单纯疱疹病毒胸苷激酶丙氧鸟苷自杀基因系统对宫颈癌Hela细胞系体外杀伤作用的研究

目的：观察单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)丙氧鸟苷(GCV)自杀基因系统对人宫颈癌Hela细胞系体外杀伤作用及其旁观效应。方法：采用脂质体转染法将GINaTK载体转入包装细胞PA317。取病毒上清液感染Hela细胞,得到带有HSV-TK基因的Hela／TK细胞,并将其用于体外实验。结果：载体HSV-TK导入了PA317细胞。体外实验结果显示,当Hela／TK细胞数占混合细胞10％时,低浓度(10mg／L)的GCV就可将50％左右的肿瘤细胞杀死。GCV作用后的实验组Hela／TK细胞基因组经琼脂糖凝胶电泳后可观察到典型的DNA梯状条带。结论：逆转录病毒可介导HSV-TK基因转入人宫颈癌Hela细胞并获稳定表达,HSV-TK／GCV自杀基因系统在体外对宫颈癌细胞有杀伤作用,且存在明显的旁观效应。     

单纯疱疹病毒TK基因介导GCV治疗人RB肿瘤的实验研究

为探讨ＨＳＶ－ＴＫ基因介导的ＧＣＶ系统对人视网膜母细胞瘤（ＲＢ）基因治疗的有效性,利用电穿孔技术把重组逆转录病毒载体ｐＬＸＳＮ－ＴＫ导入包装细胞ＰＡ３１７,筛选出逆转录病毒产生细胞ＰＡ３１７／ＴＫ,收获病毒。体外实验：用逆转录病毒感染ＲＢ细胞,筛选出含ＴＫ基因的ＲＢ细胞（ＲＢ／ＴＫ）,用ＧＣＶ分别处理ＲＢ,ＲＢ／ＴＫ及不同比例的混合细胞。体内实验：建立人ＲＢ裸鼠原位异种移植模型,瘤内注射病毒液后再     

HSV-tk/GCV系统对人宫颈癌细胞株ME180旁观者效应的研究

目的：研究以逆转录病毒载体介导的HSV－tk/GCV系统对宫颈癌ME180细胞株的旁观者效应。方法：应用脂质体及ploybrene转染技术，将重组逆转录病毒载体PLXSN－HSV－tk，导入PA317包装细胞，以其分泌的逆转录病毒感染宫颈癌ME180细胞（ME），建立ME／TK转化细胞株。观察GCV对ME、ME／TK细胞的存活率及旁观者效应。结果：从病毒滴度、电镜及PCR检查，证实tk基因随病毒的感染已成功地导入PA317及ME180细胞。ME／TK细胞对GCV的敏感性显著高于亲代ME细胞。ME／TK及ME＋ME／TK混合细胞还随GCV浓度的增加受到明显的抑制。ME＋ME／TK混合细胞的存活率，随ME／TK细胞比例的增加而降低，说明TK／GCV系统不但能杀伤tk^ 细胞，也能杀伤未导入tk的细胞，存在明显的旁观者效应。结论：HSV－tk/GCV系统对宫颈癌ME180细胞具有明显的杀伤及旁观者效应。     

逆转录病毒介导的HSV-TK基因对人骨肉瘤细胞的杀伤作用

目的 探讨骨肉瘤基因治疗的可行性。方法 采用逆转录病毒介导的HSV-TK基因转移和GCV治疗的方法进行研究。结果 成功构建含HyTK基因的重组逆转录病毒载体DORHyTK;采用DOTAP将其转入PA317细胞中进行包装,筛选,并进行病毒滴度测定。收获病毒上清体外感染骨肉瘤细胞株OS732和SAOS-2。分别用PCR和RNA斑点杂交的方法证明假病毒中不含有复制活性病毒,HSV-TK基因已整合到宿主细胞基因组中,并获得表达,MTT比色法测定结果显示GCV对OS732TK和SAOS-2TK细胞均有明显的杀伤作用。且前者强于后者,旁观者效应在高细胞密度接种条件下强于低细胞密度,在SAOS-2细胞中的作用强于OS732。结论 HSV-TK/GCV基因治疗系统可为骨肉瘤的治疗提供新途径。     

逆转录病毒介导的HSV-TK基因系统对人胃癌细胞的转染及杀伤作用逆转录病毒介导的HSV-TK基因系统对人胃癌细胞的转染及杀伤作用

目的：探讨逆转录病毒介导的单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSV-TK）基因系统对人胃癌细胞的转染及杀伤作用。方法 应用PA317细胞包装的逆转录病毒介导的HSV-TK基因系统,在体外以逆转录病毒上清感染法将TK基因导入MKN28人胃癌细胞,并初步观察更昔洛韦（GCV）对转染TK基因的MKN28胃癌细胞的杀伤作用。结果：TK基因可成功转导入MKN28细胞,且对细胞的生长状态无明显影响。但对GCV的敏感性却显增加;同时还观察到显的“旁观效应”。结论：逆转录病毒介导的HSV-TK系统对人胃癌细胞有较高的转染效率,GCV对转染阳性的胃癌细胞有显的杀伤作用。     

单纯疱疹病毒胸苷激酶基因对肺腺癌细胞杀伤作用探讨

目的：探讨单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-tk)基因转染联合抗病毒药物更昔洛韦（GCV）对人肺腺癌细胞系的杀伤作用。方法：应用基因工程技术构建了携带单纯疮疹病毒胸苷激酶（HSV-tk）基因的逆转录病毒重组体pLXSN-tk，通过脂质体法转染PA317细胞，G418筛选出产重组病毒颗粒的生产细胞PA317-tk细胞。采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测HSV-tk/GCV系统对人肺腺部细胞系GLC-82的生长抑制率。结果：重组逆转录病毒载体能有效地将HSV-tk基因导入GLC-82细胞系内并使其获得对GCV的敏感性。结论：肺腺癌细胞转染HSV-tk基因后，能有效地被GCV杀死。     

单纯疱疹胸苷激酶/更昔洛韦系统杀伤前列腺癌细胞的"旁观者效应"及其调控

目的评价单纯疱疹胸苷激酶/更昔洛韦（HSV-TK/GCV）系统杀伤前列腺癌细胞PC-3m的“旁观者效应”,探讨连接蛋白（Cx）介导的细胞间隙连接交流（GJIC）在该系统“旁观者效应”中的作用,观察apigenin对PC-3m细胞连接蛋白43（Cx43）表达及GJIC状况的调控。方法MTT法评价TK基因系统杀伤PC-3m细胞的“旁观者效应”,划痕标记染料示踪技术（SLDT）比较几种代表细胞系GJIC功能状况,检测HSV-TK/GCV对其“旁观者效应”。逆转录－聚合酶链式反应（RT-PCR）法和SLDT检测PC-3m细胞Cx43表达和GJIC状况,并观察apigenin对Cx43表达、GJIC状况及“旁观者效应”的调控作用。结果HSV-TK/GCV系统杀伤PC-3m细胞时“旁观者效应”程度较弱,TK基因阳性细胞比例约为10%的混合细胞经100 μmol/L GCV处理72 h后,仅23.5%±3.21%细胞被杀灭。该自杀基因系统对GJIC功能强大的NIH-3T3、 Cos-7和L-02细胞“旁观者效应”程度远较GJIC功能低下的ACHN和HeLa细胞者强（P<0.001）。PC-3m细胞Cx43 mRNA表达降低,GJIC功能低下,apigenin不仅可上调PC-3m细胞Cx43表达、促进GJIC功能,还可使其“旁观者效应”明显改观（P<0.001）。结论细胞内在的GJIC功能与HSV-TK/GCV对其“旁观者效应”程度有正向关系,PC-3m细胞Cx43 mRNA表达减弱及GJIC功能低下可能是导致HSV-TK/GCV系统杀伤该细胞时“旁观者效应”较弱的原因,某些化学物质如apigenin可通过上调PC-3m细胞Cx43表达并促进GJIC功能,增强“旁观者效应”程度及TK基因系统疗效。     

RV-HSV-TK/GCV自杀基因系统治疗宫颈癌的实验研究

目的探讨单纯疱疹病毒胸苷激酶/丙氧鸟苷(HSV-TK/GCV)自杀基因系统对人宫颈癌细胞系Hela体外及体内的杀伤作用及其产生的旁观者效应.方法采用脂质体转染法将GINaTK载体转入包装细胞PA317.取病毒上清液感染人宫颈癌细胞Hela,得到带有HSV-TK基因的Hela/TK细胞,并将其分别用于体外和体内实验.体外实验中,Hela/TK细胞对丙氧鸟苷(GCV)的敏感性和旁观者效应采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法测定.动物试验中分别在BALB/C小鼠的右腋窝皮下按不同比例注射Hela/TK细胞和Hela细胞,然后给予GCV治疗.逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测肿瘤组织中HSV-TK基因的表达情况.结果转染HSV-TK基因的Hela/TK细胞表现出比亲本Hela细胞更强的杀伤肿瘤效应.体外实验结果显示,当Hela/TK细胞数占混合细胞10%时,低浓度(10μg·ml-1)的GCV就可将50%左右的肿瘤细胞杀死.体内实验结果显示,GCV可明显抑制Hela/TK细胞在BALB/C小鼠体内的肿瘤形成.经GCV治疗后,Hela/TK组和混合细胞组肿瘤体积分别较对照组肿瘤体积缩小52.8%和69.4%(均P＜0.001).小鼠的平均生存期也显著延长(P＜0.001).结论逆转录病毒可介导HSV-TK基因转入人宫颈癌细胞Hela并获稳定表达,HSV-TK/GCV自杀基因系统在体内外对宫颈癌细胞均有杀伤作用,且存在明显的旁观者效应.     

含HSVtk基因重组逆转录病毒包装细胞PA317/TK的建立

目的 :研究肿瘤的自杀基因疗法 ,建立含单纯疱疹病毒胸苷激酶 (HSVtk)基因重组逆转录病毒包装细胞PA317/TK。　方法 :应用脂质体转移方法将逆转录病毒载体GINaTK导入PA317,经G4 18筛选阳性克隆细胞后分别用PCR和扫描电镜检测HSVtk基因整合和病毒颗粒分泌情况。　结果 :逆转录病毒载体GINaTK导入PA317,G4 18后筛选得到阳性克隆细胞 ,命名为PA317/TK。PCR检测PA317/TK细胞出现一特异性 4 0 4bp阳性条带 ,而PA317细胞没有扩增出相应条带。PA317/TK细胞经扫描电镜检测见其表面有颗粒状突起 ,其周围有许多呈团状的病毒颗粒。证实含HSVtk基因重组逆转录病毒存在于包装细胞中。　结论 :成功建立含HSVtk基因重组逆转录病毒包装细胞     

人CTLA4Ig和EGFP双基因共表达逆转录病毒载体构建及鉴定

目的 构建并鉴定人CTLA4Ig和增强型绿色荧光蛋白（EGFP）双基因共表达逆转录病毒载体。方法 利用基因重组技术将IRES序列与CTLA4Ig和EGFP基因构建到逆转录病毒载体中，脂质体法将重组质粒pCTLA4Ig-IRES2-EGFP转染PA317细胞，在G418选择压力下，通过流式细胞检测筛选得到高效共表达CTLA4Ig和EGFP并能产生高滴度重组逆转录病毒的PA317细胞克隆，MTT法测定CTLA4Ig生物学活性。结果 成功构建出含IRES序列的CTLA4Ig和EGFP双基因共表达逆转录病毒载体，生物学活性测定表明CTLA4Ig生物学活性没有受到影响。结论 IRES序列调控CTLA4Ig与EGFP双基因在细胞中同时独立表达。     

全反式维甲酸增强HSV-TK/GCV对BIU-87细胞旁观者效应的观察

目的体外观察全反式维甲酸(all-trans retinoic acid,ATRA)对BIU-87细胞缝隙连接细胞间通讯(gap junction intercellular communication,GJIC)及旁观者效应的影响.方法用染料划痕标记技术观察ATRA对BIU-87细胞GJIC功能的影响,MTT法观察ATRA处理后HSV-TK/GCV对BIU-87细胞旁观者效应的变化.结果ATRA显著改善BIU-87细胞GJIC功能,并提高HSV-TK/GCV的旁观者杀伤作用.结论ATRA可以改善BIU-87细胞间通讯功能,可能是ATRA增强HSV-TK/GCV旁观者效应的重要原因之一.     

HSV-TK/GCV系统对卵巢癌细胞OVCAR3杀伤作用的研究

目的评价HSV—TK／GCV系统对卵巢癌细胞OVCAR3的杀伤作用及旁观者效应。方法用含HSV—TK重组腺病毒载体转染人卵巢上皮性癌细胞OVCAR3,用四甲基偶氮唑蓝（MTT）法计算细胞存活率以评价杀伤作用;转染的OVCAR3细胞（TK^＋）与未转染的OVCAR3细胞（TK^-）以不同比例混合,再加入GCV,MTT法计算细胞存活率以评价旁观者效应。结果HSV—TK／GCV系统可明显杀伤OVCAR3细胞,在感染复数（MOI）为100时,平均细胞存活率为26％;HSV—TK／GCV系统对该细胞的杀伤作用有明显的“旁观者效应”,当TK^＋细胞占10％、20％、30％、40％、50％时,细胞平均存活率分别为82％、52％、41％、35％、32％。免疫细胞化学检测OVCAR3细胞的细胞膜上有Cx43的表达。结论HSV—TK／GCV系统对人卵巢上皮性癌细胞OVCAR3有明确的杀伤作用及旁观者效应。     

Relationship between the expression of connexin43 and bystander effect of suicide gene therapy in ovarian cancer

heHSV TKbystandereffecthasbeendefinedtodescribetheGCV mediateddeathofHSV TKex pressingcellsandadjacentHSV TKnegativecells .Thiseffectisconsideredaprerequisiteforthethera peuticefficacyofHSV TK /GCVtherapyowingtothecurrentlowefficiencyofdeliveryvectorstota…     

腺病毒介导的HSV-TK/GCV系统对PVNS滑膜细胞的杀伤作用

目的〓〖HTK〗探讨腺病毒介导HSV-TK/GCV系统对色素沉着绒毛结节滑膜炎(PVNS)滑膜细胞的体外杀伤作用。〖HTW〗方法〓〖HTK〗将含LacZ基因的重组腺病毒载体Ad-LacZ转染PVNS滑膜细胞, X-gal染色法确定腺病毒对该细胞的转染效率，PCR检测转染细胞中HSV-TK基因的表达，MTT法检测TK阳性细胞对GCV的体外敏感性及旁观者效应，流式细胞仪检测HSV-TK/GCV系统作用后细胞的凋亡及坏死。〖HTW〗结果〓〖HTK〗感染复数为120时，近100％的细胞可被转染。HSV-TK/GCV系统对PVNS滑膜细胞的杀伤作用十分明显，且存在明显的旁观者效应。HSV-TK/GCV系统作用后细胞出现明显的凋亡及坏死。〖HTW〗结论〓〖HTK〗HSV-TK/GCV系统可明显杀伤PVNS中过度增殖滑膜细胞，可望用于PVNS的治疗。     

HyTK基因转导联合丙氧鸟苷对鼠膀胱癌细胞的体外杀伤作用

目的　探索HyTK基因转导丙氧鸟苷 (ganciclovir,GCV)对鼠膀胱癌细胞的影响。方法　脂质体介导法将PL(HyTK)SN质粒转染PA3 17细胞 ,潮霉素B筛选 ,直到出现抗性克隆 ,扩增培养 ,NIH3T3细胞测定病毒滴度 ,用逆转录病毒上清液感染T73 9细胞 ,潮霉素B筛选 ,直到出现抗性克隆 ,扩增培养 ,命名为T73 9 TK。RT PCR对T73 9 TK细胞进行鉴定。然后观察其在体外膀胱癌细胞的杀伤作用。结果　RT PCR证实HyTK基因已插入T73 9细胞并有其mRNA的表达 ,经不同浓度GCV处理后的T73 9 TK细胞均表现出有杀伤作用 ,而T73 9细胞在各个剂量的GCV作用下生长均良好。结论　GCV对转导了HyTK基因的T73 9细胞有显著杀伤作用     

含大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶基因的假型逆转录病毒的构建及包装

研究将大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶（CD）基因应用于基因治疗。构建、包装含CD基因的假型逆转录病毒。构建含CD基因的逆转录病毒重组表达载体pLCDSN基础上，以重组表达载体pLCDSN转染包装细胞PA317，pLCDSN整合入PA317染色体中。结果：CD基因获得表达且包装出具有感染能力的假型逆转录病毒。以该假型逆转录病毒感染NIH／3T3细胞，逆转录病毒重组表达载体pLCDSN整合入NIH／3T3细胞染色体中，CD基因获得表达。5－FC对有CD基因表达的包装细胞PA317（pLCDSN）和NIH／3T3（pLCDSN）产生杀伤毒性。结论：我们已成功地构建、包装了含重组逆转录病毒载体pLCDSN且具有感染能力的假型逆转录病毒。该工作为以逆转录病毒介导的CD基因应用于肿瘤基因治疗奠定了基础。     

反义基因转移表达及抗乙型肝炎病毒的作用

目的观察重组逆转录病毒载体－包装细胞系统介导反义基因转移表达和抗乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）的作用。方法将ＨＢＶａｙｗ１４０２－２９０６片段和２８３９－１９８６片段反向插入重组逆转录病毒载体质粒，分别转染ＰＡ３１７包装细胞，分别感染ＮＩＨ３Ｔ３细胞和２．２．１５细胞。结果转导的ＮＩＨ３Ｔ３细胞内有ＨＢＶ反义ＲＮＡ转录表达。ＨＢＶ反义基因重组逆转录病毒感染２．２．１５细胞后第３天，表面抗原（ＨＢｓＡｇ）和ｅ抗原（ＨＢｅＡｇ）表达量减少，感染后第５天，ＨＢＶ抗原表达抑制率达高峰。ｐｒｅＳ／Ｓ片段反义基因转移后，ＨＢｓＡｇ表达抑制率为７１％，ＨＢｅＡｇ抑制率为２３％；ｐｒｅＣ／Ｃ片段反义基因转移后，ＨＢ－ｓＡｇ表达抑制率为２３％，ＨＢｅＡｇ抑制率为５９％。结论逆转录病毒载体－包装细胞系统能够介导ＨＢＶ反义基因在真核细胞内转移和表达，并对ＨＢＶ复制和表达均有抑制作用。     

携带EGFP与rtTA双基因的逆转录病毒载体的构建及其在PA317细胞中的表达

目的 构建表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)、rtTA双基因的重组逆转录病毒载体pLXSN-EGFP-rtTA,并在PA317细胞中表达.方法 以质粒pEGFP-C1为模板进行PCR反应获得EGFP基因片段,定向插入逆转录病毒载体pLXSN,筛选出正确的重组逆转录病毒载体pLXSN-EGFP.PCR方法从pTet-on质粒中扩增出rtTA基因,酶切纯化后克隆于逆转 录病毒载体pLXSN-EGFP中,限制性内切酶酶切分析及PCR鉴定筛选出正确的重组载体pLXSN-EGFP-rtTA,脂质体介导转染PA317细胞,PCR方法检测PA317细胞内EGFP、rtTA基因,RT-PCR方法检测PA317细胞内rtTA基因的mRNA表达,荧光显微镜观察EGFP基因的表达情况.以NIH3T3细胞为靶细胞测定重组逆转录病毒滴度.结果 成功构建了表达EGFP、rtTA双基因的重组逆转录病毒载体,转染PA317细胞后,RT-PCR方法可检测到rtTA基因的mRNA表达,荧光显微镜下可观察到EGFP基因表达所产生的绿色荧光,说明连接有EGFP和rtTA双基因的逆转录病毒载体在PA317细胞中可正常表达,转染pLXSN-EGFP-rtTA载体的PA317细胞可产生4.8x 104 CFU/ml病毒滴度的重组病毒.结论 成功构建表达EGFP、rtTA双基因的重组逆转录病毒载体,该载体可在PA317细胞内正常表达,获得较高滴度的病毒上清.     

胞嘧啶脱氨基酶/5-氟胞嘧啶系统对人胰腺癌细胞恶性增殖的抑制作用

目的　探讨大肠杆菌胞嘧啶脱氨基酶 (CD) / 5 -氟胞嘧啶 (5 - FC)系统对人胰腺癌细胞的体内外生长抑制作用。方法　将含 CD基因的重组逆转录病毒载体导入人胰腺癌细胞形成转化细胞系 ,对转化细胞进行体内外药物敏感实验 ,包括 :(1)计算转化细胞在前体药物 5 - FC作用下的细胞生长抑制率和克隆形成抑制率 ;(2 )MTT法检测旁观者效应 ;(3)观察 5 - FC对转化细胞裸鼠移植瘤的抑制作用。结果　转化细胞在 5 - FC作用下其生长抑制率为 80 .0 % ,克隆形成抑制率为 79.0 % ,均明显高于未转化细胞生长抑制率 4.8%和克隆形成抑制率5 .0 % (P<0 .0 1) ;混合细胞中含 10 %的转化细胞时 ,生长抑制率已达 5 0 .7% ;转化细胞的裸鼠移植瘤在 5 - FC作用下体积缩小。结论　 CD/ 5 - FC系统对人胰腺癌细胞系细胞具有实验性基因治疗作用     

胞嘧啶脱氨基酶／5—氟胞嘧啶系统对人胰腺癌细胞恶性增？…

目的 探讨大肠杆菌胞嘧啶脱氨基酶（ＣＤ）／５－氟胞嘧啶（５－ＦＣ）系统对人胰腺癌细胞的体内外生长抑制作用。方法 将含ＣＤ基因的重组逆转录病毒载体导入人胰腺癌细胞形成转化细胞系、对转化细胞进行体内外药物敏感实验,包括：（１）计算转化细胞在前体药物５－ＦＣ作用下的细胞生长抑制率和克隆形成抑制率;（２）ＭＴＴ法检测旁观者效应;（３）观察５－ＦＣ对转化细胞裸鼠移植瘤的抑制作用。结果 转化细胞在５－ＦＣ作用