地高辛标记的cRNA探针在胰岛素mRNA原位分子杂交中的应用

采用雄性成年Wistar大鼠胰腺,用地高辛标记的cRNA探针进行原位分子杂交,以检测胰岛B细胞的胰岛素基因表达产物mRNA;同时用免疫组织化学PAP法显示相邻切片胰岛素免疫反应阳性细胞,进行原位比较。1.标本制备:大鼠经4%多聚甲醛灌流固定,取胰尾,入Bouin液固定20h,常规石蜡包埋,切片厚6μm,裱在用铬矾明胶处理的载片上。2.探针标记:用RNA标记试剂盒(Boehringer Mannheim     

小鼠Brd2基因探针的制备及其在荧光原位杂交实验中的应用

目的:为观察溴结构域包含蛋白2(bromodomain containing protein 2,Brd2)基因在小鼠中枢神经系统的表达与分布,本研究制备了两条地高辛标记的Brd2 cRNA探针。方法:提取小鼠脑组织总RNA,设计两对Brd2引物,通过逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)方法,扩增得到两个Brd2的DNA片段,并将它们分别克隆到pCRⅡ-TOPO载体中。利用体外转录方法合成地高辛标记的cRNA探针,最后通过荧光原位杂交实验分析所标记探针的特异性及杂交效果。结果:本实验成功构建了两个Brd2/pCRⅡ-TOPO质粒,获得了特异性的地高辛标记的Brd2cRNA探针,在荧光原位杂交实验中应用两条探针得到了较好的杂交信号。结论:本实验制备的地高辛标记的cRNA探针可特异地检测Brd2 mRNA,为进一步观察Brd2 mRNA在中枢神经系统的分布及功能研究提供了工具。     

原位双杂交法研究Rb、p16ink4基因在非小细胞肺癌中的转录

目的 :探讨非小细胞肺癌组织中Rb、p1 6INK4 基因的转录。方法 :分别以Bio标记RbcDNA探针、Dig标记p1 6INK4 cDNA探针 ,进行mRNA原位双杂交。结果 :以Bio 辣根过氧化物酶 AEC系统检测Rb基因转录 ,阳性结果为红色 ,阳性率为 83 9% (2 6/3 1 ) ;以Dig 碱性磷酸酸酶 NBT/BCIP系统检测 p1 6INK4 基因转录 ,阳性结果呈蓝色 ,阳性杂交率为 77 4% (2 4/3 1 )。结论 :mRNA原位双杂交法具直观、适合少量细胞、能排除癌组织中混有间质细胞的影响、过程简便等优点 ,Rb、p1 6INK4 基因在非小细胞肺癌发生中起协同调控作用     

地高辛标记的血小板T细胞活化抗原在cRNA探针的制？…

目的 制备用地高辛标记的血小板Ｔ细胞活化抗原１ｃＲＮＡ探针。方法 构建重组质粒ｐＧＥＭ－３ＺＦ（＋）－ＰＴＡ１,并做序列分析证实ＰＴＡ１基因的插入方向正确后,用ＥｃｏＲＩ消化得到线性ＤＮＡ片段,再用ＳＰ６ＲＮＡ聚合酶转录合成带有Ｄｉｇ标记的高比活度的单链ｃＲＮＡ探针。结果辛标记ＰＴＡ１ｃＲＮＡ探针的制备,为进一步研究ＰＴＡ１ｍＲＮＡ在组织、细胞的表达和分布提供了有效的工具。     

甲状腺过氧化物酶mRNA cRNA探针的构建及意义

目的 探讨甲状腺过氧化物酶(thyroperoxidase,TPO)mRNA cRNA探针的构建及原位表达的检测方法 和意义.方法 取甲状腺结节新鲜组织,在RT-PCR扩增TPO cDNA的基础上,构建pSPT19-TPO质粒,经Hind Ⅲ和BamHⅠ单酶切后成线性化模板,在SP6和T7 RNA聚合酶作用下,体外转录合成地高辛标记的TPO cRNA反义和正义探针,进行TPO mRNA的原位杂交实验.结果 TPO mRNA阳性杂交信号分布于甲状腺滤泡细胞的胞质,本组腺瘤2例、结节性甲状腺肿4例、瘤周甲状腺组织1例原位杂交阳性,乳头状癌2例、桥本病1例原位杂交阴性.核酸原位杂交和RT-PCR检测甲状腺组织TPO mRNA的表达,结果 一致.结论 成功构建甲状腺过氧化物酶mRNA 的cRNA探针;检测TPO mRNA是一种较准确反映甲状腺组织TPO状态的方法 ,TPO mRNA的原位检测可结合组织形态学了解甲状腺滤泡细胞的功能表达状况.     

应用化学发光法进行基因的筛选与鉴定

基本原理 进入九十代,德国Boehringer Mannheim公司推出了一种新型非放射性化学发光分子杂交技术。它采用随机引物标记法将半抗原Digoxigenin-11-dUTP掺入到标记核酸链中。Digoxigenin(Dig,毛地黄毒苷),是一种仅存在于毛地黄属植物中的类固醇化合物。标记好的探针与固定在尼龙膜上的模板进行常规预杂交和杂交后,通过洗膜,封闭,冉与偶联有碱性磷酸酶(AP)的抗Dig     

抗癌胚抗原(CEA)鼠/人嵌合单克隆抗体在体外和体内的活性(文摘)

本文通过重组DNA技术制备了抗人CE-A的鼠/人嵌合单抗,从分泌IgG1抗人CEA单抗的鼠杂交瘤系2.7.1G.10细胞中提取高分子量DNA。经限制性内切酶消化,蔗糖密度梯度离心,得到含重排的2、7、1G、10V_(11)和-V_K基因片段,重组入EMBL-3噬菌体中。用~(32)P标记的鼠1.5kb的Hind Ⅲ-EcoR Ⅰ J_(H)4探针和0.7kb Aval-Pstl Ju4-5探针筛     

地高辛标记探针原位杂交法检测肝病患者外周血单个核细胞中TTV-DNA

为检测肝病患者外周血单个核细胞(PBMC)中TTV-DNA(输血传播病毒脱氧核糖核酸), 以TTV ORF1为模板, 应用地高辛(Dig)作为标记物, 经聚合酶链反应(PCR)制备探针, 建立原位杂交方法进行检测.结果显示: 血清TTV-DNA阳性组, 双链探针检测PBMC中TTV-DNA, 阳性检出率为58.06%(18/31); 血清TTV-DNA阴性组, 双链探针检测PBMC中TTV-DNA, 阳性检出率为27.59%(8/29).双链探针阳性者, 再以负链探针检测其复制情况, 阳性率为22.2%(4/18). 结论: TTV可感染PBMC并在PBMC中复制.     

两种纳米金标记p53抗体探针的制备、表征和性质研究

目的制备IgG-Au-HRP和IgG-Au-DNA-HRP两种纳米金标记p53抗体探针,并对其进行生物学特征表征和性质研究。方法利用纳米金粒子与蛋白质非共价吸附和与巯基修饰的寡核苷酸以Au-S键共价结合的特点,将辣根过氧化物酶(HRP)直接或通过寡核苷酸链间接标记在纳米金表面,制备两种多功能纳米金生物探针(IgG-Au-HRP和IgG-Au-DNA-HRP探针);应用透射电镜、紫外-可见光光谱等对纳米金探针性能进行表征,对纳米金探针表面HRP酶活性进行分析,并通过酶免疫标记技术(enzyme linked immuncsorbent assay,ELISA)优化探针制备条件和比较两种探针标记效率。结果①两种新型探针具有良好的单分散性,大小均一,粒径约10nm;②p53蛋白检测效果对IgG-Au-HRP和IgG-Au-DNA-HRP探针制备条件优化结果表明:制备IgG-Au-HRP探针时,HRP分子和p53抗体的最佳比例为10:1;制备IgG-Au-DNA-HRP探针时,DNA和p53抗体的最佳比例为2.5:1;③HRP分子定量检测显示:一个IgG-Au-HRP探针可标记HRP数量约11个,IgG-Au-DNA-HRP探针可标记HRP数量为20个;④两种探针结合ELISA法初步检测p53蛋白判定IgG-Au-DNA-HRP探针比IgG-Au-HRP探针检测蛋白灵敏度高。结论两种新型纳米金探针制备简单,可作为一种新型探针应用于微量蛋白的高灵敏检测。     

地高辛精标记大鼠代谢型谷氨酸受体第5亚型RNA探针的制备研究

为制备用地高辛精标记的大鼠代谢型谷氨酸受体第 5亚型 c RNA探针 ,本实验用分子生物学技术重组质粒 p GEMm Glu R5 ,经限制性内切酶酶切分析 ,证实其确有 m Glu R5基因片段插入且方向正确。将此质粒再经限制性内切酶消化得到线性DNA片段 ,用 T7RNA聚合酶体外转录合成带有地高辛精标记的高比活性的单链 RNA探针 ;经斑点杂交实验证实该探针具有较高的敏感性和可靠性 ,可用于代谢型谷氨酸受体第 5亚型有关的研究     

人酪氨酸羟化酶RNA探针制备的研究

目的 制备地高辛标记的人酪氨酸羟化酶（ｈＴＨ２）ｃＲＮＡ探针。方法 用分子克隆技术重组质粒ｐＧＥＭＴＨ２。用体外转录法制备地高辛标记ｈＴＨ２ｃＲＮＡ探地，经限制性内切酶分析，显示重组质粒含有酪氨酸羟化，酶基因片段，且插入位点正确。使用斑点杂交证实我们制备的探针是敏感可靠的。结果 杂交阳性部位呈紫蓝色，深浅与稀释度成正比。     

RNA激发的DC体外诱导EBV特异性CTL的研究

本研究采用酶切等方法将质粒pSVTP1中LMP2a (latentmembraneprotein 2a)的编码基因克隆至pGEM 3Zf+,再经体外转录系统转录获得EBV LMP2aRNA ,将以此RNA激发的DC所诱导生成的CTL作为效应细胞分别与含EBV基因之一EBNA1、EBNA2、EBNA3c、LMP2a的重组病毒感染的正常人成纤维细胞混合后 ,采用LDH释放法检测细胞毒活性。结果显示 ,经体外转录的LMP2aRNA激发的DC所诱导的淋巴细胞对表达LMP2a抗原的成纤维细胞产生特异性的细胞毒活性 ,证实了这种RNA激发的DC能有效地诱导EBV特异性CTL的生成 ,为EBV相关肿瘤的免疫治疗提供了新的实验依据。     

地高辛标记的cDNA探针检测GM-CSFmRNA表达

采用随机引物法对人ＧＭ－ＣＳＦｃＤＮＡ 探针进行地高辛标记,核酸分子原位杂交技术对人胸腺细胞、骨髓基质细胞、白血病细胞株（ＨＬ－６０,Ｋ５６２）、脐血细胞和胎肝组织的ＧＭ－ＣＳＦｍ ＲＮＡ的表达水平进行检测。结果表明：地高辛标记的ＧＭ－ＣＳＦｃＤＮＡ 探针使用简便、灵敏度高、特异性强、杂交结果直观,探针可较长时间保存和无放射性污染等优点。     

人VMAT_2基因RNA探针制备及其在COS-7细胞中的表达

本研究目的在于制备人 型囊泡单胺转运体 (VMAT2 )基因的反义和正义 RNA探针 ,以检测 VMAT2 基因能否在真核细胞表达。从携带 p GEM-Easy-T-VMAT2 克隆载体中通过限制性酶切反应得到 VMAT2 基因 ,与 p BK-RSV载体重组构建真核表达载体 p BK-RSV-VMAT2 ;分别以 T7和 T3聚合酶制备反义和正义探针 ,通过斑点杂交检测探针浓度。转染猴肾成纤维细胞COS-7,原位杂交及免疫荧光细胞化学检测 VMAT2 的表达。结果证明 ,反义和正义探针浓度分别为 80 ng/μl及 12 0 ng/μl;原位杂交及免疫组织化学证实重组的真核表达载体 p BK-RSV-VMAT2 在 COS-7的表达阳性率为 (10 .6± 1.2 ) %。本研究结果表明获得 VMAT2 基因反义链及正义链 RNA探针 ,并检测到 VMAT2 基因在真核细胞中表达     

应用地高辛标记的cRNA探针原位杂交检测胰岛素mRNA

成年雄性Ｗｉｔａｒ大鼠，用地高辛标记的ｃＲＮＡ探针在胰腺切片上进行原位杂交，以检测胰岛Ｂ细胞胰岛素基因表达产物ｍＲＮＡ；同时并用免疫组织化学法显示相邻切片胰岛素免疫反应阳性细胞，进行比较，胰腺经４％多聚甲醋灌注固定，经Ｂｏｕｉｎ液再固定２０ｈ，常石蜡包埋和切片，经胰岛素ｃＲＮＡ探针杂交的胰腺切片中胰岛Ｂ细胞和核仁呈阳性反应，阳性信号为蓝色颗粒，胰岛其他细胞及胰腺泡细胞为阴性，方法照切片中均无阳性信     

针对乙型肝炎病毒前S2基因核酶的设计及体外切割 …

目的 体外研究核酶睦乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）前Ｓ２基因的作用。方法 设计合成一针对ＨＢＶａｙｗＤＮＡ前Ｓ２区第１１０，１２２和１３２位碱基的三靶位串联锤头状核酶基因，体外转录核酶基因和靶基因并进行切割实验；将核酶基因与逆转录病毒重组，转导２．２．１５细胞观察转导细胞聚人血清白蛋白受体的表达水平。结果 核酶在体外可有产切割靶原因的转录物，转入２．２．１５细胞后４周内对ＰＨＳＡ－Ｒ表达抑制率为５１．４５     

大鼠碱性成纤维细胞生长因子cDNA的克隆

为获取碱性成纤维细胞生长因子基因将之用于对帕金森病的实验治疗,本研究克隆了大鼠的碱性成纤维细胞生长因子的ｃＤＮＡ。实验用６ 周龄ＳＤ 大鼠卵巢提取的总ＲＮＡ,采用特异引物逆转录ＰＣＲ 获取目的ｃＤＮＡ 片段并将其连入克隆载体ｐＧＥＭ ３ｚｆ（＋ ）中,经ＡＢＩＰＲＩＳＭ ３７７ 测序仪双链测序后显示,目的片段长４５８ ｂｐ,与文献报道的碱性成纤维细胞生长因子序列相比存在一处碱基序列差异,无内含子。所克隆目的片段应为大鼠碱性成纤维细胞生长因子基因。     

具有GPX活性的单克隆抗体可变区基因的克隆和序列分析

目的利用分泌具有GPX活性的单克隆抗体(mAb)的杂交瘤细胞3G5,克隆其mAb体的可变区基因。方法提取杂交瘤细胞的总RNA ,分离mRNA ,反转录合成cDNA。经PCR扩增VH 基因和VL 基因 ,将VH 基因和VL基因与载体 pGEM T连接后 ,进行酶切鉴定和序列分析。结果构建了2个分别含有VH 和VL 基因的重组质粒。序列分析表明 ,VH 和VL 分别属于mouscheavychainsubgroupIII和mouselightchainsubgroupV亚群 ,长度为372和324bp ,编码124和108个氨基酸 ,在高变区分别有4和2个丝氨酸。结论克隆的VH 和VL 基因符合功能性重排的鼠抗体可变区基因特征 ,为将来制备具有GPX活性的单链抗体提供了可靠的基因材料。