兔软骨细胞的分离培养及其生物学特征的检测

目的探讨兔关节软骨细胞分离培养方法和生物学特征。方法采用酶消化法分离获取软骨细胞，通过倒置显微镜下观察、绘制生长曲线、组织化学染色及逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）等方法了解其生物学特性。结果分离获取细胞活性率可达98％以上，原代细胞和第1代细胞以三角形或多角形为主，生长融合时呈卯圆形，甲苯胺蓝染色呈阳性。第3代以后细胞出现反分化现象。结论本方法是一种方便且有效的培养法。     

关节软骨细胞体外培养及生物学特性的实验研究

目的:探讨关节软骨细胞培养方法及其生物学特征。方法:从4周龄新西兰乳兔关节分离静置培养软骨细胞,倒置显微镜下观察原代及传代细胞形态变化,并计数绘制生长曲线。用番红-O,甲苯胺蓝染色和免疫细胞化学法观察蛋白多糖,碱性糖胺聚糖(GAGs),Ⅱ型胶原的分泌情况,用PCR鉴定Ⅱ型胶原,Aggrecan基因的表达。结果:成功建立兔关节软骨细胞体外培养实验方法。形态学及免疫化学染色显示体外培养3代以内的软骨细胞可保持表型稳定而3代后软骨细胞呈现增殖缓慢及衰老现象。结论:本实验建立的体外培养关节软骨细胞方法简单可行,3代内的兔软骨细胞表型稳定且生物学活性较高,具备可用于实验研究的能力。     

白细胞介素-10对大鼠移植肺再灌注损伤的保护作用

目的: 探讨白细胞介素-10(IL-10)对大鼠移植肺再灌注损伤的保护作用及机制. 方法: 将SD大鼠36只随机分为3组,每组12只,即假手术对照组(Control)、肺移植组和肺移植加IL-10处理组. 观察受体气管内滴入IL-10对移植肺再灌注损伤的保护作用. 肺功能指标包括血氧分压、肺湿干重比、肺通透性指数、支气管肺泡灌洗液(BALF)中白细胞计数和分类;ELISA法检测受体血清中肿瘤坏死因子α(TNFα)含量. 结果: 肺移植术后1 h,肺湿干重比、肺通透指数和BALF中中性粒细胞百分比分别为(6.57±0.89)、(23.49±5.13)×10-4和(49.84±6.53)%,显著高于对照组(P﹤0.01),经气管内给予受体大鼠IL-10可明显降低上述指标至(4.23±0.58)、(15.96±3.04)×10-4和(20.33±4.26)%(P﹤0.01);肺移植组血清TNFα含量(μg/L)为(0.86±0.11),较对照组显著升高(P﹤0.01),IL-10可明显降低血清TNFα水平至[(0.39±0.05),P﹤0.01]. 结论: IL-10对移植肺缺血/再灌注损伤有显著的保护作用,与其抑制中性粒细胞激活和炎性因子TNFα分泌有关.     

芹菜素抑制IL-1和脂多糖诱导软骨细胞产生NO

目的：研究植物酮芹菜素对ＩＬ－１,脂多糖诱导软骨细胞产生一氧化氮的抑制作用。方法：ＩＬ－１,ＬＰＳ体外衣导兔软骨细胞产生ＮＯ。以一氧化氮合酶抑制剂,Ｎ－硝基－Ｌ－精氨酸做对照,研究芹菜素对产生ＮＯ的抑制作用。结果和结论;芹菜素剂量依赖性地抑制ＩＬ－１或ＬＰＳ诱导的ＮＯ产生,其抑制作用强于Ｎ－硝基－Ｌ－精氨酸。     

IGF-1对IL-1诱导的兔关节软骨细胞NO和PGE2的影响

目的:检测合成性细胞因子胰岛素样生长因子-1(insulin-like growth factor-1,IGF-1)对损伤性细胞因子IL-1(interhukin-1)诱导的兔关节软骨细胞产生NO(nitric oxide)和前列腺素(prostaglandinE2,PGE2)的影响,探讨IGF-1在骨关节炎治疗中的作用机制.方法:实验分为IL-1β10μg/L组、IL-1β10 μg/L IGF-1 1μg/L组、IL-1β 10 μg/L IGF-1 10μg/L组、IL-1β 10 μg/L IGF-150 μg/L组、IL-1β 10 μg/L IGF-1 100 μg/L组、IGF-150 μg/L组和空白对照组.首先进行2月龄兔原代软骨细胞的培养并进行鉴定,然后将IL-1β 10 μg/L单独或与不同浓度的IGF-1共育于第2代兔关节软骨细胞,硝酸还原酶法测定实验组细胞上清液NO的含量,ELISA酶联免疫竞争法测定细胞上清液中PGE2含量,再对测定的NO和PGE＜2的浓度与IGF-1和IL-1的浓度进行有关的统计学分析.结果:IL-1β10μg/L组NO浓度为(89.971±10.224) μmol/L,PGE2浓度为(22.028±8.731)ng/L;空白组NO浓度为(12.404±8.809)μmol/L,PGE＜2浓度为(1.900±0.227)ng/L.IL-1β 10 μg/L组与空白组比较,NO和PGE＜2明显增加,差异有统计学意义(P＜0.05).在IL-1β均为10 μg/L时,IGF-1可以呈剂量依赖地降低IL-1诱导的兔关节软骨细胞NO和PGE2的升高,并且在50 μg/L时即可达到最佳浓度.结论:IL-1能增加软骨细胞培养中的NO和PGE2的产生.IGF-1在体外可以呈剂量依赖地降低IL-1诱导的兔关节软骨细胞NO和PGE2的升高,其最佳浓度为50 μg/L.     

沙眼衣原体感染诱导Hela细胞分泌IL-8和IL-10

目的 :探讨沙眼衣原体 (CT)感染对上皮细胞系Hela细胞产生IL 8和IL 10能力的影响。方法 :采用细胞培养法和ELISA法 ,对感染CT的Hela细胞上清进行IL 8和IL 10检测。结果 :CT感染的Hela细胞IL 8和IL 10分泌量随感染剂量增加而增高 ;感染 2 4h后 ,IL 8和IL 10开始显著增加 ,72h达高峰 ,以后开始下降 ,虽然热灭活CT(HI CT)也能诱导IL 8和IL 10表达 ,但诱导水平显著低于感染组。结论 :CT感染能诱导Hela细胞大量分泌IL 8和IL 10 ,并且呈时间和剂量依赖性 ,此种作用可能与CT入侵、细胞内复制有关。     

白介素10对急性肺损伤保护作用的实验研究

目的：探讨白介素10（IL－10）对急性肺损伤（ALI）的保护作用。方法：气道内滴注内毒素（LPS，10mg/kg）建立大鼠AIL模型。54只雄性SD大鼠随机分为对照组、内毒素组、内毒素加IL－10组，每组18只（2h 、6h、24h各6只）。按时相处死并采集标本，观察大鼠体重、动脉血气分析、肺系数、支气管肺泡灌洗液（BALF）总蛋白水平、BALF细胞总数及分类计数、血清及BALF中TNF－α水平、肺病理。结果：内毒素组大鼠体重、动脉血氧分压（PaO2）进行性降低，肺系数、BALF总蛋白水平、BALF细胞总数均明显增加，分类以中性粒细胞（PMN）为主，血清及BALF中TNF－α水平明显升高，肺病理示肺内PMN大量浸润伴出血、透明膜形成。IL－10组的各项指标均较内毒素组减轻。结论：①气道内滴注内毒素可成功复制ALI模型。②BALF的TNF－α水平比血中TNF-α水平与肺损伤具有更好的相关性。③IL－10可减轻LPS诱导的ALI。     

人白介素10逆转录病毒表达载体的构建

目的构建一个人白介素10(hIL-10)逆转录病毒表达载体,为研究hIL-10的生物学活性打下基础.方法用限制性内切酶消化提取质粒pCDHIL-10中hIL-10全长cDNA,采用定向克隆的方法将hIL-10基因插入逆转录病毒载体pLXSN的多克隆位点中,经转化、扩增、限制性内切酶消化,电泳鉴定分析.结果外源性hIL-10基因成功插入到逆转录病毒载体pLXSN的中.结论成功完成了人白介素10(hIL-10)逆转录病毒表达载体的构建,为今后进一步研究hIL-10的生物学活性打下了基础.     

SV40LTAg基因永生化软骨细胞体外培养的生物学特性

目的探讨永生化关节软骨细胞体外培养的生物学特性。方法用SV40LTAg(类人猿40病毒大T抗原)基因转染原代培养的关节软骨细胞,构建永生化关节软骨细胞系(immortalized cartilage chondrocytes)并体外培养,以正常关节软骨细胞(normal cartilage chondrocytes)作对照。倒置显微镜下观察永生化软骨细胞的形态学变化和增殖情况;应用甲苯胺蓝、番红O及Ⅱ型胶原免疫组织化学染色,观察永生化软骨细胞在培养过程中酸性粘多糖(GAG)和胶原分泌情况。结果永生化关节软骨细胞体外培养呈贴壁单层生长,长期传代(50代)仍有很强的增殖能力,形态呈现多角形和三角形,GAG和胶原染色均呈阳性。结论构建的永生化关节软骨细胞在体外培养能长期维持软骨细胞的特征性表型。     

血清白细胞介素10、白细胞介素18在急性胰腺炎中的变化及意义

目的 探讨促炎性细胞因子白细胞介素18(IL-18)与抗炎性细胞因子白细胞介素10(IL-10)在急性胰腺炎中的变化及意义.方法 对10例健康志愿者(对照组)、10例急性水肿性胰腺炎(MAP)组、10例急性出血坏死性胰腺炎(SAP)组,分别于第1、2、5、10天进行APACHEII评分,血清TNF-α、IL-10、IL-18的测定,并对第1天IL-18与APACHEII评分,血清TNF-α、IL-10做相关性分析.结果 MAP组与SAP组APACHEII评分,血清TNF-α、IL-10、IL-18水平显著高于对照组(P＜0.01).发病初期MAP组血清IL-10水平高于SAP组(P＜0.01).SAP组血清TNF-α、IL-18水平高于MAP组(P＜0.01),第1天IL-18水平与APACHEII评分,血清TNF-α水平呈正相关关系(r=0.82,P＜0.01;r=0.74,P＜0.01),与血清IL-10呈负相关关系(r=-0.58,P≤0.01).结论 促炎性细胞因子IL-18与抗炎性细胞因子IL-10参与了急性胰腺炎的炎症反应过程,可以预测急性胰腺炎的严重程度.     

内异方对子宫内膜异位症IL-6、IL-10的调节作用

目的：探讨中药内异方对子宫内膜异位症细胞因子IL-6、IL-10的调节作用。方法：根据Cummings AM方法建立子宫内膜异位症动物模型,采用ELISA法检测IL-6、IL-10含量。结果：非治疗组的腹腔巨噬细胞数量及巨噬细胞在脂多糖（LPS）刺激下产生的IL-6含量显著高于正常对照组;内异方治疗组异位种植内膜组织质量、腹腔巨噬细胞数量及巨噬细胞在LPS刺激下产生的IL-6水平显著低于非治疗组;非治疗组腹腔巨噬细胞在LPS刺激下产生的IL-10含量显著低于正常对照组和内异方组。结论：子宫内膜异位症细胞因子IL-6、IL-10的失衡与疾病的发生发展有关。内异方通过抑制IL-6的合成、促进IL-10的分泌,从而阻止了异位内膜组织的生长。     

兔甲状软骨细胞体外培养研究

目的:研究体外培养的甲状软骨细胞的生物学特性。方法:分离培养兔甲状软骨细胞,进行原代与传代培养,用倒置显微镜及组织学方法观察细胞形态、功能及生长增殖。结果:原代、第2代、第3代软骨细胞呈圆形或多角形,第4代有一半变成梭形,第6代绝大多数变成长梭形;原代甲状软骨细胞阿新蓝染色阳性,具有合成和分泌糖胺多糖的功能。结论:体外单层培养的兔甲状软骨细胞表型能保持3代稳定,具有正常的生长增殖能力。     

地塞米松对大鼠肺缺血再灌注损伤保护的研究

目的:通过观察地塞米松对大鼠肺缺血再灌注后病理形态变化的影响,探讨其对肺缺血再灌注损伤的保护机制。方法:健康的SD大鼠40只,雌雄不拘,随机分为5组:假手术组(S)、单纯缺血组(I)、缺血再灌注组(IR)、小剂量地塞米松干预组(D1)及大剂量地塞米松干预组(D2),每组8只。根据Eppinger模型制作SD大鼠单侧肺缺血再灌注动物模型,用Western印迹法分析各实验组中一氧化氮合酶蛋白表达的变化,HE染色观察肺组织病理形态学改变结果:与其它组比较,缺血再灌注组肺组织中蛋白一氧化氮合酶表达明显增高(P<0.01),在地塞米松干预后,一氧化氮合酶蛋白下降,以D2组明显,病理切片显示IR组肺结构损害分级显著重于其它组,在地塞米松干预后,肺结构损害分级下降,以D2组明显。结论:正常肺脏一氧化氮合酶蛋白的表达微弱,缺血再灌注可使一氧化氮合酶蛋白表达增加,肺组织损伤加重,地塞米松可使一氧化氮合酶蛋白表达下降,肺组织损伤减轻,这种效应以大剂量时明显。     

白细胞介素——10与过敏性哮喘发病的关系及临床意义

目的：探讨白细胞介素－１０（以简称ＩＬ－１０）与过敏性哮喘发病的关系。方法：对５０例过敏性哮喘患者以及５０例正常对照者外周血单个核细胞（以下简称ＰＢＭＣ）分别在有无过敏原以及糖皮质激素存在的条件下,体外培养后采用双抗体夹心酶联免疫吸附法,分别测定上清ＩＬ－１０分泌水平。结果：过敏性哮喘ＰＢＭＣ培养后自发分泌ＩＬ－１０水平显著低于正常对照组（Ｐ〈０．０１）。加入屋尘螨（ＨＤＭ１０μｇ／ｍｌ）培养条件     

褪黑素对百草枯肾损伤的保护作用

目的观察褪黑素（MT）对百草枯（PQ）染毒大鼠肾组织中血红素氧合酶-1（HO—1）和诱导型一氧化氮合酶（iNOS）表达的影响,了解MT对PQ中毒肾损伤保护作用。方法SD大鼠随机分空白对照组（A组）、染毒组（B组）和MT治疗组（C组）。B、C组PQ（25mg／kg）、A组等量盐水腹腔注射,15min后C组MT（10mg／kg·d）腹腔注射。观察各组肾组织病理学及HO-1、iNOS表达的变化。结果A组组织结构清晰,B组组织结构清晰度下降,染毒3h即可见充血、水肿及空泡变性等病理变化,1d达峰,其后缓解趋势不明显,C组病理变化明显减轻且缓解趋势明显,A组HO-1多不表达,B组染毒3h呈阳性表达,免疫组织化学评分（IHS）升高（P〈0．05）,1d达峰,之后减弱。C组较B组表达明显增强,6h～3d差异具有统计学意义（P〈0．05）;A组iNOS多不表达,B组染毒3h呈阳性表达,1d达峰,其后维持较强表达,C组较B组IHS降低,1d达峰,其后减弱,3d后维持在较低水平,5d时仍有表达（P〈0．05）。结论MT对PQ中毒引起的肾损伤有保护作用。     

大鼠白细胞介素—10cDNA的克隆

目的：克隆大鼠白细胞介素－10（IL－10)cDNA的全长序列，为其分子生物学利用奠定基础，方法：无菌条件下切取大鼠的脾脏，收集脾细胞，用脂多糖（LPS）刺激培养4h离心得到一定量细胞，加入变性液，一步法提取细胞总RNA；逆转录合成IL－10的第1条链，用自己设计的特异性上下游引物进行PCR扩增，得到期望相对分子质量的PCR产物；酶切后插入pcDNA3载体，转染感受态细胞进行筛选制备，并行PCR、酶切鉴定和测序。结果：脾细胞经LPS刺激后IL－10转录水平增加，从提取的RNA转录产物中容易扩增出期望相对分子质量的PCR产物，酶切和PCR鉴定证明所得IL－10cDNA相对分子质量与其因库报告的相近，测序表明得到的IL－10cDNA充阢与基因库报告的序列完全一致，结论，大鼠的IL－10cDNA全长序被成功克隆。     

T-2毒素对软骨细胞NO合成、iNOS表达的影响

目的:探讨T-2毒素对软骨细胞一氧化氮(NO)合成、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)表达的影响。方法:取胎儿软骨细胞体外培养,培养过程于培养液中加入不同浓度的T-2毒素(1~20μg/L)连续培养5d,用Griess重氮化法测定软骨细胞培养上清液中NO含量;用Western-Blot检测软骨细胞iNOS蛋白的表达;用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测软骨细胞iNOS mRNA表达。结果:T-2毒素在1~20μg/L浓度范围内,能明显增加培养上清液中NO的含量,并使iNOS蛋白表达水平明显升高(P<0.05);当T-2毒素浓度达10~20μg/L时能引起iNOS mRNA表达水平提高(P<0.05),浓度越高,刺激作用越强。结论:T-2毒素使软骨细胞iNOS表达增强并使NO合成增多;T-2毒素引起的软骨细胞损伤与合成NO增多有关。     

转化人关节软骨细胞的Ⅱ型胶原表型诱导

目的 用离心管聚集体培养（Aggregate culture)诱导转化人关节细胞的Ⅱ型胶原。方法 将体外长期培养的第30，40，50代转化软骨细胞消化后进行离心管培养，比较细胞在单层培养，离心管聚集体培养，以及在普通培养基，RAI诱导培养基下[2型骨形态发生蛋白（BMP－2）＋抗坏血酸盐（Ascorbate) 胰岛素（insulin)]，Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ型胶原的表达和胞外基质发生情况。结果 在单层培养条件下，转化软骨细胞只表达Ⅰ型胶原，而在BAI诱导培养基及离心管聚集体培养下转化软有细胞表达的Ⅱ型胶原和大量胞外基质。结论 离心管聚集体培养是诱导转化软骨细胞Ⅱ型胶原的有效方式。     

地塞米松磷酸钠对兔关节软骨细胞体外培养的影响

目的探讨地塞米松磷酸钠对体外培养兔关节软骨细胞的影响。方法兔关节软骨细胞常规培养后随机分为对照组和实验组,对照组用不合地塞米松磷酸钠的DMEM培养液培养,实验组则分别加入含不同浓度地塞米松磷酸钠的DMEM培养液,应用流式细胞术及免疫细胞化学法检测软骨细胞增殖情况及其合成Ⅱ型胶原能力,并应用透射电子显微镜观察软骨细胞超微结构的变化。结果实验各组软骨细胞进入S期、G2＋M期的细胞比率较对照组软骨细胞减少、进入G0／G1期的细胞比率增加,免疫细胞化学阳性信号的平均灰度值与对照组平均灰度值的差异均有显著性,电镜下见软骨细胞线粒体、粗面内质网数量减少。结论地塞米松磷酸钠可抑制软骨细胞的增殖,可能与抑制关节软骨细胞的Ⅱ型胶原和蛋白合的合成能力有关。