人骨髓间充质干细胞与脐血CD34+细胞体外扩增

为了研究骨髓间充质干细胞(MSC)及细胞因子对脐血CD34 造血祖细胞体外扩增的作用,及其扩增作用 对细胞黏附分子的影响,用免疫磁珠富集脐血CD34 细胞,然后接种到含有或不含有MSC和细胞因子的24孔培 养板,体外培养1周,观察不同指标并进行组间比较。结果表明:①SDF-1α SCF TPO FL因子组合与SCF TPO FL因子组合对脐血CD34 细胞的扩增作用无显著性差异(无论有无MSC细胞层存在)(P>0.05);②MSC 与上述细胞因子共存的培养体系优于相应的单纯细胞因子培养体系(P<0.05);③扩增前与扩增后脐血造血祖 细胞黏附分子CD44的表达没有明显变化。结论:趋化因子SDF-1α对SCF TPO FL因子组合的扩增作用无显 著影响;MSC增加细胞因子的脐血细胞体外扩增的作用;体外扩增不影响跻血细胞黏附分子CD44的表达。     

脐带间充质干细胞对脐血CD34＋细胞体外扩增的影响

背景:体外扩增是目前解决脐带血干细胞移植所面临的单份脐血造血干祖细胞数不足问题的丰要手段.已有许多关于不同来源的间充质干细胞联合不同细胞因子支持脐血造血干祖细胞体外扩增的报道,而单独应用间充质干细胞对人脐血CD34+细胞体外扩增的报道仍很少.目的:观察应用脐带源间充质干细胞作基质层的体外培养体系对脐血CD34+细胞体外扩增的支持作用.设计、时间及地点:对比观察实验,于2006-03/2007-05在中国医学科学院中国协和医科大学血液学研究所、实验血液学国家重点实验室完成.材料:经产妇知情同意,采集健康足月分娩胎儿脐带9份.方法:应用贴壁培养的方法从正常足月出生儿脐带中分离培养间充质干细胞,通过细胞形态学、免疫表型、分化实验进行鉴定.利用免疫磁珠分离法从正常足月出生儿脐带血中分离CD34+细胞.应用3种不同培养体系进行脐血CD34+细胞的体外扩增:单独应用脐带源间充质干细胞作基质层、细胞因子培养体系和间充质干细胞联合细胞因子培养体系.主要观察指标:应用细胞计数法、集落培养计数法和流式细胞学检测法对扩增后细胞数量、集落形成能力和免疫表型进行分析比较.RT-PCR检测间充质干细胞中细胞因子的表达情况.结果:培养第14天后,间充质干细胞组的CD34+细胞比例明显高于细胞因子联合间充质干细胞组;CD34+细胞总数为培养前的(4.19±1.37)倍,明显高于细胞因子组.培养第7天和第14天,间充质干细胞组的CD34+CD38-细胞亚群比例均高于另两组.RT-PCR结果显示,脐带源间充质干细胞体外可表达干细胞因子和血小板生成素早期干细胞效应因子.结论:单独应用脐带源间危质干细胞可有效地对脐血CD34+细胞进行体外扩增,更有利于保持较早期干、祖细胞的扩增.     

脐带血来源的间充质干细胞对CD34+细胞增殖的支持作用及其机制

目的:探讨脐带血来源的间充质干细胞体外支持造血干细胞扩增的能力及所涉及的可能机制.方法:将来源于脐血的造血干细胞与间充质干细胞共培养14 d,然后计数造血干细胞数与集落形成单位.ELISA方法检测间充质干细胞培养上清中含有的细胞因子.结果:与间充质干细胞共培养的造血干细胞增殖率明显高于单独培养的造血干细胞(P＜0.05).此外,在培养体系中添加外源性细胞因子可明显提高造血干细胞增殖率(P＜0.05).间充质干细胞能分泌多种细胞因子,包括GM-CSF、IL-7、IL-8、IL-11、SCF和SDF-lα.结论:脐带血间充质干细胞作为细胞滋养层可用于体外扩增造血干细胞,间充质干细胞分泌的细胞因子可能介导MSC对HSC增殖的支持作用.     

人骨髓间充质干细胞体外支持脐血CD34+细胞增殖的研究

为了研究人骨髓间充质干细胞(MSC)作为滋养层细胞体外支持脐血CD34+细胞扩增的作用,将MSC和胎儿骨髓来源的成纤维细胞样骨髓基质细胞系(HFCL)经60Coγ线照射后分别制备细胞滋养层,比较不同滋养层细胞和添加或不加细胞因子对脐血CD34+细胞增殖数及LTC-IC数的影响.结果表明,无论有无添加细胞因子(rhFL、rhSCF、rhTPO),HFCL滋养层组培养12天扩增细胞数明显高于MSC滋养层组,以第0天细胞数为100%(下同),有细胞因子组为(9797±361)%vs(7061±418)%,无细胞因子组为(5305±354)%vs(1992±247)%,均P＜0.01.MSC滋养层组CD34+细胞扩增数与HFCL滋养层组相比无显著差异[(825±305)%vs(820±191)%,P＞0.05],但在细胞因子存在时低于HFCL滋养层组[(939±212)%vs(1617±222)%,P＜0.01].MSC滋养层组维持脐血中LTC-IC的能力明显优于HFCL滋养层组[第5周CFU-GM数(129.95±8.73)个/105接种细胞数vs(89.81±10.29)个/105接种细胞数,P＜0.05];细胞因子存在时,其作用更为明显[第5周CFU-GM数(192.93±4.95)个/105接种细胞数vs(90.47±14.28)个/105接种细胞数,P＜0.01].MSC与HFCL按一定比例混合,可提高扩增效率.当MSC与HFCL之比为41时,集落形成数量最高,达(186.89±11.11)个/105接种细胞数,明显高于比例为32(131.45±13.02)个/105接种细胞数和二者单用组[前者(138.92±14.84)个/105接种细胞数,后者(64.63±6.11)个/105接种细胞数;均P＜0.01].结论MSC维持脐血中LTC-IC集落形成的能力优于基质细胞系HFCL,HFCL支持脐血CD34+细胞的增殖能力优于MSC,MSC加上适量HFCL可显著提高CD34+细胞扩增效率.     

脐血CD34＋细胞体外诱导扩增红系细胞的探索

本研究利用脐血CD34＋细胞在体外大量扩增红系细胞为解决血源短缺、杜绝输血传染、克服稀有血型患者疑难配血等问题提供一种有益的途径。利用添加SCF、IL-3、EPO等细胞因子的无血清培养液扩增脐血来源的CD34＋细胞,并通过问充质干细胞的支持培养来诱导其向红系细胞扩增和分化。结果表明,经过23天培养以后,本方法可以使细胞的扩增倍数达到2．52×10^5,其中95％以上都是红系细胞,粒单系细胞和巨核细胞所占比例都在1％以内。无间充质干细胞的培养体系在细胞扩增数量及红系细胞所占比例方面都明显逊于有间充质干细胞支持的培养体系。结论：利用细胞因子和间充质干细胞可以在体外大量扩增红系细胞,其中间充质干细胞对红系细胞增殖和分化起重要的促进作用。     

不同时相移植人骨髓间充质干细胞对人脐血CD34^＋细胞植入NOD／SCID小鼠的影响

为了观察不同时相移植人骨髓间充质干细胞（MSC）对脐血（UCB）CD34^＋细胞移植的NOD／SCID小鼠造血重建的影响，明确最佳的移植时机，将体外培养扩增的人骨髓MSC分别于UCBCD34^＋细胞移植同时、移植前48小时及移植后48小时输入经^60Coγ射线照射的NOD／SCID小鼠，观察共移植后42天内小鼠外周血白细胞和血小板变化，并于移植后42天处死小鼠，用FACS检测外周血、骨髓和脾脏人源细胞含量。结果表明：（1）MSC和UCBCD34^＋细胞同时输注可明显降低外周血白细胞和血小板下降幅度，缩短白细胞和血小板恢复时间；二者不同时输注均不降低白细胞和血小板下降幅度，且输注UCBCD34^＋细胞后48小时输注MSC时外周血血小板恢复时间明显晚于同时输注者。（2）与单纯UCBCD34^＋细胞移植相比较，不同时相输注MSC均可促进UCBCD34^＋细胞的植入，三个共输注组间促进骨髓各系造血植入效应无明显差异。结论：人骨髓MSC与UCBCD34^＋细胞共移植时，以同时移植效果最佳，此结果为MSC的临床应用提供了实验依据。     

microRNA在人脐血CD34^＋CD38^-、CD34^＋CD38^＋细胞中的差异性表达

为进一步探讨microRNA（miRNA）在造血调控中的作用奠定基础,比较了miRNA在人脐血CD34^＋CD38^-、CD34^＋CD38^＋细胞中的差异性表达。从人脐血中分离单个核细胞（MNC）,应用FACSVantage分选流式细胞仪分选CD34^＋CD38^-、CD34^＋CD38^＋细胞;抽提miRNA后与miRNA芯片杂交,应用生物信息学技术分析miRNA芯片的表达结果。结果发现,miRNA在人脐血CD34^＋CD38^＋细胞的表达水平比在CD34^＋CD38^-细胞的表达水平降低至1／2以下者共11个,表达水平升高至2倍以上者共73个,以上84个miRNA被称为“干细胞性”miRNA。经比较Georgantas等和芯片表达结果,发现有12个（14、29％,12／84）相同的miRNA。部分miRNA经历了类似于CD34在造血细胞表面的发展历程。应用生物信息学技术可寻找到新的与造血调控相关的miRNA簇及miRNA的下游靶基因。结论：“干细胞性”miRNA在正常造血中发挥着重要作用,即miRNA的系统表达模式一造血干／祖细胞基因表达谱一造血干／祖细胞的自我更新和系列定向分化。     

人类脐血CD34^＋细胞的研究进展

本文综述了近年来对脐血ＣＤ３４＾＋细胞（即造血干／祖细胞）的研究进展，表明虽脐血ＣＤ３４＾＋细胞水平低于正常成人骨髓，但其干细胞比例较高且造血功能较强，有利于移植后长期造血的重建。     

脐血CD34^＋细胞体外扩增的研究

采用ＤｙｎａｌＭ－４５０ＣＤ＿（３４）免疫磁珠分离纯化脐血ＣＤ＿（３４）￣＋细胞，并探讨了不同细胞因子［干细胞因子（ＳＣＦ）、白细胞介素６（ＩＬ－６）、白细胞介素３（ＩＬ－３）及红细胞生成素（Ｅｐｏ）］组合对脐血ＣＤ＿（３４）￣＋细胞的体外培养和扩增作用。结果表明：①经ＤｙｎａｌＭ－４５０ＣＤ＿（３４）免疫磁珠分离的脐血ＣＤ＿（３４）￣＋细胞，其纯度达８５％～。９５％；②甲基纤维素培养体系中，在不同组合的细胞因子作用下，脐血ＣＤ＿（３４）￣＋细胞的集落产率明显不同，单用ＩＬ－６最低，ＳＣＦ、ＩＬ－６、ＩＬ－３及Ｅｐｏ联用产率最高；③在低氧液体培养体系中，ＩＬ－６和ＩＬ６＋Ｅｐｏ不能有效地扩增脐血ＣＤ＿（３４）￣＋细胞，而其它细胞因子组合均可产生明显的扩增作用；其中加Ｅｐｏ的组合扩增效果显著高于无Ｅｐｏ的相应组合。脐血ＣＤ＿（３４）￣＋细胞分离、纯化及其体外扩增的研究对于脐血造血细胞库的建立，脐血造血细胞移植和基因导入的研究均具有重要意义。     

胎儿骨髓间质干细胞与细胞因子对脐血CD34+细胞扩增作用

目的　探讨胎儿骨髓间质干细胞对CD34 细胞体外扩增的造血支持作用。方法　体外分离、纯化胎儿骨髓间质干细胞 ;Mini MACS免疫磁珠分选 3份脐血CD34 细胞 ;建立胎儿骨髓间质干细胞与CD34 细胞共培养体系 :第 1组为单独CD34 细胞培养 ,第 2组为胎儿骨髓间质干细胞 CD34 细胞共培养 ,第 3组为细胞因子 (干细胞因子 ,白细胞介素 3,Flt3配体 ,血小板生成素 ) CD34 细胞共培养 ,第 4组为胎儿骨髓间质干细胞 细胞因子 CD34 细胞共培养。用流式细胞仪检测不同培养时间的CD34 细胞。结果　胎儿骨髓间质干细胞表达CD2 9,CD4 4 ;免疫磁珠分选CD34 细胞的平均纯度为 97.4 % ;胎儿骨髓间质干细胞 CD34 细胞共培养 2 8d ,有核CD34 细胞仍占有核细胞的 6 .4 3% ;CD34 细胞在胎儿骨髓间质干细胞、细胞因子作用下培养 2 8d ,有核细胞总数、CD34 细胞数分别被扩增 1.6 5× 10 5倍、788倍。结论　胎儿骨髓间质干细胞可有效扩增脐血造血干 /祖细胞。     

应用SCF＋IL—2等细胞因子从脐血CD34^＋细胞扩增T细胞

肿瘤和艾滋病（ＡＩＤＳ）的基因治疗或免疫治疗的研究需要大量的Ｔ细胞克隆。尽管Ｔ细胞来源于ＣＤ３４＾＋细胞,但由于需要胸腺组织的参与,使其在体外扩增大量细胞克隆非常困难。本研究用脐血单个核细胞作为辅助细胞,在ＳＣＦ＋ＩＬ－２等细胞因了的作用下,人脐血ＣＤ３４＾＋在此培养条件下,不断产生ＣＤ４＾＋或ＣＤ８＾＋Ｔ细胞至少持续３周。在培养扩增过程中,发现ＣＤ４＾＋和ＣＤ８＾＋Ｔ细胞的比例有一个不断变化的动     

GM-CSF对脐血CD34+巨核祖细胞体外扩增及分化的影响

本实验旨在研究GM-CSF对脐血CD34^＋细胞诱导分化为巨核细胞的影响.采用免疫磁珠法分选CD34^＋细胞,在含有TPO＋IL-3＋SCF并添加了不同浓度（5、20、100ng/ml）的GM-CSF的无血清培养基中进行培养.培养6、10、14天后计数单个核细胞（MNC）,检测CD41^＋细胞比例和CFU-MK.结果表明,培养14天后3种不同浓度GM-CSF对MNC均有明显的扩增作用,其中以20和100ng/ml GM-CSF的扩增效果较好.3种不同浓度的GM-CSF均使CD41^＋细胞比例增加,20和100ng/ml与5 ng/ml GM-CSF相比更能提高CD41^＋细胞的比例.5和20 ng/ml的GM-CSF能促进CFU-MK的形成,但100ng/ml的GM-CSF却抑制CFU-MK的形成.结论：在TPO＋IL-3＋SCF细胞因子组合中添加GM-CSF有利于促进脐血CD34^＋细胞诱导分化为巨核细胞.     

血小板生成素对CD34~ 造血祖细胞的协同扩增作用

血小板生成素(Tpo)是巨核细胞增殖分化和血小板形成的主要调控因子。为了探讨Tpo对CD34~ 造血祖细胞的协同扩增作用,我们利用免疫磁珠分离系统(MACS)分选出90.11％-97.57％纯度的脐带血CD34~ 细胞,在周的体外液体培养体系中,观察了Tpo与干细胞因子(SCF),IL-3,IL-6,红细胞生成素(Epo),粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和粒细胞集落刺激因子(G-CSF)不同组合的扩增效率。结果表明,Tpo具有明显的协同扩增作用,细胞总数、集落形成细胞(CFC)和CD34~ 细胞可分别被新增329.50±25.20倍,16.09±3.38倍和11.77±4.78倍,SCF IL-3 IL-6 Tpo组的扩增作用最强,含Tpo实验组的扩增效率明显高于不含Tpo组;同时,含Tpo的组合还使CFU-MK,CD41a~ 细胞,BFU-E和CFU-GM分别扩增了34.67±4.62倍,17.29±2.34倍,14.97±2.89倍和14.46±3.19倍。表明Tpo具有明显的扩增造血细胞的作用和刺激多系造血的活性。     

CD34^＋细胞来源的树突状细胞对骨髓间充质干细胞的生物学特性影响

本研究探讨间充质干细胞（mesenchymal stem cell,MSC）在抑制树突状细胞（dendritic cell,DC）发育过程中生物学特性的变化。将CD34^＋造血干细胞来源的树突状细胞与MSC共培养,用流式细胞术检测共培养后（DC／MSC）的表型变化;RT—PCR检测造血和免疫相关分子的表达;用诱导实验观察其分化潜能的改变。结果表明：DC／MSC不表达CD31、CD34、CD45、CD14、CD86。HLA—ABC、CD29、CD73的表达较对照组明显降低,即对照组与共培养组阳性率分别为93．1％vs13．44％,98．3％vs78．8％,95．3％vs 75．9％。另外,DC／MSC表达TGF—β,M—CSF等细胞因子均有所增加;进一步将DC／MSC向脂肪细胞诱导分化,诱导后细胞内不能形成脂滴,但其仍保持向成骨分化的特性。结论：DC发育对MSC的基本特性产生一定影响,导致MSC表面间质性标志表达减少,分化能力降低,而造血及免疫相关因子表达则增加。     

胎儿骨髓基质细胞协同外源性细胞因子对脐带血CD34^＋细胞的体外扩增作用

SCF和FL可促进造血干 祖细胞的增殖 ,是强有力的共刺激因子 ,而骨髓基质细胞所产生的c kit及Flk 2水平很低 ,因此基质细胞培养结合含有SCF或FL的细胞因子组合可提高造血干 祖细胞的扩增效率[1 ] 。SCF IL 3 IL 6 G CSF EPO和SCF IL 3 IL 6 FL EPO二种组合可高效扩增造血干 祖细胞[2 ] ,因此我们拟以上述二种细胞因子组合结合胎儿骨髓基质细胞培养以观察对脐带血CD3 4 细胞的体外扩增作用。材料与方法脐带血样品采自本院妇产科 ,胎儿骨髓采自 5 - 6月水囊引产的健康胎儿的四肢骨。胎儿骨髓基质细胞贴壁层的建立采用…