整合素αⅡbβ3缺陷对血小板由内到外信号传导的影响

目的：探讨整合素αⅡbβ3缺陷对血小板由内到外信号传导的影响。方法：采用DNA序列分析、流式细胞术、RT－PCR和Western blotting等检测细胞中转染cDNA的存在、表达及细胞结合PAC－1、纤维蛋白原（fibrinogen,Fb)的能力。结果：血小板无力症（GT）患者整合素αⅡbβ3明显低下，且血小板在ADP激活后不能结合PAC－1，转染β3和αⅡb（突变αⅡb^R995A或正常αⅡb）cDNA的CHO细胞株分别表达αⅡb^R995Aβ3和αⅡbβ3，并且突变株中国仓鼠卵巢细胞（Chinese hamster ovary,CHO)细胞αⅡb基因30外显子上第3077和3078位碱基由CG突变为GC，导致第995位精氨酸被替换为丙氨酸；在未活化的情况下，αⅡbβ3 CHO细胞几乎不结合PAC－1，但能结合Fb，而αⅡb^R995Aβ3 CHO细胞能结合PAC－1，且Fb明显增加。结论：αⅡb^R995A突变能诱导血小板内到外信号传导，使αⅡb^R995Aβ3表现为激活型受体；而GT患者却因整合素αⅡbβ3缺陷使αⅡbβ3介导的血小板由内到外信号传导受阻，使该GT患者表现出血小板聚集异常。     

整合素αⅡbβ3缺陷对血小板由内到外信号传导的影响

目的 :探讨整合素αⅡbβ3缺陷对血小板由内到外信号传导的影响。方法 :采用DNA序列分析、流式细胞术、RT PCR和Westernblotting等检测细胞中转染cDNA的存在、表达及细胞结合PAC 1、纤维蛋白原 (fibrinogen ,Fb)的能力。结果 :血小板无力症 (GT)患者整合素αⅡbβ3明显低下 ,且血小板在ADP激活后不能结合PAC 1,转染β3和αⅡb(突变αⅡbR995A 或正常αⅡb)cDNA的CHO细胞株分别表达αⅡbR995A β3和αⅡbβ3,并且突变株中国仓鼠卵巢细胞(Chinesehamsterovary ,CHO)细胞αⅡb基因 30外显子上第 30 77和 30 78位碱基由CG突变为GC ,导致第 995位精氨酸被替换为丙氨酸 ;在未活化的情况下 ,αⅡbβ3CHO细胞几乎不结合PAC 1,但能结合Fb ,而αⅡbR995Aβ3CHO细胞能结合PAC 1,且Fb明显增加。结论 :αⅡbR995A 突变能诱导血小板内到外信号传导 ,使αⅡbR995Aβ3表现为激活型受体 ;而GT患者却因整合素αⅡbβ3缺陷使αⅡbβ3介导的血小板由内到外信号传导受阻 ,使该GT患者表现出血小板聚集异常。     

抗GPⅡb／Ⅲa和抗CD9单克隆抗体对人血小板Ca对流的影响

采用Ca~(2 )敏感光蛋白Aequorin法测定结合位点在GPⅡb/Ⅲa的单克隆抗体(Mc-Ab)Apt_4及在CD9抗原的McAb XW-1和SJ-9A_4对人血小板胞浆Ca~(2 )的影响,发现Ap-t_4和XW-1可引起载有Aequorin的血小板Ca~(2 )内流,SJ-9A_4可引起载有Aequorin的血小板Ca~(2 )内流和释放。钙通道阻滞剂异搏定可完全抑制Apt_4引起的血小板Ca~(2 )内流和聚集,部分抑制XW-1和SJ-9A_4引起的血小板胞浆Ca~(2 )浓度([Ca~(2 )]i)升高和聚集。ADP抑制剂CP/CPK和钙调蛋宜抑制剂EBB部分抑制3种McAb的作用,环氧酶抑制剂ASA只有轻度抑制作用。实验结果提示3种McAb引起的血小板[Ca~(2 )]i升高和活化的途径不同。     

血小板膜糖蛋白αⅡbA477P（A446P）突变对αⅡbβ3复合物表达的影响

目的：探讨血小板膜糖蛋白αⅡbA477P（A446P）突变对αⅡbβ3蛋白表达的影响。方法：用重叠延伸PCR法对正常的αⅡb-pcDNA3.1+质粒载体进行体外定点诱变,构建了αⅡbA477P突变质粒载体;经体外真核细胞COS-7细胞转染试验后,从转录水平、蛋白质水平和膜表面复合物水平检测突变体在真核细胞内的表达。结果：突变的αⅡbA477P（A446P）基因在真核细胞内有转录,Western印迹显示细胞内有αⅡb蛋白的表达,但突变αⅡbA477P（A446P）β3复合物在细胞膜表面的表达量仅为正常αⅡbβ3复合物的12.95%。结论：αⅡbA477P（A446P）显著降低了αⅡbβ3复合物在细胞膜表面的表达,其机制可能是该位点的突变干扰了αⅡb和β3正常结合或者影响了αⅡb蛋白的正常构型。     

血小板膜糖蛋白αⅡbA477P（A446P）突变对αⅡbβ3复合物表达的影响（英文）

目的：探讨血小板膜糖蛋白αⅡbA477P（A446P）突变对αⅡbβ3蛋白表达的影响。方法：用重叠延伸PCR法对正常的αⅡb-pcDNA3.1＋质粒载体进行体外定点诱变,构建了αⅡbA477P突变质粒载体;经体外真核细胞COS-7细胞转染试验后,从转录水平、蛋白质水平和膜表面复合物水平检测突变体在真核细胞内的表达。结果：突变的αⅡbA477P（A446P）基因在真核细胞内有转录,Western印迹显示细胞内有αⅡb蛋白的表达,但突变αⅡbA477P（A446P）β3复合物在细胞膜表面的表达量仅为正常αⅡbβ3复合物的12.95%。结论：αⅡbA477P（A446P）显著降低了αⅡbβ3复合物在细胞膜表面的表达,其机制可能是该位点的突变干扰了αⅡb和β3正常结合或者影响了αⅡb蛋白的正常构型。     

Anti-human platelet tetraspanin (CD9) monoclonal antibodies induce platelet integrin αⅡbβ3 activation in a Fc receptor-independent fashion

Objectives　To characterize the activation of platelet integrin αⅡbβ3 induced by two anti-human platelet tetraspanin monoclonal antibodies (mAbs), HI117 and SJ9A4, and investigate their potential mechanism of action. Methods　Using 125　I-labeled human fibrinogen (Fg), specific Fg binding to human platelets induced by HI117 and SJ9A4 was measured. Results　HI117 and SJ9A4 (10μg/ml and 20μg/ml) induced specific Fg binding to human platelets, suggesting that the two mAbs evoked activation of platelet integrin αⅡbβ3. Further study indicated that HI117 and SJ9A4 induced integrin αⅡbβ3 activation independent of platelet Fc-receptors, and that HI117 and SJ9A4-induced integrin αⅡbβ3 activation was inhibited by pretreatment of platelets with sphingosine, aspirin, apyrase, and/or PGI2. Conclusions　Anti-platelet tetraspanin (CD9) mAbs, HI117 and SJ9A4, can induce platelet integrin αⅡbβ3 activation independent of Fc-receptors. Three signaling pathways, namely thromboxane, secreted ADP, and cAMP pathways, may be involved in the process, with protein kinase C activation presumably being the common step of the three pathways.