结论：ITS2序列作为DNA条形码可以方便快捷地鉴别中药材艾叶及其混伪品,可为其质量评价及临床安全用药提供重要的分子鉴别依据。     

蒙药悬钩子木的rbcL序列分析

目的 通过对蒙药悬钩子木DNA进行PCR扩增,测序分析不同产地悬钩子木的rbcL序列,并与悬钩子木混伪品的rbcL序列进行比较。方法 采用植物基因组DNA提取试剂盒,从悬钩子木20个样本中提取总DNA,对rbcL序列进行PCR扩增并测序;从GenBank上下载悬钩子木常见混伪品的rbcL序列,鉴定不同产地悬钩子木及其混伪品的rbcL序列。结果 悬钩子木的种内最大遗传距离小于混伪品的种间最小遗传距离,NJ系统发育树显示：悬钩子木20个样品聚为一支,能与同属的混伪品红泡刺藤、紫色悬钩子、拟复盆子、直立悬钩子、藏南悬钩子、多腺悬钩子、秀丽莓、无腺白叶莓、粉枝莓进行区分。结论 rbcL序列可用于鉴定悬钩子木及其混伪品的条形码序列。     

羌活药材ITS/ITS2条形码鉴定及其稳定性与准确性研究

为验证DNA条形码鉴定的稳定性与准确性,本文选用羌活药材作为研究对象,对31份样本提取基因组DNA,通过聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增内部转录间隔区(internal transcribed spacer,ITS)序列并进行双向测序,所得序列经CodonCode Aligner拼接后,采用MEGA5.0软件与其混伪品进行序列比对,计算种内和种间距离,构建邻接树(neighbor-joining tree,NJ Tree)。ITS2序列采用基于隐马尔可夫模型(hidden Markov model,HMMer)的注释方法获得。结果表明,羌活药材ITS序列长度为603～604 bp,ITS2序列长度均为228 bp,羌活药材ITS/ITS2序列单倍型与其基原植物叶片序列一致。两种基原植物ITS/ITS2序列种内平均kimura 2-parameter(K2P)遗传距离均远远小于其与混伪品的种间平均K2P遗传距离;NJ树结果显示羌活、宽叶羌活与其混伪品均可明显区分,表现出良好单系性。因此ITS/ITS2序列作为DNA条形码能稳定、准确鉴别羌活药材,为保障临床安全用药提供了新的技术手段。     

市售覆盆子药材DNA条形码鉴定研究

目的基于ITS2条形码序列检测市场销售覆盆子药材,为保证覆盆子药材使用的正确性和安全性提供一种新的鉴定手段。方法获取掌叶覆盆子及其5种常见同属易混种ITS2序列,以及GenBank上下载的共计48条序列。使用Gene Tool软件分析ITS2序列长度,GC含量和变异位点等情况,利用Clustal X和MEGA 7.0软件计算遗传距离和构建邻接系统发育聚类树。同时随机检测24份市售覆盆子药材,利用中药材DNA条形码鉴定系统和构建邻接系统发育聚类树确定物种,鉴别真伪。结果掌叶覆盆子基原植物可与其同属易混种进行明显区分;市售药材中正品22份,伪品1份,混合物1份。结论基于ITS2序列的DNA条形码技术能够成功鉴定市场销售的掌叶覆盆子及其混伪品。     

基于ITS序列鉴别特色民族药材土牛膝及其混伪品的研究

目的:利用DNA条形码对特色民族药材土牛膝(粗毛牛膝、野生牛膝和柳叶牛膝)及其混伪品进行分子鉴定.方法:利用DNA条形码方法,分别对土牛膝及其混伪品的ITS和MatK基因片段进行扩增并双向测序,使用Codon?Code?Aligner软件对扩增序列进行拼接,用MEGA软件对数据比对分析,并基于K2P模型进行遗传距离分析...     

基于DNA条形码技术鉴定蒙药材刺柏叶及其混淆品

目的：基于DNA条形码技术鉴别蒙药材刺柏叶及其混淆品。方法：采用国际通用的条形码序列 ITS2、psbA-trnH、matK和rbcL,对刺柏叶及其混淆品圆柏叶共计11份样品进行DNA提取、扩增,采用CodonCode Aligner进行序列拼接,并用MEGA软件对拼接序列进行变异位点分析、邻接(NJ)聚类分析,并计算其平均种内、种间遗传距离。结果：4对引物的PCR扩增产物测序成功率分别为ITS2 100%、 psbA-trnH 100%、rbcL 100%、matK 0%;ITS2序列和psbA-trnH序列均可通过变异位点比较区分刺柏叶及其混淆品;NJ聚类分析的结果显示,psbA-trnH序列的NJ聚类树中刺柏叶与圆柏叶均能分别聚为一支,且psbA-trnH序列的平均种间遗传距离明显大于平均种内遗传距离。结论：psbA-trnH序列能有效区分圆柏叶与刺柏叶,可作为鉴别刺柏叶及其混淆品圆柏叶的条形码序列,为蒙药材刺柏叶及其混淆品的鉴别提供支持。     

基于GenBank核酸数据库ITS2序列鉴定一枝蒿与其混淆品种

目的:利用GenBank核酸数据库中ITS2序列鉴定维吾尔传统药材一枝蒿与其混淆品种。方法:提取一枝蒿药材基因组DNA、扩增ITS2序列并测序,采用CodonCode Aligner V3.0对测序峰图进行校对拼接,并提交至GenBank核酸数据库;运用分析相似性搜索法(BLASTI)进行序列鉴定,下载易混淆品种的ITS2序列,再应用MEGA5.0软件计算种内种间(K2P)遗传距离和构建邻接(NJ)系统聚类树。结果:一枝蒿与其混淆品种之间的K2P遗传距离分布于0.019⁰.254之间,远大于一枝蒿种内遗传距离(0.008);NJ系统聚类树结果表明能将一枝蒿与其混淆品种区分开来,单独聚为一类。结论:ITS2序列适用于维吾尔药材一枝蒿与其混淆品种的鉴别,可为一枝蒿的质量和用药安全提供鉴定依据。     

Molecular authentication of the ethnomedicinal plant Sabia parviflora and its adulterants by DNA barcoding technique

Sabia parviflora Wall. ex Roxb. is a traditional herb widely used by Chinese people, especially by the Buyi ethnic group which resides in Guizhou and Yunnan provinces. According to the Chinese Ethnic Pharmacopeia, the species is commonly used for soothing the liver and for the treatment of icteric hepatitis, hemostasis, and inflammation. However, due to the similar morphological characters of Sabia species and higher market demands, there are many substitutes and adulterants of S. parviflora. In this study, the differential identification of 6 Sabia species and 7 adulterants were investigated through DNA sequence analysis of three candidate DNA barcodes (trnH-psbA, rbcL-α, matK). Based on sequence alignments, we concluded that not only the trnH-psbA spacer sequence can distinguish S. parviflora from other Sabia species, but the matK + rbcL-α sequences also can differentiate it from the substitutes and adulterants. The classification tree of all samples based on rbcL-α sequences indicated that the rbcL region can identify samples into a family/genus level. Our results suggest that the three candidate barcodes can be used for the identification of S. parviflora and to distinguish it from common substitutes or adulterants.     

DNA条形码鉴定洋金花及其伪品

为建立有毒中药洋金花及其伪品DNA条形码鉴定方法,采用国际通用的条形码序列ITS2、psbA-trnH、matK和rbcL对洋金花原植物白花曼陀罗及其伪品毛曼陀罗、曼陀罗和木本曼陀罗4个种共计20份材料进行了比较研究。PCR及测序成功率分别为ITS2(100%)、matK(100%)、psbA-trnH(90%)、rbcL(85%)。采用CodonCode Aligner进行序列拼接,采用MEGA 4.1计算白花曼陀罗及其伪品的种内、种间的K2P距离,并基于K2P模型构建NJ树。结果显示ITS2序列共有30个单核苷酸多态性(SNPs)位点、psbA-trnH序列有33个单碱基的插入和缺失I。TS2和psbA-trnH序列种间遗传距离大于种内,matK和rbcL种内和种间没有明显Barcoding Gap。4个条形码序列及其组合获得的分子系统树(ITS2、psbA-trnH、matK、rbcL、matK+rbcL)均分成了两大支,木本曼陀罗单聚为一支,该分子证据支持将Brugmansia提升为属水平。实验结果表明ITS2及psbA-trnH序列可以作为洋金花及其伪品鉴定用的条形码序列。