人CTLA-4Ig融合基因减毒鼠伤寒沙门菌真核表达载体的构建及表达

目的构建能稳定表达人CTLA4 Ig融合基因的减毒鼠伤寒沙门菌真核表达载体,探讨其在哺乳动物细胞中的表达并对表达产物进行鉴定。方法用touchdown PCR法扩增CTLA-4 Ig融合基因,将PCR产物连接真核表达载体pcDNA3.1( ),构建pcDNA3.1( )-CTLA-4 Ig,用电穿孔仪转入减毒鼠伤寒沙门菌SL7207。将表达质粒转染COS-7细胞,SDS-PAGE、W estern b lot检测转染细胞裂解上清中目的蛋白的表达。结果酶切鉴定和基因序列测定显示重组质粒构建成功。在pcDNA3.1( )-CTLA-4 Ig质粒转染后48 h细胞裂解上清中,检测到CTLA-4 Ig融合蛋白的表达,该蛋白能与抗人CTLA-4单抗特异结合。结论成功构建了能稳定表达人CTLA4 Ig融合基因的减毒鼠伤寒沙门菌真核表达载体,并在哺乳动物细胞中成功表达有生物学活性的重组人CTLA-4 Ig蛋白。     

TNFR1BP/IgGFc融合蛋白载体的构建、表达及其生物学活性研究

目的 构建肿瘤坏死因子受体1(TNFR1)封闭肽与IgGFc融合蛋白的真核表达载体,检测其表达和生物学活性.方法 将合成的TNFR1封闭肽(TNFR1BP)基因片段插入质粒pIG/3C,构建真核表达载体pIG/3C-TNFR1BP;脂质体法将重组载体转染COS-7细胞;ELISA和Western blot法检测转染细胞的培养上清中TNFR1BP/IgGFc融合蛋白的表达;间接免疫荧光抑制实验、细胞毒抑制实验检测融合蛋白对TNFR1的封闭作用.结果 经PCR和核苷酸序列测定证实TNFR1BP基因正确插入质粒pIG/3C.ELISA检测证实,在转染细胞培养上清中有融合蛋白的表达;间接免疫荧光抑制实验和细胞毒抑制实验证实融合蛋白能结合L929细胞表面的TNFR1,并能抑制分泌型肿瘤坏死因子α(sTNF-α)介导的细胞毒作用.结论 成功构建并实现TNFR1BP/IgGFc融合蛋白真核表达;体外实验证实此融合蛋白可通过与细胞表面TNFR1结合,从而拮抗sTNF-α介导的生物学效应.     

CTLA-4/Ig在CHO/DG44细胞中的高效表达

目的 研究CTLA-4/Ig融合蛋白在CHO真核表达系统中的表达,并纯化所表达的CTLA-4/Ig融合蛋白,为其功能研究和临床应用奠定基础.方法 将线性化的pMM-CTLA-4-IgG4/WG和pMMGR转染CHO/DG44细胞,对阳性克隆进行无血清悬浮培养,Western blot检测细胞培养液中CTLA-4/Ig融合蛋白的表达,筛选出高效稳定表达CTLA-4/Ig融合蛋白的CHO细胞;Protein A亲和层析纯化所表达的CTLA-4/Ig融合蛋白;SDS-PAGE电泳、Western印迹等对纯化的CTLA-4/Ig融合蛋白的相对分子质量、纯度、抗原特异性进行生物学鉴定.结果 筛选出了能高效稳定表达CTLA-4/Ig融合蛋白的CHO细胞;纯化后的CTLA-4/Ig融合蛋白在SDS-PAGE电泳后出现一条与预期相对分子质量大小相符的蛋白条带;该蛋白能与羊抗人IgG-HRP抗体特异结合.结论 获得了能够高效稳定表达具有生物学活性的CTLA-4/Ig融合蛋白的CHO细胞.     

新型重组免疫抑制蛋白B7-2-L-PE40KDEL的分子构建与生物活性及结构特性

目的：构建重组B7－2－L－PE40KDEL融合蛋白,特异性杀伤CD28高表达的T细胞,选择性阻断T淋巴细胞活化过程中的B7：CD28／CTLA－4共刺激信号系统,由此诱导免疫耐受,特异性防治移植物抗宿主疾病（GVHD）和宿主抗移植物疾病（HCGD）。方法：采用基因融合序列重叠延伸（SOE）策略,构建新型重组pRSETA-B7-2-L-PE40KDEL外毒素融合蛋白的原核表达载体,实现融合蛋白在大肠杆菌中的高效表达,利用亲和层析等方法进行蛋白质纯化。对该融合蛋白的结构特征诸如等电点、柔性等进行模拟分析。采用MTT法对其特异性杀伤高表达CD28受体的T细胞的活性进行测定。结果：构建并高效表达了B7－2－L－PE40KDEL融合蛋白,所获融合蛋白的纯度大于95％。该融合蛋白的结构特征模拟分析的结果显示,其柔性及抗原性、亲水性表位均未显著改变。活性测定显示,该重组融合蛋白能有效特异性地杀伤高表达CD28的人T淋巴瘤细胞系,而对未来表达CD28的人白血病细胞系则无任何杀伤。结论：具有靶向性免疫抑制活性的新型重组B7－2－L-PE40KDEL毒素融合蛋白的构建、表达对特异性防治GVHD和HVGD可能产生积极的影响。     

小鼠可溶性CD83-Ig对树突状细胞产生IL-12的影响

目的:探讨小鼠可溶性CD83-Ig对树突状细胞(DC)产生白细胞介素-12(IL-12)的影响。方法:将表达小鼠CD83胞外功能区与人IgG1αFc融合蛋白(CD83-Ig)的真核表达载体pmCD83-Ig转染COS-7细胞,表达可溶性CD83-Ig融合蛋白,并将该载体转染DC细胞系(DC2.4),筛选稳定表达CD83-Ig的细胞系。采用LPS刺激DC2.4,借助RT-PCR和ELISA法分别检测DC2.4IL-12mRNA的表达和细胞培养上清中IL-12的水平,观察CD83-Ig对DC2.4表达IL-12的影响。结果:可溶性CD83-Ig处理DC细胞组和CD83-Ig基因转染DC细胞组IL-12mRNA的表达和上清液中IL-12水平显著低于对照组,差异有统计学意义(P<0.01)。结论:CD83-Ig可抑制LPS刺激DC产生IL-12,可能是CD83-Ig负调节DC活性的重要机制。     

CCL21-CD40L融合蛋白的肿瘤免疫实验研究

目的：探讨CCL21-exCD40L融合基因的抗肿瘤作用。 方法：构建CCL21-exCD40L真核表达载体,Western blot法检测CCL21-exCD40L融合蛋白的表达,Transwell法检测CCL21-exCD40L融合基因趋化活性,体外转染CCL21-exCD40L融合基因,观察其在小鼠结肠癌肿瘤模型中的抗肿瘤作用。 结果：成功构建真核表达载体pcDNA3.1⁺/CCL21-exCD40L,Transwell法验证融合蛋白对树突细胞具有较强趋化功能,其每高倍镜视野穿膜细胞数是空载体对照组的14.95倍。将融合基因原位转染肿瘤局部,荷瘤小鼠全部存活,肿瘤体积缩小。 结论：CCL21-exCD40L融合基因能通过真核细胞正常表达,CCL21-exCD40L融合蛋白能够趋化树突细胞,在体内发挥抗肿瘤作用。     

H-2半相合小鼠CD34+细胞和TK+T细胞移植建立急性GVHD模型

目的建立H-2半相合小鼠CD34 细胞和TK T细胞混合移植急性GVHD模型.方法自亲代雄性代鼠骨髓分离CD34 细胞,同时取脾脏T细胞转染tk基因,两者移植雌性F1受鼠,每只输入CD34 细胞和TK T细胞分别为1.0×105和1.0×107.单纯照射组和CD34 细胞组作对照.结果CD34 TK T细胞组均发生急性GVHD,生存时间13.3±1.2天,受鼠死亡前外周血白细胞1.76±0.25×109/L,病理表现与单纯照射组明显不同.单纯照射组小鼠生存时间6.5±0.8天,与CD34 TK T细胞组比较,P＜0.05.CD34 细胞组和CD34 TK T细胞组小鼠外周血检查可见Y染色体.结论H-2半相合CD34 细胞和TK T细胞混合移植能建立急性GVHD模型.     

鼠bcl-XL基因在CHO细胞中的表达

目的：构建携带鼠bcl-XL基因的真核表达载体，并将其在CHO细胞中表达。方法：用反转录PCR获取鼠bcl-XL全长cDNA序列，将其克隆进pEGFP重组融合表达质粒，脂质体法转染CHO细胞，荧光检测目的蛋白表达。结果：成功获得了鼠bcl-XL cDNA，构建了编码鼠bcl-XL的真核融合表达载体pEGFP-bcl-XL，转染CHO细胞后观察到融合蛋白表达。结论：鼠bcl-XL基因的克隆及融合表达，为进一步在高密度、大规模细胞培养中利用bcl-XL具有重要意义。     

鼠CD40配体cDNA真核表达载体的构建

目的:构建鼠CD40配体(Mcd40)cDNA真核表达载体，为进一步研究打下基础。方法:从鼠脾细胞中提取总RNA作为模板，用特异的引物和RT—PCIL法扩增mCD40L cDNA。PCIL产物T—A克隆了T载体构建中间重组体，NheI和EcoRI双酶切后，将Mcd40L cDNA定向插入真核表达载体pcDNA3．1多克隆位点中，构建成重组表达质粒，并用酶切分析、PCIL扩增和序列测定进行了鉴定。结果:mCD40L cDNA被正确地克隆到真核表达载体pcDNA3．1^ 中，测序结果同文献报道的序列一致。结论真核表达载体pcDNA3．1^ -mCD40L的成功构建，为开展利用mCD40L基因治疗肿瘤的研究奠定了基础。     

DDR2/Fc融合基因真核表达载体的构建及表达

目的:构建DDR2/Fc真核表达载体,使其在HEK293细胞中进行表达. 方法:采用PCR技术,分别从大鼠脑组织、含人IgG1 Fc全长互补DNA(cDNA)的质粒中扩增出盘状结构域受体2(DDR2)的DS区域、Fc段,以定向克隆的方法将其串联至真核表达载体pcDNA3.1(-)中,获得重组表达载体DDR2/Fc-pcDNA3.1(-);采用脂质体转染技术转染HEK293细胞; RT-PCR、免疫印迹检测融和蛋白的表达. 结果:DNA测序和限制型酶切鉴定证明两段基因正确克隆至pcDNA3.1(-)的多克隆位点,细胞裂解物中检测到融合蛋白的表达,其分子质量与预期大小一致,该融合蛋白能正确表达于HEK293细胞中. 结论:成功构建了DDR2/Fc融和表达载体,表达了融合蛋白.     

小鼠CTLA4-Fc融合基因真核表达载体的构建及表达

目的 构建小鼠细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4Fc融合基因（CTLA4-Fc）的真核表达质粒,并检测其在293T细胞中的表达,为后续在小鼠体内研究CTLA4-Fc抗肿瘤作用机制奠定基础。方法 Gene Runner 软件设计并合成互为搭桥、互为模板的CTLA4融合基因引物,利用重叠PCR方法扩增获得CTLA4基因片段,与pcDNA3.1(+)/Fc (Mouse IgG2a)质粒同时进行双酶切,连接合成CTLA4-Fc融合基因表达质粒;菌落PCR扩增、双酶切以及测序鉴定后,在293T细胞中瞬时转染表达融合基因的质粒,ELISA法检测其在293T细胞内的蛋白表达含量。结果 成功构建CTLA4-Fc融合基因。经菌落PCR和双酶切,琼脂糖电泳检测到CTLA4-Fc片段长度为1 200 bp,CTLA4片段长度为568 bp DNA。将阳性重组克隆菌落挑于液体LB培养基中扩大培养并将菌液送公司测序,测序结果证实DNA序列与GenBank同源性为100%。通过ELISA方法能够检测到CTLA4-Fc质粒在293T细胞中的表达。结论 CTLA4-Fc融合基因正确克隆入pcDNA3.1(+)/Fc (Mouse IgG2a)质粒中,该质粒能够在293T细胞中表达。本研究利用重叠PCR技术扩增获得CTLA4基因序列,能够快速获得目的 基因扩增产物,提高了实验的成功率。     

CD40-IgG1Fc融合蛋白真核表达载体的构建及表达

目的 构建人CD40-IgG1Fc融合蛋白的真核表达载体CD40-IgG1Fc/pcDNA3.1( ),并在中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)表达.方法 应用T-A克隆技术和亚克隆技术,构建人CD40膜外段和IgG1Fc段融合蛋白的真核表达载体CD40-IgG1Fc/pcDNA3.1( ),将其转染入CHO细胞株并筛选,进行稳定表达.通过RT-PCR、Western blot法及ELISA法证实融合基因的表达.结果 成功构建真核表达载体CD40-IgG1Fc/pcDNA3.1( ),并建立CHO细胞稳定表达株.Western blot及ELISA法检测到细胞培养上清中有融合蛋白的表达.结论 通过基因工程生产的人CD40-IgG1Fc融合蛋白,能够特异性阻断CD40-CD40L的相互作用.     

CD40L融合改造后的人乳头瘤病毒16型E7基因DNA疫苗的构建及其免疫原性测定

目的研究针对人乳头瘤病毒(HPV)16型的DNA疫苗,测定其免疫原性,用于治疗HPV16感染及感染相关恶性肿瘤。方法联合采用基因切割重排、定点突变及密码子优化等策略改造HPV16的转化基因E7,基因合成法获得改造后的E7基因(mE7);PCR法将mE7基因与CD40L胞外区编码序列融合,然后以pVR1012为载体构建pVR1012-mE7(mE7)及pVR1012-mE7/CD40L(mE7/CD40L)表达质粒;经肌肉免疫C57BL/6小鼠;ELISA法检测E7特异性血清抗体水平,ELISPOT法分析E749-57(H-2b)特异性分泌IFN-γ的CD8 T细胞活化水平,胞内染色-流式细胞检测分析E7特异性CD4 Th细胞活化水平;并在C57BL/6小鼠体内进行疫苗抗瘤活性检测。结果与野生型E7基因(wE7)相比,mE7基因诱发产生的E7特异抗体水平(P<0.01)、分泌IFN-γ的CD8 T细胞数目(P<0.01)及CD4 Th细胞活化水平(P<0.05)均显著提高;与mE7基因相比,mE7/CD40L融合基因可进一步显著提高E7特异性分泌IFN-γ的CD8 T细胞数目(P<0.01),但对E7特异性抗体产生及CD4 Th细胞活化水平没有明显影响。疫苗小鼠体内预防性免疫实验中,经wE7免疫的小鼠接种瘤细胞后2周内全部形成移植瘤,而所有经mE7及mE7/CD40L免疫的小鼠在瘤细胞攻击后第7周仍未见移植瘤形成;疫苗体内治疗性免疫实验中,小鼠在接种wE7后第8天左右全部形成移植瘤,并呈渐进性生长,而接种mE7的小鼠移植瘤清除率为30%,接种mE7/CD40L的小鼠移植瘤清除率增高至45%。对移植瘤的组织学检查结果显示,mE7/CD40L及mE7免疫组小鼠瘤细胞间及瘤组织周围可见大量淋巴细胞浸润,而wE7组小鼠的瘤细胞呈编织状紧密排列,未见有淋巴细胞浸润。结论HPV16型mE7/CD40L融合基因疫苗免疫小鼠后可诱发较强的E7特异性细胞免疫及体内抗瘤活性,具有较强的免疫原性。     

小鼠CD40Ig基因真核表达质粒的构建及鉴定

目的：构建含小鼠CD40Ig基因的真核表达载体，为诱导供体特异性移植物的免疫耐受的基因治疗作准备。方法：以小鼠脾脏总RNA为模板，以RT-PCR法克隆小鼠CD40胞外段cDNA及IgG2a Fc段cDNA；另以pEGFP-N1质粒为模板获得绿色荧光蛋白（GFP）基因。将所得基因片段插入真核表达载体pDC516中得到重组质粒pDC516-CD40-IgG-GFP，测序鉴定正确后，用脂质体2000将其转染人胚肾上皮细胞（HEK293细胞），荧光显微镜下观察融合蛋白的表达。结果：成功构建了小鼠CD40Ig基因真核表达质粒pDC516-CD40-IgG-GFP，并在HEK293细胞中实现表达。结论：小鼠CD40Ig基因真核表达质粒pDC516-CD40-IgG-GFP构建成功，为诱导供体特异性移植物免疫耐受的研究奠定了基础。     

HBV S-ecdCD40L融合基因修饰对树突状细胞功能的影响

目的探讨HBVS—ecdCD40L融合基因修饰对树突状细胞（DC）功能的影响。方法分离健康成人外周血单个核细胞,GM—CSF、IL-4诱导培养树突状细胞,培养第5天,以脂质体介导转染,分为pcDNA3．1-S—ecdCD40L转染组、pcD—NA3．1-S转染组、pcDNA3．1转染组及PBS对照组。转染48h收集DC及上清,流式细胞仪检测DC表面CD80、CD86、HLA—DR表达水平;CCK-8法检测混合淋巴细胞反应（MLR）中DC刺激同种异体淋巴细胞增殖的能力;酶联免疫吸附试验（ELISA）检测IL-12的分泌水平。结果与对照组比较,pcDNA3．1-S—ecdCD40L转染组DC表达CD80、CD86、HLA—DR水平增加,刺激同种异体淋巴细胞增殖的能力增强,分泌IL-12水平增高。结论HBVS—ecdCD40L融合基因修饰能促进DC活化。增强DC功能,将CD40L胞外段基因与HBV抗原基因融合可能是增强乙肝疫苗免疫效果的有效方法。     

重组人sCD40L功能性片段在大肠杆菌中的表达

目的 克隆sCD40L功能性片段(E107-L261)基因并在大肠杆菌体系进行表达。方法 从CD40L胞外段全长基因通过PCR方法扩增出sCD40L功能性片段(E107-L261)的基因，并在其N端融合6个组氨酸(His)；经PCR、酶以及DNA测序证实；将融合得到的sCD401L基因插入pET30a表达载体，转化大肠杆菌BL21(DE3)表达体系进行诱导表达。结果 构建了pET30a-sCl340L原核表达载体；将转化菌BL21(DE3)诱导表达后经SDS-PAGE电泳以及Western Blotting鉴定显示在18kd处有sCD40L功能性片段(E107-L261)的高效表达。结论 sC1340L功能性片段基因的克隆及其表达为进一步研制其同源三聚体形式的功能性重组蛋白奠定了基础。     

人Fn14基因真核重组质粒的构建及其表达

目的构建人成纤维细胞生长因子诱导早期反应蛋白14（fibroblast growth factor—inducible 14，Fn14）基因真核重组质粒及其表达。方法从人肝细胞癌组织抽取总RNA，RT—PCR扩增出Fn14基因全长cDNA，经测序正确后，核酸内切酶EcoR I、Xba I酶切PCR产物，亚克隆人pcDNA3．1-Myc载体，重组质粒pcDNA3．1-Myc—Fn14经酶切及测序鉴定正确后转染COS-7细胞，通过免疫组织化学DAB法检测Myc—Fn14融合蛋白的表达。结果重组质粒pcDNA3．1-Myc—Fn14经EcoR I、Xba I酶切及测序鉴定正确，重组质粒包含人Fn14基因完整编码区。免疫组织化学检测结果显示，重组质粒转染COS-7细胞后成功表达Myc—Fn14融合蛋白，转染空载体pcD—NA3．1-Myc的COS-7细胞未见Myc—Fn14融合蛋白表达。结论构建了人Fn14基因真核表达载体，该重组质粒可表达含Myc-Fn14的融合蛋白，为研究Fn14功能奠定了基础。     

溃疡性结肠炎大鼠iNOS真核表达载体的构建及其在COS-7细胞中的表达

目的:构建溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)大鼠结肠组织中i NOS基因的真核表达载体,并表达于COS-7细胞,以便进一步研究i NOS在UC发病机制中的作用。方法:从溃疡性结肠炎大鼠结肠组织提取总RNA,经逆转录获得cDNA,以PCR方法克隆i NOS的基因片段,并对其序列进行测定。将测序正确的i NOS编码序列插入pcDNA3.1/CT-GFP-TOPO中,构建真核表达载体;采用脂质体法转染COS-7细胞,用倒置荧光显微镜和Western blot的方法观察绿色荧光蛋白(Greenfluorescence protein,GFP)的表达。结果:PCR方法扩增出3598bp的基因片段,插入pcDNA3.1/CT-GFP-TOPO构建真核表达载体后,经以质粒为模板的PCR扩增和测序鉴定表明,克隆出UC大鼠结肠组织i NOS的编码序列同GeneBank收录的序列一致。将重组体转染COS-7细胞后,倒置荧光显微镜观察到绿色荧光,Western blot检测表明细胞中可表达融合蛋白。结论:本研究成功构建了pcD-NA3.1/CT-GFP-TOPO-i NOS重组质粒,并能高效转染COS-7细胞,为下一步i NOS基因功能研究及其在UC发病机制中的研究奠定了基础。     

Effect of NK cells on GVHD in H-2 haploidentical bone marrow transplantation in mice

Objective To study the effect of natural killer (NK) cells on graft-versus-host disease (GVHD) after H-2 haploidentical bone marrow transplantation (BMT) in mice. Methods Murine model of H-2 haploidentical BMT was established by using Balb/c (H-2d) mouse as recipient, and Balb/c(H-2d)×C57BL/6 (H-2b) (H-2d/b) mouse as donor. Lethally irradiated Balb/c (H-2d) mice were transplanted with the bone marrow cells from Balb/c(H-2d)×C57BL/6(H-2b) (H-2d/b) mice containing donor spleen cells and/or NK cells. GVHD and survival rates were studied by observation of clinical manifestations and pathological changes. ResultsIn the group of bone marrow spleen cells, GVHD was induced in 90% mice; but in the group plus with low amount of NK cells,GVHD was induced in 20% mice; and in the group transplanted with high amount of NK cells, GVHD was induced only in 10% mice. Compared to the group transplanted only with BM plus spleen cells, the incidences of GVHD in the latter two groups decreased significantly (P＜0.01) and the survival rates at different periods of 15, 30, 45 and 60 days increased obviously (P＜0.01 ). Conclusion In mouse H-2 haploidentical BMT, alloreactive NK cells can reduce the incidence of GVHD and increase the survival rate.     

重组可溶性人CD137在CHO细胞中的表达

目的：获得表达人可溶性CDl37抗原的dhfr-CHO细胞抹。方法：将CDl37-hIgGlFc-pCD-NA3重组质粒及pSV2-dhfr质粒，运用脂质体介导法共转染CHO细胞。用G418筛选出阳性克隆，MTX递增浓度诱导人可溶性CDl37在dhfr-CHO细胞的表达。运用RT-PCR检测CDl37 mRNA转录水平，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测人CDl37可溶性蛋白在CHO细胞中的表达。结果：重组质粒转化细胞进行RT-PCR后，得到一大小为558bp的特异性条带，与人CDl37胞膜外区一致；重组质粒转化细胞进行SDS-PAGE得到一大小约为37KDa的奈带，与人CDl37-hIgGlFc融合蛋白大小基本一致。结论：获得了表达人可溶性CDl37的dhfr-CHO细胞株，为获得纯化的CDl37抗原、制备CDl37单抗奠定了基础。