钠氢转运蛋白2敲出小鼠破骨细胞分化研究

目的 建立NHA2基因敲出小鼠模型,观察NHA2 -/-小鼠骨髓细胞分化为破骨细胞的能力及生长表型变化.方法 首先用NHA2+/-杂合子小鼠繁殖得到NHA2 -/-纯合子小鼠;以小鼠尾巴为材料做普通PCR鉴定其基因型;用RT-PCR检测基因敲出小鼠NHA2转录情况;从小鼠中取出骨髓进行破骨细胞诱导,观察其分化能力.结果 NHA2 -/-小鼠骨髓细胞体外诱导成成熟破骨细胞能力减弱;但小鼠生长表型无明显变化.结论 NHA2作为盐离子载体在体外对破骨细胞的成熟分化有一定影响,在小鼠体内可能与其它离子载体共同调节盐平衡系统.     

骨保护蛋白及配体与破骨细胞

破骨细胞对骨量的维持起重要作用,它的发育、成熟信号是由成骨细胞传递的。当受到骨吸收因子作用时,成骨细胞表达骨保护蛋白配体分子,与破骨前体细胞膜上的核因子κB受体激活子结合,使之分化、成熟为破骨细胞。而成骨细胞旁分泌的骨保护蛋白分子,则作为伪受体与核因子κB受体激活子竞争结合骨保护蛋白配体,从而抑制破骨细胞的生成。骨保护蛋白配体-核因子κB受体激活子-骨保护蛋白组成了破骨细胞分化的信号传导通路,对它的认识有助于临床治疗代谢性骨病。     

新型骨生长因子——乳铁转运蛋白

乳铁转运蛋白是铁转运蛋白家族中的一种铁结合糖蛋白,广泛存在于各种粘膜表面,是一种有效抗菌剂和具有免疫调节活性的多效因子.除具有抗菌活性外,乳铁转运蛋白在骨生理方面的作用近来逐渐引起关注.研究表明乳铁转运蛋白能促进骨骼生长,在生理浓度下能有效刺激成骨细胞增殖和分化,抑制破骨细胞形成;在骨生长和代谢中起到一定的生理调节作用.乳铁转运蛋白可作为细胞因子之一用于治疗骨质疏松症,也可作为骨修复因子促进骨修复.该文就近年乳铁转运蛋白在骨生理方面的研究进展作一综述.     

囊性纤维化跨膜传导调节因子在人破骨细胞中表达及其对破骨细胞凋亡的影响

目的探讨囊性纤维化跨膜传导调节因子(Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator,CFTR)在破骨细胞中的表达及其对破骨细胞凋亡的影响。方法利用Real time PCR和Western Blot检测人破骨细胞中CFTR表达,运用基因工程手段构建含有GFP的CFTR超表达载体,应用流式技术分析CFTR超表达后对破骨细胞凋亡的影响。利用Real time PCR和Western Blot检测破骨细胞中Fas/FasL的表达。结果 Real time PCR和Western Blot结果显示,体外培养的人破骨细胞中有CFTR的表达。CFTR高表达后,破骨细胞的凋亡率明显升高,凋亡相关蛋白Fas/FasL表达也明显升高。结论 CFTR可通过促进Fas/FasL的高表达,进而促进破骨细胞凋亡。     

破骨细胞微管正端蛋白动态成像观察

目的 采用活细胞成像技术观察破骨细胞微管正端蛋白EB1在细胞内的分布及运动,初步研究微管在破骨细胞功能中的作用。方法 ①用脂质体转染方法（阳离子脂质体Lip2000）转染EB1-GFP基因至Raw264.7细胞系,G418筛选转染成功的Raw264.7细胞,荧光显微镜下观察后GFP蛋白免疫荧光染色确定稳定转染EB1-GFP的Raw264.7细胞系建立;②活细胞工作站下观察转染EB1-GFP的Raw264.7细胞中EB1蛋白的运动; ③用含100ng/mLRANKL和30ng/mL M-CSF的培养基分别诱导稳定转染EB1-GFP的Raw264.7细胞与正常Raw264.7细胞为破骨细胞,进行TRAP染色鉴定,比较两组细胞形态有无差别;④Raw264.7细胞系诱导出破骨细胞后,用细胞免疫荧光染色方法观察破骨细胞EB1蛋白的形态及分布;⑤活细胞工作站下观察稳转EB1-GFP的Raw264.7细胞诱导出的破骨细胞内EB1蛋白的运动状态。结果 ①脂质体转染方法建立了稳定转染EB1-GFP基因的Raw264.7细胞系;②观察到破骨前体细胞Raw264.7的微管正端蛋白（EB1）的运动轨迹;③转染EB1-GFP基因的Raw264.7细胞与正常Raw264.7细胞诱导的破骨细胞TRAP染色无明显差别;④活细胞工作站观察破骨细胞微管正端蛋白EB1的运动状态,结果表明破骨细胞微管活动性较破骨前体细胞Raw264.7活动性低。结论 ①EB1-GFP基因对破骨前体细胞系Raw264.7诱导破骨细胞无明显影响;②微管活动性降低可能与破骨细胞骨吸收活性相关。     

血小板衍生生长因子-BB抑制成骨细胞-破骨细胞共育体系中破骨细胞的作用机制

目的　探讨血PDGF BB在共育体系中抑制破骨细胞 (OC)功能的机制。方法　将PDGF BB施加于两种培养体系。测定培养上清一氧化氮 (NO)产物的浓度 ;检测诱导型和内皮型一氧化氮合酶表达情况 ;检测共育体系内外骨保护素 (OPG )表达与PDGF BB浓度的关系 ;观察共育体系培养上清对OC吸附骨质的影响。结果　在PDGF BB刺激下 ,NO含量升高至 (2 5 .2 6±3 .2 4) μg/L (P <0 .0 1) ;加入抑制剂后 ,NO含量为 (9.84± 1.5 1) μg/L ;PDGF BB促进成骨细胞(OB)对eNOS和iNOS的表达 ,抑制剂使二者表达减弱 ;共育体系中OPG表达增强 ,而PDGF BB不能直接促进OPG的表达。共育体系培养上清使OC从骨质上脱离。结论　PDGF BB促进OB产生NO产物 ,后者抑制OC功能。     

人骨髓长时间培养中破骨细胞的形成

在粒细胞／巨噬细胞集落刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）存在下，离体培养人骨髓单个核细胞３周，结果显示有大量具破骨细胞特性的多核细胞形成，细胞核３～２０余个不等，多数细胞显示抗酒石酸盐酸性磷酸酶强阳性反应，当与牙本质片共育３周，可在牙本质片上形成典型吸收陷窝，并可见具有破骨细胞形态样的细胞，提示此培养条件下有大量破骨细胞形成．     

钠依赖二羧酸转运蛋白在IgA肾病患者肾组织表达的研究

目的 研究人钠依赖二羧酸转运蛋白(human Na~+/dicarboxylate cotransporter,NaDC)在IgA肾病患者肾组织内表达的变化,探讨其在IgA肾病进展过程中的作用。方法 34例IgA肾病肾活检标本依据病理改变程度分为5级,同时对肾小管间质病变进行半定量分析。应用免疫组织化学技术观察肾组织内NaDC1和NaDC3的表达变化,并与临床指标进行相关分析。结果 随着IgA肾病病理改变程度的加重,肾小管间质病变亦加重。Ⅳ和Ⅴ级病变患者的24h尿蛋白定量、血肌酐和尿NAG酶均显著升高,尿渗透浓度显著下降(P<0.05)。NaDC1表达于近端肾小管上皮细胞的刷状缘上,与Ⅰ～Ⅲ级病例相比,Ⅳ和Ⅴ级病例中的NaDC1的表达减少,其中以Ⅴ级表达最少(P<0.05)。NaDC3表达于近端肾小管上皮细胞的基底侧膜上,与Ⅰ～Ⅱ级病例相比,Ⅱ～Ⅳ级病例中的NaDC3的表达增多,在Ⅴ级病例中,其表达显著减少(P<0.05)。肾小管NaDC1表达与尿NAG酶呈负相关(r=-0.627,P<0.05)。结论 钠依赖二羧酸转运蛋白的表达变化在IgA肾病进展过程中发挥重要的作用。     

钙离子信号在破骨细胞中作用的研究进展

骨基质形成和吸收是骨代谢中最重要的平衡过程,许多骨疾病都与这一平衡破坏有密切关系。破骨细胞的形成和功能异常导致骨基质吸收异常是一主要原因,许多研究关注影响破骨细胞形成的因素及相关调控机制。钙离子是生物体内重要的“第二信使”,几乎参与了所有生物体的细胞代谢过程,与细胞的分化、增殖、运动、凋亡等过程密切相关。核转录因子受体（Receptor activator of nuclearfactor-κB ligand,RANKL）是破骨细胞形成的必需因子,主要是通过诱导单核细胞产生持续性的钙振荡进而激活T细胞核因子1（Nuclear factor of activated T cells cl,NFATcl）的基因转录和蛋白表达增加,进而促使单核细胞融合成为破骨细胞。钙离子信号还影响着破骨细胞的运动、功能及凋亡等许多生命活动过程。力学刺激、ATP、整合素等都可通过诱发钙振荡来影响破骨细胞的形成与功能。目前研究尚未完全认识钙振荡所包含的信息和钙离子的来源途径,揭示破骨细胞与钙信号之间的关系可对我们治疗破骨细胞相关疾病提供参考。     

破骨细胞分化因子胞外区的克隆表达与纯化

目的　破骨细胞分化因子的克隆 ,重组蛋白的表达及纯化。方法　自 1g死胎肝组织中提取总RNA ,反转录cDNA后作为模板 ,设计上下游引物 ,多聚酶链反应 (PCR)扩增出目的片段。将PCR产物克隆至组氨酸标签的融合蛋白表达载体 pProEXTM HTc ,并送测序。在异丙基硫代 β D 半乳糖苷 (IPTG)诱导下 ,可以稳定表达出破骨细胞分化因子胞外区蛋白 ,用镍离子交换柱纯化该蛋白。结果　逆转录 多聚酶链反应 (RT PCR )扩增出特异的目的条带 ,75 0bp大小。测序结果完全正确。诱导后可以表达重组蛋白 ,相对分子质量为 3 2× 10 3 。结论　RT PCR可以简便的扩增目的基因。重组破骨细胞分化因子蛋白可以通过大肠杆菌原核表达载体诱导表达得到。     

遗传高钙尿结石大鼠肾小管上皮细胞基底膜钙转运蛋白的异常表达及意义

目的 观察肾小管上皮细胞基底膜钙转运蛋白细胞膜钙泵1b(PMCA1b)和钠钙交换体.(NCX1)在遗传性高钙尿结石(GHS)大鼠肾组织的表达及其在特发性高钙尿症(IH)发病中的作用.方法 雄性遗传高钙尿结石大鼠和正常野生型SD大鼠各6只,采用实时荧光定量PCR检测PMCA1b和NCX1 mRNA表达,westem blot方法 检测其蛋白表达.结果 GHS大鼠与正常对照(NC)组大鼠的NCX1在mRNA水平和蛋白水平比较差异均无统计学意义(P＞0.05);GHS大鼠与NC大鼠的PMCA1b在mRNA水平比较差异无统计学意义(P＞0.05),GHS大鼠的PMCA1b蛋白平均相对吸光度值(A)为(0.18±0.05),NC组为(0.43±0.07),差异有统计学意义(P＜0.01).结论 PMCA1b蛋白表达下降可能是特发性高钙尿症形成的发病机制之一.     

Na^＋-H^＋换泵1在胃癌组织中的表达及其临床意义

目的 探讨胃癌组织中Na^＋-H^＋交换泵1（NHE1）的表达水平及其与临床病理资料的关系.方法 分别应用RT-PCR和Western blot方法检测60例胃癌组织及其相匹配的癌旁胃黏膜组织中NHE1 mRNA及蛋白的表达情况,并进一步分析其表达与胃癌临床病理资料的关系.结果 本组60例患者胃癌组织中NHE1 mRNA及蛋白表达的相对表达量分别为0.786±0.291和1.442±0.175,高于癌旁组织的0.369±0.052和0.348±0.029,差异均有统计学意义（均P〈0.01）.胃癌组织中NHE1 mRNA表达和NHE1蛋白表达显著相关（r=0.264,P〈0.05）.NHE1 mRNA和蛋白表达与肿瘤浸润深度、淋巴结转移及TNM分期有关（均P〈0.05）,而与年龄、性别及分化程度无关（P〉0.05）.结论 胃癌组织中的NHE1 mRNA及蛋白的表达水平均显著升高,可能参与了胃癌的发生发展进程.     

福莫特罗和ICI118551对大鼠成熟破骨细胞骨吸收功能的影响

目的研究选择性β2肾上腺素能激动剂福莫特罗(Formoterol)和阻滞剂ICI118551对体外培养大鼠成熟破骨细胞(osteoclast,OC)功能的影响,探讨β2肾上腺素能受体信号对骨代谢的影响。方法取清洁级出生24h内的SD乳大鼠,长骨干骨髓腔内壁机械分离成熟OC后分别加入不同浓度(10-5mol/L～10-9mol/L)的Formoterol和ICI118551,以抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色观察破骨细胞形态,甲苯胺蓝染色计数骨片上的骨吸收陷窝数目,Image-ProPlus6.0图像软件分析骨片上骨吸收陷窝面积。结果破骨细胞与骨片共培养6天,不同浓度的Formoterol与对照组相比均可增加骨片上OC的骨吸收陷窝数目和面积;随着ICI118551浓度的提高骨片上骨吸收陷窝的数目和面积逐渐减少。结论β2肾上腺素能受体激动剂可促进体外培养OC的骨吸收功能,阻滞剂对OC的骨吸收功能有抑制作用,且呈剂量依赖性。     

醛固酮可通过钠氢交换子1诱导肾小球系膜细胞外基质增生

目的 探讨醛固酮能否在肾小球系膜细胞(GMC)激活钠氢交换子1(NHE1)，以及能否通过NHE1诱导GMC细胞外基质增生。 方法 体外培养大鼠GMC，并按如下分组:对照组(Con， 普通培养液)；醛固酮组(Aldo ，10-7 mol/L)；醛固酮+安体舒通组(Aldo+Spir 10-9 mol/L)；醛固酮+NHE1抑制剂DMA组(Aldo+DMA 25 μmol/L)。24 h后收集培养上清液和各组细胞，抽提总RNA。用酸负荷后钠依赖的pHi(细胞内pH值)的变化来检测NHE1活性，同时采用实时PCR以及流式细胞术检测NHE1基因和蛋白的表达。采用实时PCR和ELISA方法检测纤连蛋白(FN) 基因和蛋白的表达。 结果 与对照组比较，Aldo组肾小球系膜细胞NHE1的活性(△pHi/100S)显著增高[Con (4.48±0.25) %， Aldo (5.29±0.11) %， P < 0.05]。加入安体舒通和DMA后，上述NHE1活性均有所降低[Aldo+Spir (4.92±0.35)%，Aldo+DMA (4.07±0.23)%，与Aldo组比较，P < 0.05]。实时PCR结果显示Aldo组NHE1 mRNA水平有所增高， 是对照组的1.16倍(P < 0.05)， 而Aldo+Spir组NHE1 mRNA水平明显下降， 是Aldo组的81.9% (P < 0.05)。流式细胞术结果显示Aldo组NHE1蛋白水平显著增高，是对照组的2.9倍(P < 0.01)，而Aldo+Spir组NHE1蛋白水平明显下降，仅为Aldo组的52.3% (P < 0.05)， 安体舒通本身对NHE1的基因和蛋白表达没有显著影响。实时PCR结果显示Aldo组FN mRNA水平有所增高， 是对照组的1.03倍(P < 0.05)；Aldo+Spir组和Aldo+DMA组FN mRNA水平有所下降， 分别是Aldo组的91.21% (P < 0.01)和92.30% (P < 0.01)。ELISA结果显示培养上清液中分泌的FN (ng/ml) 也表现为相同的趋势[Con(17.84±3.77)，Aldo(51.66±1.40)，P < 0.01； Aldo+Spir(29.60±1.99)，Aldo+DMA(25.75±4.66)，与Aldo组比较，P < 0.01]。 结论 醛固酮能够刺激肾小球系膜细胞分泌细胞外基质成分FN，其作用可能是由于醛固酮激活系膜细胞NHE1活性、上调其基因和蛋白表达所致。     

氟对破骨细胞骨吸收陷窝的影响

目的 观察氟对大鼠破骨细胞(Osteoclast,OC)形成的骨吸收陷窝的影响。方法 通过机械分离新生大鼠乳鼠四肢长骨方法体外培养Oc,并于1 d后加入含不同浓度氟的培养基,观察氟对OC形成的骨吸收陷窝数量及面积的影响。结果 随染氟剂量的增加,骨吸收陷窝数及陷窝面积逐渐增加,各剂量组与对照组比差异均有显著性(P<0.05),其中尤以4.0mg/L染氟组最为明显(P<0.01)。结论 在一定的剂量范围内,随染氟剂量的增加,OC的骨吸收作用是增强的。     

Quantitative analyses of osteoclast changes in resorbing bone organ cultures

Summary The stimulation of bone resorption, assessed by the release of⁴⁵Ca from prelabeled bones, was associated with an increase in number of osteoclasts per bone section in parathyroid hormone (PTH)-treated bones, but not in lipopolysaccharide (LPS)-treated bones. By contrast the number of nuclei per osteoclast increased following LPS treatment, but was not affected by PTH. LPS-treated bones had more multinucleated cells, some having as many as 27 nuclei per osteoclast. More osteoclasts were adjacent to the bone collar in bones treated with LPS or PTH than in control bones. In LPS-treated bones this area also contained the largest osteoclasts, as determined by the greatest number of nuclei per osteoclast. The results suggest that LPS and PTH stimulate osteoclastic resorption by different mechanisms.     

Pichia stipitis木糖醇脱氢酶基因XYL2在酿酒酵母中的表达

通过PCR方法克隆得到树干毕赤氏酵母木糖醇脱氢酶(XDH)基因XYL2.将该基因连入酵母表达载体pYX212的强启动子磷酸丙糖异构酶(TPI)启动子下,得到融合表达载体pYX-XYL2.通过电转化方法将pYX-XYL2转入酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae W303-1A中,酶活测定表明在酿酒酵母中树干毕赤氏酵母木糖醇脱氢酶基因XYL2得到活性表达,酿酒酵母转化子粗酶液中木糖醇脱氢酶比活为每毫克蛋白0.6 U左右,约为供体菌的2.4倍.与基因供体菌不同,木糖醇脱氢酶基因在酿酒酵母中表达不需木糖诱导,为组成型表达.     

二氮嗪对长时程低温保存移植鼠心ATP酶的影响及意义

目的观察线粒体ATP敏感性钾离子通道开放剂二氮嗪(Diazoxide,DE)对移植鼠心心肌细胞膜Na+-K+-ATPase和肌浆网Ca2+-ATPase活性的影响,并探索DE处理后Celsior液对长时程低温保存鼠心的作用。方法SD雄性大鼠192只随机分为4组,即A组(单纯Celsior液保存5h)、B组(30μmol/L DE+Celsior液保存5h)、C组(30μmol/L DE+Celsior液保存8h)、D组(30μmol/L DE+Celsior液保存10h)。利用改良Heron法大鼠颈部异位心脏移植模型,供体鼠心按各组要求保存后移植于受体,观察移植心脏30s内复跳率、心率;检测心肌细胞膜Na+-K+-ATPase和肌浆网Ca2+-ATPase活性;观察心肌超微结构。结果(1)复跳率和心率:心脏移植术后30s复跳率各组均无显著性差异;B组、C组心率明显较A组、D组快,A组、D组心率差异无显著性意义。(2)两酶活性测定:B、C、D3组心肌细胞膜Na+-K+-ATPase活性随着保存时间的延长呈显著递减性降低,但仍高于A组,仅D组与A组差别无显著性意义;B组、C组肌浆网Ca2+-ATPase活性显著高于D组、A组,D组与A组差别无统计学意义。(3)心肌超微结构:各组心肌结构保护均较好,肌纤维排列整齐,肌节清,线粒体肿胀不明显;B、C、D3组线粒体嵴结构较为清楚。(4)D组和A组各指标差别均无显著性意义。结论移植鼠心在长时程冷缺血期间,DE对心肌组织ATP酶活性有较好的保护作用,此作用随着保存时间的延长而减弱。且DE处理后Celsior液冷保存鼠心10h仍与国际公认的Celsior液安全冷保存时间5h效果相当。     

The alteration of osteoclast morphology by diphosphonates in bone organ culture

Two diphosphonates alter the morphology of the osteoclast, as they inhibit the calcium⁴⁵ release from bones stimulated to resorb by lipopolysaccharide. Disodium dichloromethylene diphosphonate was more potent than disodium ethane-1-hydroxy-1,1-diphosphonate in both inhibiting⁴⁵calcium release and altering osteoclast morphology. Alteration in the morphology of osteoclasts is associated with little or no change in the morphology of the surrounding non-osteoclast cells. These results indicate a specific morphological effect of diphosphonates on osteoclasts.