应用聚合酶链单链构象多态技术检测葡萄糖6磷酸脱氢酶基因突变

为了探索一种快速、灵敏及准确的检测红细胞葡萄糖６－磷酸脱氢酶（Ｇ６ＰＤ）基因点突变方法，我们采用单链构象多态技术（ＳＳＣＰ），对２０例Ｇ６ＰＤ变异型基因外显子２进行分析。发现有４例患者双链ＤＮＡ中有一条链出现泳动变位，明显慢于正常人及其他患者，用ＰＣＲ直接侧序表明在ｃＤＮＡ第９５位核苷酸发生碱基置换（Ｔ→Ｃ）。结果说明ＳＳＣＰ技术检测点突变具有广泛的应用前景，比现行的点突变检测方法简便易行。作者还对ＰＣＲ－ＳＳＣＰ的优点和所检测突变的特点进行了探讨。     

Prevalence of factor V Leiden and G6PD 1311 silent mutations in Dalmatian population

BACKGROUND: Factor V Leiden has been described as a common genetic risk factor for venous thromboembolism. The geographic distribution of this abnormality varies greatly, being high in Europe and almost absent in Asia and Africa. Particularly high prevalence is observed in some Mediterranean countries, which suggests the Mediterranean origin of this mutation. Similarly, prevalence of silent mutation 1311 of the G6PD gene seems to be higher among Mediterranean populations. Since the Dalmatian population (of south Croatia) geographically belongs to the Mediterranean populations we analyzed the prevalence of FV-Leiden and silent mutation 1311 in this region. Furthermore, because the coincidence of G6PD deficiency and venous thromboembolism was described earlier, we tested a possible association of FV-Leiden and G6PD deficiency. METHODS: One hundred sixty-eight healthy blood donors and 55 G6PD deficient individuals originating from the Dalmatian region were tested for the presence of FV-Leiden mutation and silent mutation 1311. RESULTS: Prevalence of FV-Leiden among blood donors was 2.4%, while among G6PD deficient individuals it was significantly higher, 11% (p=0.011). Prevalence of silent mutation 1311 among blood donors and G6PD deficient individuals was 21 and 15%, respectively. CONCLUSIONS: Observed allele frequencies among individuals originating from the Dalmatian region is similar to the neighboring European and Mediterranean populations. Interestingly, our results indicate the association of the FV-Leiden and G6PD deficiency and warrant further studies.     

云南省重点地区疟疾病例G6PD基因突变研究

目的 通过分析云南省间日疟病例G6PD基因特征,摸清病例G6PD基因分子流行病学分布,为云南省疟疾规范治疗提供技术参考。方法 收集2016年度云南省间日疟病例标本和病例流行病学史等信息,对照G6PD基因特征序列,采用聚合酶链式反应扩增目的基因片段,获得分析片段,对获取的片段进行电泳并进行序列测定。结果 使用MEGA及SPSS进行分析,分析位点突变率、群体间遗传分化指数及地区间突变差异情况。结果共计检测样本188份,基因主要突变类型为点突变（point mutation）,20280 C>T和1311 T>C突变率较高,突变率均为78.1%（147/188）,1311 T>C系沉默突变（silent mutation）,20280 C>T突变表现为单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphism）;未发现A95G、G1376T和G1388A突变。通过比对,云南间日疟病例G6PD基因与GenBank G6PD基因遗传距离为0.00~0.028,1311突变型（T>C）与1311野生型遗传距离为0.021。腾冲市1311 T>C突变率为92%（23/25）,盈江县1311 T>C突变率为77.8%（102/131）,两者差异无统计学意义（P>0.05）。结论 云南省间日疟病例G6PD基因主要突变位点地区间差异不明显,现有的疟疾治疗方案不需要调整,但治疗时应密切关注药物性溶血的发生。     

中国人G6PD基因EcoRI酶切位点研究

应用DNA Southern印迹杂交技术,以G6PD cDNA为探针,研究了16种限制酶的限制性片段长度多态,结果表明除EcoRⅠ外,其余15种限制酶均无多态改变,分析39例正常人与38例G6PD缺乏者G6PD基因ECO RⅠ酶切位点时,发现约20％的人出现7·0 kb的片段,1例G6PD患者出现6.0 kb片段,国外并无类似报道,并对这些片段来源及意义进行初步探讨。     

云南省西双版纳州G6PD缺乏症及其与疟疾流行关系的调查

目的了解云南省西双版纳州傣族及基诺族葡萄糖6-磷酸脱氢酶(G6PD)缺乏症患病率及其与疟疾的关系。方法运用四氮唑蓝纸片法对72例傣族及43例基诺族样本进行G6PD缺乏症的筛查,并调查其中31例傣族及25例基诺族的既往疟疾病史。结果经筛查发现西双版纳州傣族及基诺族G6PD缺乏症的患病率分别为0.2500和0.1395,且后者G6PD缺陷的基因频率为0.1579。结论西双版纳州属G6PD缺乏及疟疾高发区,两种疾病的流行区域具有一定的相关性,提示G6PD基因突变可能是自然选择长期作用的结果。     

三种生化法和基因检测诊断G6PD缺陷症

目的：联合三种生化法和基因检测对G6PD缺陷症进行诊断，以提高这种儿科临床常见溶血性疾病的确诊率。方法：采用高铁血红蛋白还原试验、G6PD活性试验、G6PD定量比值法三种生化实验并联合应用南方地区常见的三种G6PD基因突变检测对急性溶血患儿57例进行诊断。结果：57例患儿中，高铁血红蛋白还原率降低52例，正常5例；G6PD活性低下51例，正常6例；G6PD／6PGD降低48例，正常9例。三种生化检测阳性率分别为91．2％、89．5％和84．2％；52例被检出存在基因突变，其中位点G1388A32例（61．5％）、G1376T16例（30．8％）、A95G4例（7．7％）。另有5例未能检测到有突变，估计属其它少见突变类型。结论：联合应用三种生化法和基因检测可以提高G6PD缺陷的确诊率。     

膜反向斑点杂交法检测广东人G6PD基因6种常见突变

【目的】 探讨膜反向斑点杂交法在广东人G6PD基因6种常见突变同步检测中的应用。【方法】 用高铁血红蛋白还原试验和G6PD/6-PGD酶活性比值法进行G6PD缺乏症筛查。应用多重PCR方法扩增G6PD基因目的片段。用Premier Primer6.0软件设计和优化针对广东人常见6种G6PD基因突变型的特异性寡核甘酸探针,用乙基-3-二甲氨基丙碳二亚胺(EDC)法处理尼龙膜并固定探针,制成G6PD基因突变检测用膜条。多重PCR扩增产物与固定在膜条上寡核苷酸探针进行杂交,通过显色反应判读结果。以G6PD基因测序为金标准,对膜反向斑点杂交法进行评价。【结果】 26例标本中膜反向斑点杂交法检测结果:95 A→G突变型5例,1024C→T突变型3例, 1376 G→T突变型8例,1388G→A突变型7例,392 G→T突变型1例,未发现1311C→T突变型,有两例检测为阴性。膜反向斑点杂交法未能测出的2例标本经基因测序证实存在392G→T突变,其余24例膜反向斑点法与基因测序法的结果完全一致,符合率为92.3%(24/26)。【结论】 在优化探针设计和杂交条件前提下,膜反向斑点杂交法可用于广东人G6PD基因6种常见突变型的同步检测。     

海南黎族自治县地区新生儿G6PD缺乏症基因分析

目的了解海南省黎族自治县地区葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase, G6PD)缺乏症发病情况和基因突变特点。方法收集该地区2017年1—12月出生的新生儿干血片,采用荧光分析法进行G6PD酶活性筛查,对初筛阳性的干血片样本采用多色探针荧光PCR熔解曲线法(MMCA)进行基因突变分析。结果共收集14 130例新生儿干血片,G6PD酶活性筛查共筛出1 059例阳性,初筛阳性率为7.49%,其中男性682例,女性377例,男性新生儿G6PD初筛阳性率9.13%,女性5.66%,男女初筛阳性率差异有统计学意义(P<0.01)。黎族新生儿初筛阳性率8.33%,汉族6.25%,不同民族比较差异有统计学意义(P<0.01)。通过MMCA法对1 059例初筛阳性干血片进行基因检测分析,共检出864例样本发生突变,突变率81.59%;男性突变率86.07%,女性73.47%,男女间差异有统计学意义(P<0.01);黎族突变率83.26%,汉族77.71%,突变率差异有统计学意义(P=0.033)。本次共检出11种G6PD基因单一突变型(c.1376 G>T、c.1388 G>A、c.95 A>G、c.871 G>A、c.519 C>T、c.1024 G>T、c.392G>T、c.1360C>T、c.517T>C、c.592C>T和c.86C>T)和5种复合突变型,其中c.1376 G>T复合c.871 G>A突变、c.1376 G>T复合c.517 T>C突变和c.392 G>T复合c.871G>A突变在海南省尚属首次报道。结论海南省黎族自治县地区是G6PD缺乏症高发区,黎族为高发人群,基因突变类型复杂多样,突变以c.1376G>T、c.1388G>A、c.95 A>G和c.871 G>A四种最为普遍。在G6PD缺乏症高发地区开展G6PD的活性筛查和基因检测,有利于G6PD缺乏症的确诊和防治,提高出生人口素质。     

一种新的G6PD基因突变型的鉴定

目的:鉴定1例葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症患者的基因突变。方法:用聚合酶链反应、限制性内切酶筛查葡萄糖-6-磷酸酶基因1388G→A、1376G→T、1360C→T、1024C→T、592C→T、517T→C、493A→G,487G→A、392G→T、95A→G突变,用单链构象多态性筛查葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因的所有外显子,用核苷酸序列测定确定基因突变。结果:该患者未存在1388G→A、1376G→T、1360C→T、1024C→T、592C→T、517T→C、493A→G、487G→A、392G→T、95A→G突变,但在外显子8发现了一种新的G6PD基因突变———835A→G突变,此突变导致第279位的苏氨酸被丙氨酸取代,将其命名为G6PD-海口,其酶活性约是正常的10%,比835A→T突变型的活性低,后者的酶活性约是正常的40%;分析人G6PD的三维结构模型表明,第279位苏氨酸残基的羟基对于维持G6PD亚基的相互作用具有非常重要的作用。结论:835A→G突变是一种新的G6PD基因突变型,G6PD的第279位苏氨酸残基的羟基是维持G6PD亚基相互作用及酶活性的必需基团。     

海南省新生儿葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症的基因突变型分析

[目的]通过对新生儿疾病筛查中确诊的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)缺乏症患儿进行基因检测,确定海南省新生儿G6PD缺乏症的分子生物学基础.[方法]通过荧光斑点法在新生儿群体中筛查出可疑或阳性者,经G6PD/6GPD比值法确诊.将G6PD缺乏症患儿静脉血做DNA直接扩增法(PCR)、PCR-等位基因特异的寡核苷酸探针(PCR-ASO)分析、PcR-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)分析和PCR-单链构型多态性(PCR-SSCP)分析,检测基因突变.[结果]G6PD缺乏症新生儿51例中属于G1 376T的16例(31.37%)、属于G1 388A的11例(21.57%)、属于A95G的4例(7.84%)、属于G392T的2例(3.92%)、属于G871A的2例(3.92%)、属于A835T的1例(1.96%),属于T517C的1例(1.96%);余14例没有发现上述突变.[结论]海南省新生儿G6PD缺乏症的基因突变型与我国该遗传病其他高发地区的基因突变谱相似;未发现A835G-G6PD-海口突变型.     

贵州省荔波县瑶族G6PD缺陷症的基因频率调查

目的：调查贵州省荔波县瑶族葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)缺陷症的基因频率。方法：随机选取280名荔波县当地瑶族男性居民，采用四氮唑蓝(NBT)纸片定性法初筛，G6PD／6PGD比值法定量确诊。结果：对贵州省荔波县280名瑶族男性进行筛查，共检出24例阳性，其基因频率为0．0857。结论：通过对贵州省荔波县瑶族G6PD缺乏症基因频率的调查和分析，了解贵州省少数民族G6PD缺乏症的分布特征，为该地区预防该疾病、指导临床、提高少数民族的身体素质及研究该民族起源提供了一定的依据。     

G6PD缺陷症基因型分析：一种新的错义突变

目的对葡萄糖-6磷-酸脱氢酶（G6PD）缺陷症患者进行G6PD基因型分析,分析基因突变类型。方法选取经G6PD活性测定确诊为G6PD缺陷症的49例患者和100名G6PD活性正常的体检者的全血标本,PCR和DNA测序法对G6PD基因外显子2~13进行序列分析。结果 49例G6PD缺陷症患者中,共发现12种错义突变,其中常见的三种为G6PD G1388A（26.5%）、G1376T（28.6%）和A95G（14.3%）,此三类基因型患者G6PD活性仅为正常人群的5%~18%。临床主要表现为新生儿黄疸、进食蚕豆后发生急性溶血性贫血等。其余突变类型包括C1024T（4.1%）、C1225T（2.0%）、C1159T（2.0%）、G487A（4.1%）、G392T（4.1%）、G1160A（6.1%）、G871A/C1311T（4.1%）和C406T/C1311T（2.0%）;在外显子7上发现了一种新的错义突变即G691C,该突变造成G6PD第231位丙氨酸（A la）被脯氨酸（Pro）替代。正常对照标本未发现相同的基因改变。结论 G6PD基因G1388A、G1376T和A95G是G6PD缺陷症患者最常见的三种突变类型。新发现的G691C突变导致A la231Pro,是引起红细胞G6PD活性降低,患者临床出现溶血症状的主要原因。     

全自动生化分析仪检测G6PD活性在孕检中的意义

目的：探讨全自动生化分析仪检测G6PD活性对孕妇产前体检时G6PD缺乏和地中海贫血初筛的意义。方法：200份标本用生化分析仪检测G6PD活性，同时作高铁血红蛋白还原（MHB—RT）检测和血红蛋白电泳检测。结果：用生化仪检测G6PD活性其降低者与高铁血红蛋白还原检测结果极为吻合（吻合系数κ=0．872）；G6PD活性增高者与血红蛋白电泳时发现地中海贫血的结果也极为吻合（吻合系数，κ=0．862）。结论：用全自动生化分析仪直接快速检测G6PD活性，对孕妇产前G6PD缺乏和地中海贫血的初筛具有重要意义。     

G6PD缺陷症对新生儿高胆红素血症病程的影响

目的探讨G6PD缺陷症对新生儿高胆红素血症病程的影响。方法确诊高胆红素血症新生儿77例,分为两组:G6PD缺陷症组37例,G6PD正常组40例。全部病例均给予双面蓝光光疗,对比两组新生儿治疗前血清总胆红素(Total serum bilirubin,TSB)、血红蛋白和治疗后TSB、血红蛋白、总光疗时间、住院天数。结果 G6PD缺陷症组和G6PD正常组新生儿治疗前TSB分别为(278.43±15.26)μmol/L和(276.68±12.15)μmol/L(P>0.05),血红蛋白分别为(165.58±10.90)g/L和(160.95±9.76)g/L(P>0.05)。G6PD缺陷症组和G6PD正常组新生儿治疗后TSB分别为(168.70±9.79)μmol/L和(162.68±12.09)μmol/L(P<0.05),血红蛋白分别为(150.59±7.82)g/L和(153.63±7.80)g/L(P>0.05)。G6PD缺陷症组和G6PD正常组新生儿总光疗时间分别为(65.51±16.87)h和(45.00±12.67)h(P<0.01),住院天数分别为(7.22±1.60)d和(5.58±1.45)d(P<0.01)。结论 G6PD缺陷症新生儿虽无明显溶血发生,但G6PD缺乏也会延缓高胆红素血症的消退,增加光疗时间和住院天数。     

全自动生化分析仪检测G6PD活性在孕检中的意义

目的:探讨全自动生化分析仪检测G6PD活性对孕妇产前体检时G6PD缺乏和地中海贫血初筛的意义。方法:200份标本用生化分析仪检测G6PD活性,同时作高铁血红蛋白还原(MHB-RT)检测和血红蛋白电泳检测。结果:用生化仪检测G6PD活性其降低者与高铁血红蛋白还原检测结果极为吻合(吻合系数κ=0.872);G6PD活性增高者与血红蛋白电泳时发现地中海贫血的结果也极为吻合(吻合系数κ=0.862)。结论:用全自动生化分析仪直接快速检测G6PD活性,对孕妇产前G6PD缺乏和地中海贫血的初筛具有重要意义。     

贵州土家族葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因突变型

目的研究贵州土家族葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)基因致病突变型,检测G6PD缺乏症发生率及基因频率。方法通过硝基四氮唑蓝纸片法对2 789例土家族男性进行G6PD缺乏症定性筛查,用变性高效液相色谱技术和DNA测序对78例个体进行基因突变型鉴定。结果在2 789例纯系土家族男性中,发现2例酶活性异常。在印江县采集的78例(2例酶活性异常和76例正常)纯系土家族男性血样中,共检出G6PD c.1388G>A突变2例、c.1376G>T突变1例和c.1311C>T/IVS 11+93T>C突变2例,基因突变型分别占2.6%、1.3%和2.6%。结论在贵州土家族人群中发现c.1388G>A、c.1376G>T和c.1311C>T/IVS11+93T>C 3种突变型,是共同存在于中国人群的G6PD基因突变型,中华民族可能源于共同的祖先;贵州省印江县土家族男性G6PD缺乏症的基因频率为6.5%,可为上述地区G6PD缺乏症的防治提供依据。     

深圳市龙岗区3465例育龄人群G6PD缺乏症筛查分析

目的:了解深圳市龙岗区葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)缺乏症的发病情况,为开展产前诊断和优生优育工作提供依据。方法:采用改良G6PD定量比值法对2005年~2009年来我中心进行G6PD缺乏症检测的3 465例育龄对象的全血样本进行G6PD和6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶(6PGD)活性定量检测,并计算G6PD与6PGD的比值。结果:男性受检者G6PD缺乏症检出率为4.8%,女性受检者G6PD缺乏症检出率为3.7%。结论:G6PD缺乏症在本地区有较高发病率,育龄夫妇双方进行G6PD的检测,对优生优育,提高人口素质有重要意义。     

KRT6A基因I462S新生突变导致Ⅰ型先天性厚甲症

目的研究I型先天性厚甲症患者KRT6A基因突变情况,为建立该病的基因诊断与遗传咨询提供依据。方法提取1例I型先天性厚甲症患者及家系成员和50名正常对照外周血白细胞基因组DNA.设计针对KRT6A基因的特异引物,采用聚合酶链反应(PCR)扩增基因的全部编码序列,DNA直接测序明确具体的突变位置和方式,限制性内切酶反应验证基因突变。结果 PCR结合DNA测序发现患者KRT6A基因第7外显子存在异常;第1385位核苷酸由胸腺嘧啶(T)突变为鸟嘌呤(G),导致KRT6A角蛋白2B螺旋区末端第462位密码子由异亮氨酸(I)变成丝氨酸(S),即发生1462S错义突变。患者父母及与家系无血缘关系的50名正常对照均未发现此突变,提示I462S为一种新生突变(de novo mutation)。结论 KRT6A基因1462S新生错义突变是导致该例患者I型先天性厚甲症的特异突变。     

基因检测在Ⅳ型埃勒斯-当洛综合征诊断中的意义

目的 埃勒斯-当洛综合征(Ⅳ型)是临床罕见病例,诊断困难,基因检测技术可明确该病诊断.方法 设计Col3A1基因引物,提取患者外周血标本DNA,PCR扩增后行测序分析碱基突变点,确认氨基酸变化位置,结合临床特征进行疾病诊断.结果 患者Col3A1基因外显子30的第2209个碱基及内含子15的第327碱基出现套峰.在2209位碱基出现G-A的突变,造成第698个氨基酸变化,由丙氨酸(Ala)改变为苏氨酸(Thr),即:P.A698T(c.2209G＞A),突变来源于先证者家系.结论 基因检测可以明确埃勒斯-当洛综合征诊断,对临床有指导意义.

Abstract：

Objective To ascertain the diagnosis of such a rare disease as Ehlers-Danlos syndrome type Ⅳ by the technique of DNA(deoxyribonucleic acid)analysis.Methods The primer sequences of Col3A1 gene were designed. Genomic DNA was isolated from the peripheral blood samples. The amplification of polymerase chain reaction(PCR)was performed and direct sequencing used to screen the mutations.A definite diagnosis was made in conjunctions with clinical features.Results Two nucleotide mutations for Col3A1 were found. One was in intron 15 while another in exon 30. The latter was an important mutation of a G to A transition(c.2209G＞A)resulting in alanine to threonine substitution at position(p.Ala698Thr).The mutations were inherited from proband of pedigree.Conclusion Genetic testing of Col3A1 mutation can facilitate an accurate diagnosis of Ehlers-Danlos syndrome.     

帕金森病患者线粒体DNA突变位点G1719A、G4580A、C7028T分析

目的研究有关线粒体DNA（mtDNA）点突变与我国人群散发性帕金森病（Parkinson disease,PD）的关系。方法采用经典的酚／氯仿抽提法对88例PD患者（研究组）和60例健康体检者（对照组）的全血基因组DNA进行抽提,针对与PD发病有关的mtDNA突变位点G1719A、G4580A、C7028T设计特异的引物,经过PCR鉴定和基因测序,在NCBI基因库上进行BLAST比对分析,发现突变位点。结果PD患者有10例在C7028T位点发现突变,8例在G1719A位点发现突变,3例在G4580A位点发现突变,对照组未发现突变位点。结论散发性PD患者存在线粒体基因的点突变,线粒体基因的点突变可能参与PD的发病过程。