大鼠神经肽Y前体融合蛋白在大肠杆菌中的超表达

应用逆转录－聚合酶链式反应（ＲＴ－ＰＣＲ）从大鼠腋组织钓得神经肽Ｙ（ＮＰＹ）ｃＤＮＡ编码区序列。经ＤＮＡ序列测定证实其准确性后，将该ｃＤＮＡ定向亚克隆入一大肠杆菌的表达载体ｐＭＡＬ－Ｃ＿２的果糖结合蛋白（ＭＢＰ）基因中。ＤＮＡ测序表明ＮＰＹｃＤＮＡ与表达载体中ＭＢＰ开放阅读框架一致。将重组质粒转入大肠杆茵ＤＨ５α菌系中，该重组大肠杆菌在液体ＬＢ培养基中经１ｍｍｏｌ／Ｌ终浓度的ＩＰＴＧ诱导４ｈ，所表达的ＮＰＹ－ＭＢＰ融合蛋白产量高达大肠杆菌总蛋白量的６０％～７０％。超表达的ＮＰＹ经纯化后将为进一步进行结构与功能研究提供材料来源。     

P33^ING1基因生物学功能及研究进展

Ｇａｒｋａｖｔｓｅｖ等〔1〕采用ｃＤＮＡ消减杂交方法 (ｓｕｂｓｔｒａｃｔｉｖｅｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ)建立了一种从富含所需序列的ｃＤＮＡ文库中构建较简便ＧＳＥｓ(ｇｅｎｅｔｉｃｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒｅｌｅｍｅｎｔｓ)文库的方法 ,并结合体内选择技术 (ｉｎｖｉｖｏｓｅｌｅｃｔｉｏｎａｓｓａｙ) ,成功地克隆了一个新的肿瘤抑制基因 ,命名为ＩＮＧ1(ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｏｆｇｒｏｗｔｈ)。研究发现 ,Ｐ33ＩＮＧ1的过表达可有效抑制细胞生长 ,促进无生长因子条件下的细胞凋亡 ,在抑制细胞生长过程中 ,Ｐ33ＩＮＧ1与ｐ5 3相互…     

鼻咽癌细胞株SUNE1中EB病毒LMP1全基因克隆及部分？…

目的 研究广东地区鼻咽癌（ＮＰＣ）细胞株ＳＵＮＥ１中ＥＢ病毒ＬＭＰ１基因的结构特征。方法 利用聚合酶链反应从ＳＵＮＥ１细胞基因组中扩增ＬＭＰ１全长ＤＮＡ,并克隆到ｐｃＤＮＡ３载体中,采用Ｓａｎｇｅｒ双脱氧末端终止法测定ＳＵＮＥ－ＬＭＰ１ ３个外显子及２个内含子覆盖的序列,并与病毒原型Ｂ９５－８－ＬＭＰ１进行比较分析。结果 克隆到ｐｃＤＮＡ３中的ＳＵＮＥ１－ＬＭＰ１全基因长度为２．６ｋｂ,测序长度为     

脓胸相关淋巴瘤

脓胸相关淋巴瘤(ｐｙｏｔｈｏｒａｘａｓｓｏｃｉａｔｅｄｌｙｍｐｈｏｍａ,ＰＡＬ)是一种罕见的恶性肿瘤,是在治疗顽固性肺结核或结核性胸膜炎时使用人工气胸所导致的长期肺脓肿空洞基础上发展起来的恶性淋巴瘤。1987年由日本的Ｉｕｃｈｉ等〔1〕首次报道并命名为ＰＡＬ。1　组织来源及发病机制ＰＡＬ为非霍奇金淋巴瘤(ｎｏｎＨｏｄｇｋｉｎｓｌｙｍｐｈｏｍａ,ＮＨＬ)。免疫组化标记显示ＰＡＬ中Ｂ淋巴细胞单克隆性增殖,并含有ＥＢ病毒ＤＮＡ和ＥＢＶ潜膜蛋白(Ｌａｔｅｎｔｍｅｍｂｒａｎｃｅｐｒｏｔｅｉｎ,ＬＭＰ)。所以ＥＢＶ可能在本…     

人骨形态发生蛋白-2完整成熟肽基因的克隆

目的：克隆人骨形态发生蛋白－２（ｈＢＭＰ－２）完整肽基因。方法：依据Ｇｅｎｂａｎｋ中ｈＢＭＰ－２的序 化学合成两条引物,从人胎儿骨组织中提取得到的总ＲＮＡ中,通过反转录聚合酶链式反应（ＲＴ－ＰＣＲ）得到ｈＢＭＰ－２完整成熟肽基因。将所得的基因片段插入克隆载体ｐＵＣ－１９并转化大肠杆菌ＪＭ１０９,提取重组质粒,酶切并测序。结果：ＤＮＡ琼脂糖凝胶电泳显示：ＰＣＲ产物为一长约４００ｂｐ的带,阳性克隆质粒     

人白细胞介素—15cDNA的克隆及其在大肠杆菌中的表达

从正常人外周血中分离粘附的单核细胞，加入ＬＰＳ刺激４ｈ后提取细胞ｍＲＮＡ反转录获得ｃＤＮＡ第一链，用两对特异引物进行巢式ＰＣＲ扩增出含ＢａｍＨＩ酶切位点的编码人１Ｌ－１５成熟蛋白的ｃＤＮＡ，其大小约３６０ｂｐ。用ＰＥＧ法回收其片段并将其连接到ｐＢＳＳＫ载体的ＳｍａⅠ位点上进行序列分析，结果表明其序列与文献报道一致。然后再将其片段亚克隆插入到ｐＧＥＸ－２Ｔ的ＢａｍＨＩ位点。筛选插入方向正确的克隆，转化大肠杆菌ＪＭ１０９，以１ｍｍｏｌ／ＬＩＰＴＧ诱导５ｈ收集菌体直接进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ，与阴性对照相比，ＭＷ４４ＫＤ处多出一条带，紫外扫描显示此带占菌体蛋白总量的８．８％。ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ证实此带能够特异地与兔抗人ＩＬ－１５的抗体发生反应。证明ＲＴ－ＰＣＲ所得的人ＩＬ－１５ｃＤＮＡ在大肠杆菌中获得了表达，为进一步探讨人ＩＬ－１５的生物学作用打下基础。     

人补体膜辅助调节蛋白MCP的基因克隆及其真核表达的研究

目的　克隆获得编码人补体膜辅助调节蛋白（ ＭＣＰ） 的ｃＤＮＡ,并对其在真核细胞的表达及功能进行研究。方法　应用ＲＴＰＣＲ 方法,从Ｕ９３７ 细胞总ＲＮＡ 中扩增编码人ＭＣＰ 分子的ｃＤＮＡ片段, 快速克隆于ｐＧＥＭＴＥａｓｙ 载体,测定其序列。将该片段重组于ｐＬＸＳＮ 载体,电穿孔转染ＮＩＨ３Ｔ３ 细胞,经ＦＡＣＳ 检测筛选表达ＭＣＰ 的阳性细胞克隆,用补体溶破试验鉴定其抑制人补体溶破的功能。结果　ＲＴＰＣＲ 扩增得到１ １４４ｂｐ 的编码人ＭＣＰ 分子的ｃＤＮＡ 片段,序列分析表明该ｃＤＮＡ编码的蛋白为ＳＴＣ＋ ＣＹＴ２ 亚型。细胞转染筛选获得多个表达ＭＣＰ 的ＮＩＨ３Ｔ３ 阳性细胞克隆,补体溶破试验证实其具有抑制人补体经典途径和旁路途径溶破的功能。结论　本研究为进一步探讨不同亚型结构的ＭＣＰ 分子与功能的关系及其应用奠定了基础。     

大鼠重组中枢型乙酰胆碱转移酶单克隆抗体的制备(英文)

利用分子生物学方法制备了大鼠中枢型乙酰胆碱转移酶（ｃＣｈＡＴ）的单克隆抗体并利用免疫组织化学等方法进行了检测。以大鼠纹状体ｃＤＮＡ 为模板，扩增出长度为７１５ ｂｐ 的大鼠ｃＣｈＡＴ 基因片段（含外显子６～１０）。将该片段克隆到ｐＧＥＭ－Ｔ 载体中进行测序，将碱基序列正确的ｃＣｈＡＴ ｃＤＮＡ 片段定向插入ｐＭ ＡＬ－ｃ２ 载体中，构建成表达载体。利用ＤＮＡ测序对连接部位的阅读框架进行分析，未出现移码突变。将表达载体转化大肠杆菌并经诱导表达了分子量为６９ ｋＤａ 的融合蛋白，其大小与用表达载体的氨基酸序列所推导的分子量一致。用纯化后的融合蛋白作为抗原免疫Ｂａｌｂ／ｃ 小鼠，并获得了Ｍ ａｂ６７６ 克隆。利用Ｗ ｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ方法对其进行分析表明该克隆能识别大鼠脑组织提取物中分子量为６２ ｋＤａ 的蛋白成分，这与大鼠脑中ＣｈＡＴ 分子量的大小一致。利用此单克隆抗体进行免疫组织化学反应的阳性结构见于纹状体、苍白球、Ｂｒｏｃａ氏斜角带核、无名质、内侧隔核以及脑干的脑神经运动核等胆碱能神经元的聚集区。上述结果表明本研究所制备的单克隆抗体具有识别大鼠ｃＣｈＡＴ 的特异性。     

人核糖体磷酸蛋白P2基因的克隆及鉴定

利用聚合酶链式反应技术（ＰＣＲ），从人肺巨细胞癌ＰＬＡ－８０１母系细胞系统克隆化高转移细胞株Ｄ中特异性扩增Ｐ２ ｃＤＮＡ（Ｈｕｍａｎ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ｐｈｏｓｐｈｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｐ２ ｇｅｎｅ ｃＤＮＡ），并将扩增产物克隆入ｐＧＥＭ－３Ｚ载体，获得了重组质粒ｐＭＰ２，对其中两个克隆ｐＭＰ２－１、ｐＭＰ２－２的Ｐ２ ｃＤＮＡ进行了序列分析。结果表明：ｐＭＰ２－１的Ｐ２ｃＤＮＡ序列与文献报道基本     

rhBMP-2及其载体在脊柱融合中的应用研究进展

脊柱融合常采用自体骨移植 ,但其来源有限、假关节发生率高且常有供骨区痛等并发症。骨形态发生蛋白 2是诱导成骨活性最强的细胞因子之一 ,其基因重组产品———重组人骨形态发生蛋白 - 2 (ｒｈＢＭＰ 2 )是唯一获ＦＤＡ批准临床应用的成骨因子 ,本文就其在脊柱融合中的研究应用进展作一综述。1 ｒｈＢＭＰ 2的来源及成骨作用ＢＭＰ 2无明显种属特异性 ,可从动物骨中提取用于人体 ,但ＢＭＰ 2在骨组织中含量极微 (每千克骨约含 1μｇ) ,纯度和活性不一致 ,难以满足科研及临床应用。 1988年 ,Ｗｏｚｎｅｙ[1] 用ｃＤＮＡ探针杂交技术确定编码…     

人MBL相关丝氨酸蛋白酶-1 cDNA的克隆与鉴定

目的 获得人甘露聚糖结合凝集素（ＭＢＬ）相关丝氨酸蛋白酶－１（ＭＡＳＰ－１）基因。方法 以人胎肝组织总ＲＮＡ为模板,采用ＲＴ－ＰＣＲ获取目的ｃＤＮＡ片段,克隆入ｐＧＥＭ－Ｔ载体,进行酶切图谱分析和测序鉴定。结果 以ＲＴ－ＰＣＲ方法获得了含信号顺序的全长ＭＡＳＰ－１ｃＤＮＡ,将其与ｐＧＥＭ－Ｔ载体连接,转化大肠杆菌ＴＧ１,建立了ＭＡＳＰ－１的ｃＤＮＡ克隆,酶切图谱与微机分析结果一致。序列分析表明。与     

人单核细胞超化蛋白—1（MCP—1）基因的PCR扩增,克隆…

本文报道用植物血凝素（ＰＨＡ）诱导健康人外周血单个核细胞（ＰＢＭＣ，包括单核细胞和淋巴细胞），提取细胞总ＲＮＡ，反转录合成ｃＤＮＡ第一链，再以其为模板进行ＰＣＲ，得到了编码成熟单核细胞趋化蛋白－１（ＭＣＰ－１）的ｃＤＮＡ。该ｃＤＮＡ用ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ双酶切后，回收含ＭＣＰ－１基因的长约２８０ｂｐ的ＤＮＡ片段，插入到经ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ双酶切的ｐＵＣ１９载体中，进行序列分析。结果表明，ＭＣ     

肝癌相关抗原基因的筛选和阳性克隆的序列分析

克隆肿瘤相关抗原基因,从分子水平上研究其结构与功能,对于深入了解肿瘤的发生机制很有帮助。本研究利用自制的肝癌特异性单克隆抗体（ｍＡｂ） Ｆ１１,筛选肝癌细胞ｃＤＮＡ表达文库,获得１个阳性克隆,并对其进行了序列测定及同源性比较分析。１材料和方法１． １材料抗肝癌ｍＡｂ Ｆ１１［１］为本室制备、纯化。肝癌细胞ｃＤＮＡ表达文库（载体为 λｇｔ１１）由本室构建。测序用试剂ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ＢｉｇＤｙｅＴＭ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ为ＰＥ公司产品。测序仪为ＡＢＩ ＰＲＩＳＭＴＭ ３３７ＸＬ型。１．２方法克隆的筛选按…     

PTA1酵母双杂交载体的构建

血小板／Ｔ细胞活化抗原１（ｐｌａｔｅｌｅｔａｎｄＴｃｅｌｌａｃｔｉｖａｔｉｏｎａｎｔｉｇｅｎｌ,ＰＴＡ１）是一种表达于活化Ｔ细胞、ＮＫ细胞及血小板表面的白细胞分化抗原和粘附分子,于１９９７年将其基因克隆成功〔１〕,又被称为ＤＮＡＸ辅助分子１（ＤＮＡＸａｃｃｅｓｓｏｒｙｍｏｌｅｃｕｌｅ１,ＤＮＡＭ１）〔２〕。ＰＴＡ１参与血小板的活化和混合淋巴细胞反应中杀伤性Ｔ细胞的诱导。序列分析表明,ＰＴＡ１是一种穿膜糖蛋白,全长３１８ａａ。其中胞膜外区２３２ａａ,包括信号肽和２个Ｉｇ样结构域,穿膜区２５ａａ…     

hAR-N单克隆抗体免疫学特性的研究及其应用

前列腺癌组织中雄激素受体 (ＡＲ)含量与术后采用抗雄激素疗法的反应程度、术后复发、转移率的发生密切相关〔1〕。ＡＲ的检测方法多为免疫组化法〔2〕。其所需试剂———ＡＲＭｃＡｂ国内尚无 ,为此我们研制ＡＲＭｃＡｂ。以美国Ｚｙｍｅｄ公司ＡＲ多抗为标准对自制ＡＲＭｃＡｂ性能进行鉴定 ,以便为临床和科研工作提供性能稳定可靠、质优价廉的免疫试剂。材料与方法动物 :ＢＡＬＢ/ｃ小鼠 ,雌性 ,6～ 8周龄 ,购自北京医科大学动物实验中心。抗原 :ｈＡＲ Ｎ段 2 0个氨基酸合成肽 (该区具有高亲水性 ,与其它类固醇激素具有很少同源性 )由北…     

鼻咽癌细胞株SUNE1中EB病毒LMP1全基因克隆及部分序列的测定

目的　研究广东地区鼻咽癌（ＮＰＣ） 细胞株ＳＵＮＥ１ 中ＥＢ病毒ＬＭＰ１ 基因的结构特征。方法　利用聚合酶链反应从ＳＵＮＥ１ 细胞基因组中扩增ＬＭＰ１ 全长ＤＮＡ,并克隆到ｐｃＤＮＡ３ 载体中,采用Ｓａｎｇｅｒ 双脱氧末端终止法测定ＳＵＮＥ１ＬＭＰ１ ３ 个外显子及２ 个内含子覆盖的序列,并与病毒原型Ｂ９５８ＬＭＰ１ 进行比较分析。结果　克隆到ｐｃＤＮＡ３ 中的ＳＵＮＥ１ＬＭＰ１ 全基因长度为２－６ ｋｂ,测序长度为１３１２ ｂｐ,与Ｂ９５８ＬＭＰ１ 比较,核苷酸与氨基酸的同源性分别为９８－５ ％ 和９６ ％ ,核苷酸及氨基酸变异主要在第３ 外显子,但无Ｃ端３４３～３５２ 密码子３０ 个碱基的缺失,第１ 外显子上有ＸｈｏⅠ酶切位点的丢失。结论　广东地区ＮＰＣ细胞株ＳＵＮＥ１ 中,病毒ＬＭＰ１ 基因与原型株之间尽管致瘤性存在差异,但仍具有较高的同源性。提示ＮＰＣ细胞中ＬＭＰ１ 的致瘤特征可能并非由于ＬＭＰ１ 基因某些特定核苷酸突变所致     

霍乱弧菌与大肠杆菌recA基因的功能互补性分析

细菌ＲｅｃＡ蛋白具有蛋白水解酶活性 ,其作用除参与ＤＮＡ重组之外 ,还参与ＤＮＡ修复、突变和细胞分裂 ,是一种多功能蛋白〔1〕。在许多革兰阳性和阴性细菌中存在功能相似的ＲｅｃＡ样蛋白〔2〕。曾发现ＲｅｃＡ对霍乱毒素基因在霍乱弧菌染色体上的拷贝扩增起作用 ,使菌株的毒力增强〔3〕。另外 ,霍乱弧菌ｒｅｃＡ突变株在研制遗传稳定和安全的活疫苗中可能具有实际意义〔4〕。在本研究中 ,我们克隆了ＥｌＴｏｒ型霍乱弧菌的ｒｅｃＡ基因 ,检测了霍乱弧菌ｒｅｃＡ对ｒｅｃＡ突变的大肠杆菌工程受体菌株的功能互补性 ,并与其它一些能检索到…     

DNA免疫法制备抗人Flt3-ligand单克隆抗体及其鉴定

Ｆｌｔ3 ｌｉｇａｎｄ(ＦＬ)是近几年新发现的一种相对分子质量 (Ｍｒ)为 30 0 0 0的糖蛋白 ,其中有Ｍｒ 为 120 0 0的糖类〔1,2〕,主要参与体内的造血调控。在体外培养体系中 ,Ｆｌｔ3 ｌｉｇａｎｄ可与ＩＬ 3,ＩＬ 6,ＳＣＦ及ＧＭ ＣＳＦ等细胞因子协同 ,刺激造血干 /祖细胞增殖 ,并能协同诱导造血干 /祖细胞分化为树突状细胞等 ,因而在造血干 /祖细胞的体外培养中获得广泛应用〔1,3〕。ＤＮＡ免疫法是一种新的制备单克隆抗体(ｍＡｂ)的免疫方法 ,它不需要制备大量抗原 ,只需将编码抗原的ｃＤＮＡ克隆到真核表达载体上 ,用重组质粒对动物…     

人钙调素基因表达载体的构建及在大肠杆菌DH5α中的表达

目的;构建人钙调素基因表达载体并在大肠杆菌ＤＨ５α中高效表达人ＣａＭ蛋白。方法：用ＰＣＲ方法获得人钙调素基因Ⅲ（ｈＣａＭⅢｃ ＤＮＡ）,将其插入表达载体ｐＢＶ２２０,构建重组表达质粒ｈＣａＭα／ｐＢＶ２２０,用酶切,ＤＮＡ测序,ＰＣＲ扩增鉴定阳性克隆。结果：阳性重组子在大肠杆菌ＤＨ５α中经温度诱导可高效表达ＣａＭ蛋白,经１５％ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析,可观察到一分子量与理论值相符的诱导表达条带,其表达     

小鼠免疫共刺激信号B7—2 cDNA的克隆与序列测定

应用反转录ＰＣＲ的技术从小鼠脾细胞中克隆了免疫共刺激信号Ｂ７－２编码区ｃＤＮＡ。小鼠脾细胞经ＬＰＳ刺激２４ｈ后，提取总ＲＮＡ，以总ＲＮＡ为模板进小鼠Ｂ７－２ｃＤＮＡ的反转录ＰＣＲ扩增，获得一特异扩增带，与预期值相符，将扩增的ＤＮＡ克隆于ｐＵＣ１８质粒中，序列测定表明其序列与文献报道一致。