体内构建组织工程骨的示踪观察：CM-DiI长效示踪骨髓间充质干细胞的可行性研究

目的探索组织工程骨体内成骨时,CM-DiI长效示踪骨髓间充质干细胞的可行性,为种子细胞的体内转归研究提供标记方法。方法分离比格犬BMSCs,成骨诱导至第2代,用荧光染料CM-DiI进行细胞标记。荧光倒置显微镜观察标记后的细胞形态,MTT比色法测定标记前后BMSCs的增殖状况,检测标记前后Ⅰ型胶原（Col-Ⅰ）、骨形态发生蛋白（BMP-2）、骨钙素（BGLAP）和骨黏连蛋白（SPARC）的表达。最后,CM-DiI荧光标记后的BMSCs与β-TCP复合共培养后植入比格犬背部皮下,8周后取材,荧光显微镜下观察BMSCs体内转归,HE染色观察异位成骨情况。结果CM-DiI标记后早期细胞呈现红色荧光,48 h后荧光增强,72 h内荧光强度无明显减弱。BMSCs在CM-DiI标记前后细胞形态基本一致,两组间细胞的增殖率无明显差别;标记后RT-PCR检测Col-Ⅰ、BMP-2、BGLAP、SPARC表达,显示标记后的BMSCs亦可向成骨方向分化。扫描电镜检测到标记后细胞在β-TCP上增殖良好,细胞基质分泌丰富。细胞-支架复合物植入比格犬皮下,8周后荧光显微镜观察到标记细胞仍存在,且HE染色可见支架孔隙中有类骨基质沉积。结论CM-DiI对BMSCs的生长增殖、成骨分化无明显影响,对体内组织工程骨中BMSCs的示踪时间可长达8周,可用作体内细胞的长效示踪剂。     

PKH26标记法在组织工程神经种子细胞体内示踪中的应用

目的 探讨PKH26标记骨髓间充质干细胞(BMSCs)的效果及其应用于组织工程神经种子细胞体内示踪实验的可行性.方法 取Wistar大鼠股骨和胫骨的骨髓,用全骨髓贴壁的方法分离、培养BMSCs.用PKH26荧光染料进行标记,荧光显微镜下观察标记效果,流式细胞仪检测荧光标记率,MTT法测定细胞的活性,体外成脂和成骨诱导鉴定细胞的分化能力,并与未标记细胞进行比较;使用显微注射的方法将BMSCs植入去细胞神经支架内制备成组织工程神经,于体外培养3 d、5 d、7 d、14 d,行组织切片,观察BMSCs在支架内存活、迁移的情况.另外,将体外构建组织工程神经桥接Wistar大鼠坐骨神经15 mm的缺损,于术后1周、4周、6周、8周取出移植物,行组织切片观察植入的BMSCs在支架内的存活情况.结果 PKH26能有效地标记BMSCs,标记率达95%以上,标记后细胞活性及诱导成骨成脂分化能力与未标记细胞无明显差异.在体外培养的环境下,BMSCs能在去细胞神经支架里粘附生长,并沿着支架迁移;在体内外周围神经再生的微环境下,BMSCs可存活8周以上.结论 PKH26荧光染料标记法是一种有效的标记BMSCs的方法,可用于组织工程神经种子细胞体内示踪的研究.     

应用荧光蛋白示踪组织工程骨体外构建的实验研究

目的应用荧光蛋白标记技术对组织工程骨体外构建过程进行细胞示踪。方法采用逆转录病毒pLEGFP-N1对种子细胞进行荧光蛋白标记,以羟基磷灰石为支架材料,体外构建细胞-材料复合体,测定细胞的粘附率。通过倒置荧光显微镜,定期观察种子细胞在支架材料内的分布。结果逆转录病毒载体pLEGFP-N1成功标记人骨髓基质干细胞(BMSCs),并对组织工程骨的体外构建和4周的体外培养进行了良好示踪;标记细胞的粘附率为(90.3±2.1)%,无标记处理细胞的粘附率为(92.0±1.5)%,两组数据差异无显著性意义(P=0.236)。结论采用逆转录病毒介导方式对种子细胞进行荧光蛋白标记后,细胞在材料内仍维持较高的粘附能力,这有利于对体外构建和长期培养组织工程骨时进行种子细胞示踪。     

骨髓基质干细胞与软骨脱细胞基质多孔支架异位构建组织工程化软骨的实验研究

目的 探讨骨髓基质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)与软骨脱细胞基质多孔支架(cartilage ECM-derived porous scaffold,CEDPS)在裸鼠体内异位构建软骨的可行性,并建立利用PKH26荧光和分子荧光活体成像系统无创评估组织工程化细胞-支架复合体在体内生长情况的新方法.方法 PKH26荧光标记成软骨诱导的BMSCs,接种入CEDPS支架,体外进行电镜、Desd/Live荧光染色观察,然后植入裸鼠背部,4周后利用分子荧光活体成像系统无创伤性评估组织工程化组织在裸鼠体内生长情况,取材进行组织学以及Ⅱ型胶原免疫荧光检测,与荧光图像比较.结果 体外培养的BMSCs-CEDPS复合体电镜检查结果表明随着培养时间的增加,细胞在支架中增殖显著,细胞基质分泌增加,Dead/Live染色表明BMSCs在支架内部活性良好.4周后活体荧光示踪显示BMSCs在支架内生长良好,无扩散趋势,BMSCs-CEDPS复合体在裸鼠体内生成软骨样组织,番红"O"、甲苯胺蓝染色、Ⅱ型胶原免疫组化染色阳性,免疫荧光检查表明构建的软骨样组织内的细胞来源为接种的PKH26标记的BM-SCs.结论 利用BMSCs和CEDPS支架能够在裸鼠皮下异位构建类软骨样组织.PKH26标记与分子荧光活体成像系统结合,能够无创伤性评估组织工程化组织的种子细胞在动物体内生长情况与转归.     

在体种植后骨髓基质干细胞(BMSCs)的定位及成骨效应研究

目的 探讨骨髓基质干细胞(BMSCs)与支架材料复合，并种植到动物体内后的定位及成骨情况。方法 分离培养绿色荧光蛋白(GFP)小鼠BMSCs，体外扩增后与猪脱细胞骨基质材料复合，植入裸鼠背部作为实验组，并以单纯材料植入作为对照组，8周后进行大体观察、常规组织学检查及荧光检测、结果 实验组移植物周围部成骨明显，GFP阳性细胞较多；中央部材料降解吸收，GFP阳性细胞少见。对照组成骨较少。结论 BMSCs作为种子细胞参与了骨重建，同时GFP示踪是观测BMSCs的一种较好方法。     

组织工程骨软骨复合物的构建与形态学观察

目的探讨采用组织工程技术构建骨软骨复合物的可行性。方法将骨髓基质细胞(BMSCs)成诱导软骨后接种于快速成形的三维支架材料聚乳酸／聚羟乙酸共聚物(PLGA)构建组织工程软骨，经成骨诱导的BMSCs接种于聚乳酸／聚羟乙酸共聚物／磷酸三钙(PLGA／TCP)构建组织工程骨，在体外分别培养2周后，将两种工程化组织及两者以无损伤线缝合形成的组织工程骨软复合体分别植入自体股部肌袋，术后8周取材，行组织学观察。结果术后组织学观察表明。组织工程软骨在体内可形成软骨组织组织工程骨在体内可形成骨组织，两者的复合体在体内可形成骨软骨复合物。结论以骨髓基质细胞为种子细胞、以快速成形的生物降解材料为支架体外构建的组织工程骨软骨复合物，可在体内形成骨软骨组织，有望用于骨软骨缺损的修复。     

应用荧光蛋白标记技术对体外构建组织工程软骨的监测

目的: 应用荧光蛋白标记细胞的技术, 对组织工程软骨体外构建过程进行活细胞的实时示踪。方法: 采用逆转录病毒载体pLEGFP N1对人间充质干细胞进行荧光蛋白标记, 以同期培养未标记细胞为对照组, 体外构建细胞 材料复合体, 通过倒置荧光显微镜和扫描电镜观测种子细胞在支架材料内的分布与数量, 并对培养 7d的两组复合体进行细胞数量比较。结果: 逆转录病毒载体pLEGFP N1成功标记间充质干细胞, 并应用于工程化组织体外构建的示踪; 第 7d标记组细胞数 (3. 4±0. 1)×106 /个复合体, 未标记组细胞数 (3. 6±0. 1)×106 /个复合体, 两组数据无统计学差异(P=0. 339)。结论: 采用逆转录病毒介导方式对种子细胞进行荧光蛋白标记, 不影响细胞在材料内的增殖, 对体外构建组织工程软骨具有良好的示踪作用。     

骨髓基质细胞经CM-Dil标记后的活性及移植到损伤脊髓的示踪观察

目的 观察骨髓基质细胞(BMSCs)经CM-Dil荧光染料标记后的生物活性及移植后在损伤脊髓中的迁移和分布.方法 取Wistar大鼠的第3代BMSCs消化后分两组,实验组和对照组,实验组以CM.DiI标记,另一组正常细胞不标记,测定生长曲线.以改良Allen法制备脊髓损伤模型,将CM.DiI标记的BMSCs通过蛛网膜下腔注射移植,分别于移植后24 h、1、2、3、4周取损伤脊髓段作冰冻切片,倒置荧光显微镜下观测移植的BMSCs在损伤脊髓中的迁移和分布规律.结果 BMSCs经CM-Dil荧光染料标记成功率100%,实验组和对照组的生长曲线基本吻合;移植后24 h,脊髓损伤区未见标记细胞,移植后1周,标记的BMSCs开始迁移到损伤区硬脊膜下,移植后2～3周.BMSCs迁移、聚集在损伤脊髓的中心,移植后4周,仍有标记细胞聚集在脊髓损伤中心.结论 (1)BMSCs经CM-Dil荧光染料标记后的生物活性保持正常;(2)CM-Dil标记的BMSCs移植后能迁移聚集在损伤脊髓的中心,CM-Dil在活体内至少能维持4周     

骨髓基质干细胞复合小肠黏膜下层体内异位成骨的研究

目的 观察骨髓间充质干细胞复合小肠黏膜下层构建组织工程骨膜的异位成骨能力.方法 将常规方法培养的BMSCs与SIS复合(M1组)及进行成骨诱导培养BMSCs与SIS复合(M2组)植入兔(n=8)背部肌袋内作为实验组,以单纯SIS作为阴性对照.术后4、8、12周观察其成骨情况.结果 BMSCs在SIS支架上黏附、生长良好.植入体内4、8、12周,M2、M1、SIS组成骨量分别为(25.08±0.79)%、(18.81±0.42)%和(13.98±1.86)%,各指标M2组高于M1或SIS组(P<0.05),M1组高于SIS组(P<0.05).随着时间的延长,两实验组成骨量逐渐增加(P<0.05),SIS组的成骨量变化不明显(P>0.05). 结论 BMSCs与SIS复合构建组织工程骨膜在体内有异位成骨作用,而且经过成骨诱导的组织工程骨膜成骨作用更加明显.     

玉米醇溶蛋白仿生组织工程支架材料体内外诱导成骨的实验研究

目的 检测玉米醇溶蛋白(zein)仿生三维多孔支架材料的生物相容性、骨诱导性和生物可降解性. 方法 将人骨髓基质干细胞(BMSCs)载人海藻酸钠或zein制成复合物.通过扫描电镜观察、噻唑蓝分析法以及碱性磷酸酶染色与定量检测,分别比较zein和海藻酸钠对BMSCs体外黏附、增殖和分化的影响.取24只8周龄裸鼠,随机分为两组,制成肌袋植入异位成骨模型.对照组单纯植入zein,实验组植入zein与兔BMSCs复合物.术后2、4、8和12周取材进行影像学和组织学观察. 结果 与海藻酸钠相比,zein在任何时间段均能够更好地促进兔BMSCs的体外增殖和分化,差异有统计学意义(P<0.05).同时,与单纯植入zein相比,BMSCs能够增强zein体内诱导成骨的作用. 结论 zein具有良好的生物相容性、骨诱导性和生物可降解性.     

骨髓间充质干细胞体外构建组织工程化半月板

目的探索以骨髓间充质干细胞（BMSCs）为种子细胞,在体外构建具有完整内侧半月板形态的软骨样组织的方法。方法运用模具制备内侧半月板形的PGA/PLA支架。抽取犬骨髓,分离培养BMSCs,将其接种于支架材料上,5 d后使用软骨诱导液培养。体外培养6周后,行大体观察、组织学检测及生物力学检测。结果细胞材料复合物能够较好地维持半月板三维立体结构,形成了表面光滑、触之有弹性的瓷白色软骨样组织。 HE染色可见典型的软骨陷窝出现,说明成熟软骨组织的形成。Safranine O染色证实有蛋白聚糖基质产生。生物力学检测显示,新生组织弹性模量达正常半月板组织的12.7%。结论 BMSCs通过体外诱导,可在体外分化为较成熟的软骨组织,并构建出组织工程化半月板。     

In vivo bioluminescence imaging study to monitor ectopic bone formation by luciferase gene marked mesenchymal stem cells

Mesenchymal stem cells (MSCs) represent a powerful tool for applications in regenerative medicine. In this study, we used in vivo bioluminescence imaging to noninvasively investigate the fate and the contribution to bone formation of adult MSCs in tissue engineered constructs. Goat MSCs expressing GFP‐luciferase were seeded on ceramic scaffolds and implanted subcutaneously in immune‐deficient mice. The constructs were monitored weekly with bioluminescence imaging and were retrieved after 7 weeks to quantify bone formation by histomorphometry. With increasing amounts of seeded MSCs (from 0 to 1 × 10⁶ MSC/scaffold), a cell‐dose related increase in bioluminescence was observed at all time points, correlating with increased bone formation at 7 weeks. To investigate the relevance of MSC proliferation to bone deposition, cell‐seeded scaffolds were irradiated. The irradiated cells were functional with respect to oxygen consumption but no increase in bioluminescence was observed in vivo, and only minimal bone was produced. Proliferating MSCs are likely required for initiation of bone formation in tissue engineered constructs in vivo. Bioluminescence is a useful tool to monitor cellular responses and predict bone formation in vivo. © 2008 Orthopaedic Research Society. Published by Wiley Periodicals, Inc. J Orthop Res 26:901–909, 2008     

转染人血管内皮生长因子基因的组织工程骨修复眼眶壁骨缺损的实验研究

目的探讨以转染人血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)基因的骨髓基质干细胞(Bone marrow stromal cells,BMSCs)构建的组织工程骨在犬眼眶壁骨缺损中的修复效果。方法体外分离扩增犬自体BMSCs至第2代,用腺病毒转染VEGF基因。采用Real-time PCR和Western Blot检测目的基因和蛋白表达情况。细胞接种在珊瑚支架材料上构建组织工程骨,Elisa检测转基因细胞在支架材料上的蛋白持续表达情况。成年比格犬24只,双侧眼眶内侧壁制造直径12mm圆形骨缺损模型,随机分为4组:A组植入转染VEGF的组织工程骨,B组植入未转染基因的组织工程骨,C组植入单纯珊瑚材料,D组为旷置组。分别在手术后4周、12周、24周取材,行大体观察、Micro-CT分析、免疫组化方法检测血管形成情况,以及组织学观察和组织形态学检测比较骨缺损修复效果。结果VEGF基因修饰的BMSCs能够高表达目的基因和蛋白,构建组织工程骨后能够在体外持续分泌VEGF蛋白22d。C组和D组均未修复眶壁骨缺损。A组在骨缺损修复过程中,4周时的新生血管形成量和新生骨体...     

Establishment of Three‐Dimensional Tissue‐engineered Bone Constructs Under Microgravity‐simulated Conditions

Bone constructs have been grown in vitro with use of isolated cells, biodegradable polymer scaffolds, and bioreactors. In our work, the relationships between the composition and mechanical properties of engineered bone constructs were studied by culturing bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) on ceramic bovine bone scaffolds in different environments: static flasks and dynamic culture system in rotating vessels—which was a National Aeronautics and Space Administration‐recommended, ground‐based, microgravity‐simulating system. After 15 days of cultivation, osteogenicity was determined according to DNA and alkaline phosphatase (ALP) analysis. DNA content and ALP were higher for cells grown on dynamic culture. Subsequently, the two kinds of engineered bone constructs were selected for transplantation into Sprague‐Dawley rat cranial bone defects. After 24 weeks of in vivo implantation, the engineered bone constructs under dynamic culture were found to repair the defects better, with the engineered constructs showing histologically better bone connection. Thus, this dynamic system provides a useful in vitro model to construct the functional role and effects of osteogenesis in the proliferation, differentiation, and maturation of BMSCs. These findings suggest that the hydrodynamic microgravity conditions in tissue‐culture bioreactors can modulate the composition, morphology, and function of the engineered bone.     

组织工程化软骨分泌的可溶性因子对骨髓基质干细胞诱导作用的实验研究

目的 探讨组织工程化软骨分泌的可溶性因子是否能够单独诱导骨髓基质干细胞(bone marrow stromai cells,BMSCs)软骨分化.方法 体外培养扩增猪BMSCs、猪关节软骨细胞以及皮肤成纤维细胞,以5.0×107/ml的细胞终浓度分别接种于聚羟基乙酸/聚乳酸(PGA/PLA)支架,应用隔离池进行隔离共培养.以软骨细胞-材料复合物与BMSCs-材料复合物隔离共培养为实验组,以皮肤成纤维细胞-材料复合物与BMSCs-材料复合物隔离共培养为对照组1,以单纯BMSCs-材料复合物为对照组2.各组标本均于体外培养8周后取材,通过大体观察,组织学,以及免疫组织化学,RT-PCR等方法对新生组织进行评价.结果 隔离共培养8周后,实验组软骨细胞材料-复合物诱导的BMSCs-材料复合物形成的组织略有缩小,外观类似软骨组织,组织学检测见软骨陷窝样结构,SafraninO染色可见软骨特异性基质分泌,免疫组化显示有大量Ⅱ型胶原沉积,RT-PCR检测组织表达Ⅱ型胶原、Ⅸ型胶原、COMP、Sox9等软骨特异性基因,提示形成了较成熟软骨样组织;而对照组成纤维细胞材料复合物诱导的BMSCs-材料复合物和未经任何诱导的BMSCs-材料复合物形成的组织淡黄色,明显缩小、变薄、质地较软,组织学检测均未形成软骨陷窝样结构,主要为纤维性成分,各种软骨特异性相关检测均为阴性.结论 软骨细胞分泌的可溶性因子能够单独诱导BMSCs软骨分化,可能是软骨细胞形成的微环境中发挥诱导作用的主要因素.     

组织工程化软骨分泌的可溶性因子对骨髓基质干细胞诱导作用的实验研究

目的 探讨组织工程化软骨分泌的可溶性因子是否能够单独诱导骨髓基质干细胞(bone marrow stromai cells,BMSCs)软骨分化.方法 体外培养扩增猪BMSCs、猪关节软骨细胞以及皮肤成纤维细胞,以5.0×107/ml的细胞终浓度分别接种于聚羟基乙酸/聚乳酸(PGA/PLA)支架,应用隔离池进行隔离共培养.以软骨细胞-材料复合物与BMSCs-材料复合物隔离共培养为实验组,以皮肤成纤维细胞-材料复合物与BMSCs-材料复合物隔离共培养为对照组1,以单纯BMSCs-材料复合物为对照组2.各组标本均于体外培养8周后取材,通过大体观察,组织学,以及免疫组织化学,RT-PCR等方法对新生组织进行评价.结果 隔离共培养8周后,实验组软骨细胞材料-复合物诱导的BMSCs-材料复合物形成的组织略有缩小,外观类似软骨组织,组织学检测见软骨陷窝样结构,SafraninO染色可见软骨特异性基质分泌,免疫组化显示有大量Ⅱ型胶原沉积,RT-PCR检测组织表达Ⅱ型胶原、Ⅸ型胶原、COMP、Sox9等软骨特异性基因,提示形成了较成熟软骨样组织;而对照组成纤维细胞材料复合物诱导的BMSCs-材料复合物和未经任何诱导的BMSCs-材料复合物形成的组织淡黄色,明显缩小、变薄、质地较软,组织学检测均未形成软骨陷窝样结构,主要为纤维性成分,各种软骨特异性相关检测均为阴性.结论 软骨细胞分泌的可溶性因子能够单独诱导BMSCs软骨分化,可能是软骨细胞形成的微环境中发挥诱导作用的主要因素.     

组织工程化软骨分泌的可溶性因子对骨髓基质干细胞诱导作用的实验研究

目的 探讨组织工程化软骨分泌的可溶性因子是否能够单独诱导骨髓基质干细胞(bone marrow stromai cells,BMSCs)软骨分化.方法 体外培养扩增猪BMSCs、猪关节软骨细胞以及皮肤成纤维细胞,以5.0×107/ml的细胞终浓度分别接种于聚羟基乙酸/聚乳酸(PGA/PLA)支架,应用隔离池进行隔离共培养.以软骨细胞-材料复合物与BMSCs-材料复合物隔离共培养为实验组,以皮肤成纤维细胞-材料复合物与BMSCs-材料复合物隔离共培养为对照组1,以单纯BMSCs-材料复合物为对照组2.各组标本均于体外培养8周后取材,通过大体观察,组织学,以及免疫组织化学,RT-PCR等方法对新生组织进行评价.结果 隔离共培养8周后,实验组软骨细胞材料-复合物诱导的BMSCs-材料复合物形成的组织略有缩小,外观类似软骨组织,组织学检测见软骨陷窝样结构,SafraninO染色可见软骨特异性基质分泌,免疫组化显示有大量Ⅱ型胶原沉积,RT-PCR检测组织表达Ⅱ型胶原、Ⅸ型胶原、COMP、Sox9等软骨特异性基因,提示形成了较成熟软骨样组织;而对照组成纤维细胞材料复合物诱导的BMSCs-材料复合物和未经任何诱导的BMSCs-材料复合物形成的组织淡黄色,明显缩小、变薄、质地较软,组织学检测均未形成软骨陷窝样结构,主要为纤维性成分,各种软骨特异性相关检测均为阴性.结论 软骨细胞分泌的可溶性因子能够单独诱导BMSCs软骨分化,可能是软骨细胞形成的微环境中发挥诱导作用的主要因素.