人整合素分子α4亚基片段的克隆及大肠杆菌的表达

目的 克隆并原核表达α４亚基笥段。方法 从ＩＬ－６细胞系中提取总ＲＮＡ,以ＲＴ－ＰＣＲ方法分两段扩增人整素分子α４亚基片段２．０ｋｂ ｃＤＮＡ,将两片段连接,并将其中的１．７ｋｂ基因片段亚克隆至表达载体ＰＧＥＸ－ＫＧ中,ＩＰＴＧ诱导表达。结果 ＲＴ－ＰＣＲ扩增并克隆了α４的两段ＣＤＮＡ,序列分析表明：与文献报道的μ４ＣＤＮＡ序列基本一致。两片段成功连接后将其中的１．７ｋｂ亚克隆至表达载体ＰＧＥＸ－     

人整合素分α４亚基片段的克隆和表达

目的 克隆并表达人整合素分子α４亚基１.2kbcD-NA片段。方法 从ＨＬ－６０细胞系中提取总ＲＮＡ,以ＲＴ－ＰＣＲ法扩增人整合素分子α４亚基片段１.2kbcDNA(1753-2934bp),并将该片段亚克隆至表达载体pGEX-3X,用ＩＰＴＧ诱导表达。结果 克隆了α４亚基１.2kbcDNA片段。序列分析表明。其所编码的氨基酸序列与文献相比较只有一处错义突变（Ａrg→Ｇln),经分析突变对抗原性影响不大。将该片段亚克隆至表达载体pGEX-3X,经ＩＰＴＧ诱导在大肠杆菌中获得高效表达。结论 获得了α４亚基１.2kbcDNA片段及其原核表达产物。对研究α４整合素的功能具有重要意义。     

人整合素分子α4亚基片段的克隆和表达

目的克隆并表达人整合素分子α4亚基1.2kbcDNA片段。方法从HL-60细胞系中提取总RNA,以RT-PCR法扩增人整合素分子α4亚基片段1.2kbcDNA(1753～2934bp),并将该片段亚克隆至表达载体pGEX-3X,用IPTG诱导表达。结果克隆了α4亚基1.2kbcDNA片段。序列分析表明,其所编码的氨基酸序列与文献相比较只有一处错义突变(Arg→Gln),经分析该突变对抗原性影响不大。将该片段亚克隆至表达载体pGEX-3X,经IPTG诱导在大肠杆菌中获得高效表达。结论获得了α4亚基1.2kbcDNA片段及其原核表达产物,对研究α4整合素的功能具有重要的意义。     

4株鼠抗人B7-1分子单抗的制备及其生物学活性的鉴定

目的：制备鼠抗人B7—1分子(mAb)单抗及研究其生物学活性。方法：以人多发性骨髓瘤细胞转人B7-1基因细胞株XG7-B7为免疫原，采用B淋巴细胞杂交瘤技术制备鼠抗人B7—1分子单抗；以Western blot及间接免疫荧光标记法鉴定其特异性和亲和力；采用^3H—TdR掺入实验和Annexin-Ⅴ染色分析测定该单抗的生物学功能。结果：获得了4株持续分泌抗人B7—1分子的特异性单抗的杂交瘤细胞株，分别命名为1F11、3H8、6H2和7B10，其分泌的单抗类别分属于小鼠IgG1和IgM；4株单抗均具有良好的特异性和亲和力；1F11、3H8和6H2能部分组断B7—1分子基因转导细胞介导的共刺激信号，从而抑制T细胞的增殖效应(抑制率21％—52％)；且能诱导天然表达B7—1分子的人B系淋巴瘤细胞Raji的凋亡。结论：成功研制4株功能性抗人B7—1分子抗体，这些抗体在抗异体组织器官移植排斥反应及在B系淋巴瘤的治疗中具有潜在的应用价值。     

抗人FKBP52分子单克隆抗体的制备和鉴定

目的；研制抗人FKBP52单克隆抗体（mAb)，并分析其免疫生物学特性。方法：采用纯化的人FKBP52蛋白免疫BALB／c小鼠。用ELISA法鉴定mAb的特异性；用Western blot鉴定制备的9株mAb所识别的抗原相对分子质量（Mr)及结合人FKBP52分子的功能区。结果：共获得9株分泌抗人FKBP52 mAb的杂交瘤细胞。抗人FKBP52 mAb可识别相对Mr为52000在原核系统中表达的人FKBP52蛋白，也可识别Jurkat细胞浆中Mr为52000的天然FKBP52蛋白。两株mAb均可识别人FKBP52分子中的第2功能区。其余7株mAb可识别人FKBP52分子中的第3功能区。结论：成功地制备了抗人FKBP52分子mAb。     

抗人整合素β3亚基单克隆抗体的制备及其抗肿瘤活性的研究

目的制备抗人整合素β3亚基的单克隆抗体(mAb),研究其对肿瘤治疗的作用。方法用RT-PCR方法扩增人β3胞膜外基因,将其克隆至原核表达载体pQE30中,获得含β3胞膜外基因的高效表达载体pQE30-β3,将其转化大肠杆菌M15,通过诱导表达及纯化,获得β3蛋白。将此蛋白免疫BALB/c小鼠,应用B淋巴细胞杂交瘤技术制备抗β3亚基mAb,Western blot鉴定mAb的特异性。通过小鼠体内抑制黑色素瘤生长实验筛选出具有抑制肿瘤生长作用的mAb。进一步用MTT法及流式细胞术观察该mAb体外抑制人脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖及诱导其凋亡的作用。结果扩增获得了β3胞膜外基因,构建了β3蛋白的原核表达载体,表达纯化了β3蛋白,成功制备了8株mAb,Western blot证明了其特异性。经过体内抑瘤实验筛选出一株具有显著抑制肿瘤生长的mAb4F12。该mAb可抑制HUVEC细胞增殖并诱导其凋亡。结论成功表达了β3蛋白,并制备了有活性的mAb,抗体具有抑制肿瘤生长的作用,这可能是通过抑制血管内皮细胞的增殖和诱发凋亡实现的。     

人整合素αvβ3在CHO细胞表达的研究

目的 使人整合素αvβ3在CHO细胞表面有效表达，为从分子水平了解汉坦病毒(hantavirus，HV)的感染及致病机制。方法 构建含人整合素β3 ORF区基因的真核表达载体pcDNA3．1．β3；将其与含人整合素αv全长cDNA的质粒pcDNA3-αv分别及共转染至CHO细胞中进行表达；采用间接免疫荧光法、流式细胞仪、免疫沉淀及免疫印迹实验对外源基因的表达进行定性、定位及定量检测，并确证表达产物的免疫反应性。结果 人整合素αv、β3基因在共转染组细胞中有高效表达，目的蛋白主要定位于细胞膜上；β3基因在pcDNA3．1-β3单独转染组细胞中的表达明显弱于共转染组；而pcDNA3.1-β3单独转染组则未见有效的表达。结论 人整合素αvβ3在CHO细胞表面的有效表达需要2个亚基共同参与.     

抗人gp130分子单克隆抗体的制备和鉴定

ｇｐ１３０可与许多细胞因子受体（ＩＬ－６Ｒ,ＩＬ－１１Ｒ,ＯＳＭＲ,ＬＩＦＲ,ＣＮＴＦＲ和ＣＴ－１Ｒ）组成受体复合物,并在这类细胞因子的信号转导中的起着重要的作用。方法以痘苗病毒为载体构建获得的可溶性ＣＤ１３０（ｓＣＤ１３０）为免疫原,通过融合的方法。得到４株稳定分泌抗ＣＤ１３０单克隆抗体（ｍＡｂ）Ｌ２,Ｌ４ａ,Ｌ４ｂ和Ｌ５）的杂交瘤细胞株。结果本组ｍＡｂ对靶细胞具有识别特异性,不但可识别相对分子     

人精子表面整合素亚基α5、β1参与受精过程的研究

目的：研究人精子表面整合素亚基α5、β1在受精过程中的作用。方法：以人精子穿透去透明带金黄地鼠卵异种体外受精试验（SPA）作为检测人精子受精力的手段；分别用抗整合素亚基α5、β1抗体衣整合素特异的配体RGD肽作用于精子后，观察其受精力的改变。结果：用抗整合素亚基α5、β1抗体及RGD肽作用于精子后，受精率、受精指数及粘附指数均下降。结论：人精子表面整合素亚基α5、β1参与受精过程。     

人整合素β3亚基真核表达载体的构建及αIIbβ3在细胞表面的表达

目的 :构建人整合素 β3亚基真核表达载体 ,并探讨如何使人整合素αIIbβ3在CHO细胞表面有效表达 ,为进一步研究整合素β3亚基作为汉坦病毒 (hantavirus,HV)受体的特异性奠定基础。方法 :构建编码人整合素 β3真核表达载体 pcDNA3.1 β3。将其与编码人整合素αIIb亚基真核表达载体 ,分别及共转染至中国仓鼠卵巢 (Chinahamsterovary ,CHO)细胞中进行表达。采用间接免疫荧光法 (IFA)检测外源基因的表达。结果 :共转染组目的蛋白呈高效的细胞膜表达。pcDNA3.1 β3单独转染组 β3亚基在细胞膜的表达较共转染组弱 ;而pBJ1 αIIb单独转染组则未见有效的细胞膜表达。结论 :人整合素αIIbβ3在CHO细胞表面的有效表达需要两个亚基共同参与。     

山茱萸总甙对人脐静脉内皮细胞表达α4β7整合素影响

为了进一步探讨山茱萸总甙的抗炎和免疫抑制机制。以ECV3 0 4作为研究HUVEC对象 ,研究了山茱萸总甙对HUVEC表达α4和 β7整合素影响。用rTNF α和rIL 1诱导血管内皮细胞活化 ,模拟血管内皮细胞在炎性条件下的环境 ,采用Cell ELISA方法分析α4整合素、β7整合素的表达 ,结果 ,rTNF α和rIL 1均可诱导血管内皮细胞活化而明显增加α4和 β7整合素的表达 ,地塞米松和山茱萸总甙均可抑制rTNF α和rIL 1诱导ECV3 0 4表达α4和β7整合素 (P <0 0 1)。抑制血管内皮细胞表达α4 β7整合素可能是山茱萸总甙主要抗炎和免疫抑制机制之一。     

人绒毛膜促性腺激素β亚基在大肠杆菌中的表达

目的：以该室克隆的ＰＣＲⅡ／ｈＣＧβ载体为模板,亚克隆到表达载体ＰＧ５中使ｈＣＧβ基因在大肠杆菌中进行高铲表达。方法：改变部分ｈＣＧβ序列,得到重组ＰＧ５＝ｈＣＧβ载体为经序列分析证明,再转化到表达菌ＢＬ２１中表达,所得包涵体经过柱纯化,复性,免疫发光分析和动物试验其活性。结果：经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳在１８ｋＤ左右有一条明显的新增蛋白带,与预期的分子量相符,并用Ｗｅｓｔｅｍ印迹证实,ｒｈＣＧβ约占     

抗人端粒酶蛋白亚基单域抗体制备和鉴定

目的　研制抗人端粒酶逆转录酶 (hTERT)蛋白亚基单域重组抗体。方法　以重组His taghTERT融合蛋白为抗原免疫小鼠 ,以逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR)扩增小鼠脾细胞重链可变区 ;经克隆噬菌粒载体pCANTAB 5E及转染大肠杆菌建立噬菌体抗体展示文库 ,经过亲和性富集选择阳性克隆 ,并于大肠杆菌 (E .coli.HB2 15 1)中表达为可溶性单域抗体 ;Westernblot确定单域抗体结合特性。结果　以RT PCR扩增His taghTERT免疫小鼠脾细胞RNA ,得到 35 0bp小鼠重链可变区DNA片段 ;通过克隆及转染制备出噬菌体展示抗体文库 ,文库大小是 8× 10 4 ;经过抗原 抗体亲和性筛选 ,得到 4个克隆 ,并表达为可溶性单域抗体 (相对分子质量 16 0 0 0 ) ;WesternBlot分析显示 :其中 2个克隆的可溶性单域抗体可特异性结合His taghTERT融合蛋白 (相对分子质量 16 70 0 ) ,与His tag无关 ;与人癌细胞表达的天然hTERT蛋白 (相对分子质量 12 70 0 0 )分析亦显示其特异性结合能力。DNA序列分析证实可溶性单域抗体为小鼠抗体重链可变区VH基因编码。结论　利用噬菌体展示技术已初步制备出小鼠重链可变区编码的抗hTERT蛋白的特异单域抗体 ,为进一步探索其抑制端粒酶活性及抗肿瘤作用奠定了基础。     

重组大鼠TGF-β1在大肠杆菌的表达及初步鉴定

β型转化生长因子 (ＴＧＦ β)有 5种不同的异构体 ,其中ＴＧＦ β1研究最为深入 ,由于ＴＧＦ β1对多种脏器纤维化及肿瘤的发生、发展有关而倍受关注。哺乳动物细胞合成的ＴＧＦ β1前体含 390个氨基酸 ,其中包含Ｎ 端信号肽(ａａ 1 2 3) ,ＬＡＰ(ｌａｔｅｎｔａｓｓｏｃｉａｔｅｐｅｐｔｉｄｅ) (ａａ2 3 2 78)和 112个氨基酸的Ｃ端肽 (ａａ2 79 390 ) ,在ａａ 2 75～ 2 78有四个碱性氨基酸组成的酶解位点 ,Ｃ端肽可从该位点酶解释放最终形成成熟态的ＴＧＦ β1单体 ,活性ＴＧＦ β1即为该单体的同种二聚体。本文克隆了编码 2 79～ 390氨…     

整合素连接激酶和β1整合素在大鼠烫伤创面愈合过程中表达的实验研究

目的探讨大鼠烫伤创面愈合过程中整合素连接激酶（ILK）和β1整合素的表达以及在创面愈合中的作用。方法健康雌性SD大鼠18只,随机选取其中15只作为实验组,建立深Ⅱ度烫伤模型,另外3只为对照组,不做处理。实验组分别于烫伤模型建立后第1、5、10、15、20天随机选取3只大鼠,切取背部两侧全层创面,运用免疫组织化学的方法检测创面中ILK、β1整合素的表达。对照组取背部正常皮肤作为对照。结果实验组烫伤后第5、10、15天大鼠烫伤创面中ILK的表达明显高于对照组和实验组烫伤后第20天（P〈0.05）;创面中β1整合素的表达在烫伤后第5天明显高于对照组（P〈0.05）,实验组烫伤后第10、15天则明显高于对照组和实验组烫伤后第20天（P〈0.05）。结论ILK、β1整合素在大鼠创面愈合过程中表达明显增加,ILK可能通过参与整合素信号通路,在调节创面细胞的增生以及细胞与ECM相互作用中扮演着重要的角色。     

人β2m基因的克隆及表达

β2m是含有99个氨基酸的血清蛋白,也是构成MHC-I类分子的亚单位。最初从肾脏患者的尿液中分离得到[1],其表达异常与多种肿瘤及肝、肾疾病有密切关系。HLA-A2的晶体结构已证实,α3和β2m折叠起来形成Ig样功能区[2],并表明β2m对维持I类分子的天然构型的稳定性及其表达起关键作用[3,4]。MHC-I类分子在免疫系统中占有极其重要的地位,目前已趋向利用基因工程技术构建MHC-I类分子复合物以克服从体内获得的困难[5,6]。本研究成功地构建了其轻链β2m的融合表达载体,并在大肠杆菌中获得高效表达。1 材料和方法1.1 材料E.coli C600…     

外源性LIF和IL-1对围着床期小鼠子宫内膜整合素β3亚基表达的调节

目的研究外源性LIF及IL-1对围着床期子宫内膜整合素β     

复发性流产绒毛整合素β1的表达及染色体分析

目的探讨复发性流产与绒毛染色体异常及整合素β1的表达的关系。方法将在我院就诊的45例早孕期复发性流产患者作为研究组,30例正常早孕行人工流产术的患者作为对照组,对两组患者进行绒毛细胞染色体分析及绒毛组织整合素β1的检测。结果研究组绒毛染色体异常发生率为46.66%,显著高于对照组（10.00%）;研究组绒毛组织整合素β1的表达率为22.22%,显著低于对照组（86.67%）;研究组：染色体正常者整合素β1的表达率低于染色体异常者,但两者经统计学处理无显著差异（χ^22.81 P（0.05）;在对照组：染色体正常者整合素β1的表达率与染色体异常者整合素β1的表达率经统计学处理无显著差异（确切概率P=0.360）;两组间染色体正常者整合素β1的表达率有显著差异,研究组整合素β1表达率显著低于对照组（χ^229.75 P（0.05）;两组间染色体异常者整合素β1的表达率经统计学处理无显著差异（确切概率P=0.533）。结论绒毛染色体异常是导致孕早期复发性流产的主要原因,绒毛组织整合素β1表达缺失与绒毛染色体检查正常的流产有关。     

人CD19分子胞外区在大肠杆菌中的表达研究

本实验应用计算机优化设计，利用ＰＣＲ 和分子克隆技术，以ｐＵＣ１９／ＣＤ１９ 重组质粒为模板，扩增出人ＣＤ１９ 分子的胞外区基因，并与表达载体相连，经３０ ℃扩增菌体，４２ ℃诱导，实现了在Ｅ－ｃｏｌｉ 中融合表达相对分子质量（ Ｍｒ） 为４１ ０００ 的蛋白谱带。初步纯化的包涵体可溶于２ ％ ＳＤＳ，为对其单克隆抗体（ｍＡｂ） 的制备奠定了基础。     

抗人CD100单克隆抗体的制备与初步鉴定

目的：研制可识别天然CD100分子的单克隆抗体（mAb)。方法：采用真核表达的CD100分子免疫BALB/c小鼠，以间接ELISA法筛选阳性杂交瘤，并分别用人急性T淋巴细胞性白血病细胞系MOLT-4，猿T淋巴细胞系MLA-144及猴EB病毒转化的B淋巴细胞系（BLCL），进行间接免疫荧光染色和流式细胞术鉴定mAb的特异性。结果：共获得7株可稳定分泌mAb的杂交瘤细胞株。所有mAb均可识别人和猴细胞系的膜表面天然CD100分子，其中6株可识别猿细胞系膜表面的天然CD100分子，结论：成功地制备了7株抗CD100分子的特异性mAb。为研究人和猿，猴CD100分子的结构与功能提供了新的手段。