基因重组蛋白L243诱导表达包涵体的变性、复性与纯化

目的 对来自于日本七鳃鳗的基因重组蛋白L243包涵体进行变性、复性与纯化,以获得成分均一的活性蛋白.方法 以6 mol/L尿素为变性剂,以0.1 mol/L氧化型谷胱甘肽及0.9 mol/L还原型谷胱甘肽为复性剂,对构建于pET23b的日本七鳃鳗L243基因在大肠杆菌Rosetta中表达的包涵体进行了的变性、复性与组氨酸亲和层析纯化.结果 经变性、复性后,获得了均质的L243纯化蛋白,该蛋白的复性率达80%.结论 成功对上述重组蛋白包涵体进行了变性、复性及纯化,为后续与此蛋白相关的生物活性测定奠定了物质基础.     

重组人胶原绑定骨形态发生蛋白2在大肠杆菌中的表达、纯化与复性

目的: 利用大肠杆菌表达体系制备带有胶原结合结构域(CBD)的骨形态发生蛋白2(BMP2),研究CBD-BMP2表达、纯化及复性的条件和方法。方法: 将具有胶原结合能力的CBD基因序列克隆入BMP2基因序列的N端,构建重组蛋白表达质粒pet21b/CBD-BMP2,转化入工程性大肠杆菌BL21菌株内;37℃条件下添加诱导剂异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)持续诱导表达;采用Ni-NTA亲和层析柱进行纯化;运用超纯水稀释复性法对纯化后的CBD-BMP2进行复性;0.22 μm微孔滤膜对复性后蛋白除菌,通过除菌前后蛋白浓度比值计算回收率;聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测重组蛋白表达、纯化以及复性;BCA蛋白定量法测定蛋白浓度。结果: 重组质粒pet21b/CBD-BMP2在工程性大肠杆菌中得到充分表达;CBD-BMP2以包涵体形式表达;SDS-PAGE分析,8 mol·L^-1尿素存在条件下目的蛋白溶解于裂解液上清中,经纯化后目的蛋白单体存在于洗脱液B中,单体相对分子质量约为14000;稀释复性后SDS-PAGE分析,相对分子质量14000及28000处可见2条清晰条带,重组蛋白单链成功复性为二聚体结构,相对分子质量约为28000;过滤除菌前后目的蛋白浓度分别为110和80 mg·L^-1,回收率约为73%。结论: 重组CBD-BMP2载体成功转化至大肠杆菌内,CBD-BMP2蛋白得到了高效的表达和复性。建立了利用原核表达体系制备重组CBD-BMP2蛋白的实验方法。     

非融合型重组人白细胞介素-18的纯化及鉴定

目的　获得高纯度的重组人白细胞介素 18(rhIL 18)。方法　采用溶菌酶加超声破菌的方法抽提包涵体 ,以8mol/L尿素溶解包涵体 ,变性条件下以阴离子柱层析进行首步纯化 ,复性后再进行凝胶过滤层析。对纯化的样品进行了SDS PAGE、HPLC、N端氨基酸序列、免疫印迹及生物学活性分析。结果　rhIL 18在大肠杆菌中以不溶性包涵体形式存在 ,所提取的包涵体中重组蛋白纯度可达到 80 %以上 ,包涵体经二步柱层析纯化后 ,HPLC分析纯度达 98%以上 ,SDS PAGE测定其分子质量约 19× 10 3 ,N端 15个氨基酸序列与预期一致 ,生物学活性分析证实纯化的rhIL 18具有诱导人外周血单个核细胞 (PBMC)产生IFN γ的能力。结论　所建立的纯化rhIL 18的方法简便有效 ,为开展rhIL 18的结构活性关系研究及其大规模纯化打下了良好的基础。     

重组人胶原蛋白肽在大肠杆菌中的高效表达

目的:构建含有胶原蛋白基因的原核表达载体pET32a-CP6,并转入大肠杆菌BL21 (DE3)中进行高效表达,为获得大量可溶的胶原蛋白肽提供可靠依据.方法:将重组表达载体pET32a-CP6转化到大肠杆菌BL21中,以IPTG为诱导剂,对温度、接种量、诱导时机、IPTG诱导浓度等各种发酵参数进行优化,筛选高效表达的发...     

重组人胎盘抗凝蛋白变体基因工程表达菌的表达条件优化研究

目的 :探索重组人胎盘抗凝蛋白变体大肠杆菌表达菌株的最适表达条件。方法 :详细研究重组人胎盘抗凝蛋白变体在大肠杆菌中表达时重组质粒稳定性、细菌培养、诱导物IPTG的用量和诱导时间与重组蛋白质表达水平之间的关系。结果 :重组人胎盘抗凝蛋白变体大肠杆菌表达菌株具有非常好的质粒稳定性 ,不易发生质粒丢失现象。诱导剂IPTG量越多 ,最终OD6 0 0 值越低 ;诱导时间长会导致较多的靶蛋白积累 ,OD6 0 0 值与总蛋白成正相关关系。结论 :获得了重组人胎盘抗凝蛋白变体的最适表达条件 ,经过纯化后 ,重组人胎盘抗凝蛋白变体的得率为 40mg·L- 1 。     

重组人白细胞介素-2/ 粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子融合蛋白的纯化及复性研究

目的研究重组人白细胞介素-2/ 粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(IL-2/GM-CSF)融合蛋白纯化及复性的最佳条件。方法常规方法提取包涵体,用本室专利技术提纯,复性后样品经DEAE-Sepharose FF离子交换层析,获得融合蛋白。结果获得具有生物活性的融合蛋白,其纯度达到95%。结论此工艺操作简便,纯化效果好,获得率高。     

Purification and characterization of biologically active recombinant human Eppin expressed in Escherichia coli

Background Eppin （epididymis protease inhibitor） appears to play an important role in primate fertility. However, the function of Eppin and its antibody in men and its relationship with men＇s infertility are poorly studied. To reveal the significance and possibility of detection of anti-Eppin antibody in clinical infertilty cases, we developed an Escherichia coil expression system for the expression of biologically active human Eppin. Methods The human Eppin gene was cloned into PET-28a（＋） vector after induction with 0.5 mmol/L isopropy-β-Dthiogalactoside （IPTG） at 26℃ for 4 hours, and the expressed fusion protein His6-Eppin was purified by Ni2. affinity chromatography. Afterwards, six female 8-week-old Balb/c mice were immunized with purified His6-Eppin for three weeks. Their sera were collected and polyclonal antibodies against His6-Eppin were purified, all of which were further verified by Western-blot and immunofluorescence analysis. Results About 18.33 mg His6-Eppin was obtained from 1-L flask culture. The produced polyclonal antibodies against His6-Eppin recognized the Eppin protein both in human epididymis and in HEK293T cells by over-expression of the recombinant human Eppin. Conclusion The purified His6-Eppin protein has biological activity, which might be a candidate for clinical diagnosis of infertility and development of male immuno-contraceptive agents.     

Expression of mature peptide of human bone morphogenetic protein-2 in Escherichia coli

bonemorphogenetlcprotein-:antI--/eisiveroleduringboneregenerationandrepairaswellasduringvariousstagesofelnbryonaldevelopment['].ThelengthofthecompletecDNAofhumanhonemorphogeneticprotein-2(hBMP-2)is1587hp,whose1188hpopenreadingframeencodesa396aminoacidsproteinwhichconsistsofasignalpeptide,apro--Peptideanda114ahanoacidmaturePeptide.FunctionalhBMP-2waseverexpressedinCOS,CHOandinsectcells,hutnotinE.colt:'.liuXinping['.",InZifan[5',ZhaoMing='jandlinbangetal-':haveexpressedvariedC-tenonalP…     

热休克蛋白CpkB对nrhTNF体外复性的促进作用

目的;探讨嗜热菌热休克蛋白ＣｐｋＢ在体外与新型重组人肿瘤坏死因子蛋白质复性的关系。方法：在原核细胞中表达并纯化ＯｐｋＢ蛋白;将ｎｒｈＴＮＦ在８ｍｏｌ／Ｌ脲中变民生,然后在不同浓度的ＣｐｋＢ存在下进行体外复性,以复性后ｎｒｈＴＮＦ的和活性检测指标进行分析。     

重组人白细胞介素2-绿脓杆菌外毒素融合蛋白的纯化及复性

目的探讨该所发明的新方法对重组人白细胞介素2-绿脓杆菌外毒素(IL2-PE664Glu)融合蛋白进行纯化与复性的效果。方法采用该所发明的新方法提纯包涵体,包涵体复性后,样品经DEAE-SepharoseFF离子交换层析,获得融合蛋白纯品。结果获得的具有生物学活性的融合蛋白纯度达到95%,复性回收率为80%。结论此包涵体分离纯化技术简便、实用,可为中试研究和规模化生产提供基础。     

重组 CARDs TX 融合蛋白的表达纯化与复性

目的:构建 pET28α-CARDs TX 重组质粒,诱导 CARDs TX 融合蛋白表达,并对其进行纯化与复性研究。方法:将 CARDs TX 基因（MPN 372）克隆入 pET28α 载体,经 8 次点突变获得 pET28α-CARDs TX 重组质粒。转化大肠杆菌 BL21,IPTG 诱导表达。利用亲和层析技术纯化蛋白并通过 SDS-PAGE 和 Wetern Blot 检测 CARDs TX 的表达和纯化效果。利用尿素梯度复性法和扩大体积透析法对蛋白进行复性研究。结果:酶切和测序结果证明 pET28α-CARDs TX 重组质粒的 DNA 序列完全正确,在 BL21 中 CARDs TX 融合蛋白可高效表达,并可获得高纯度目的蛋白。利用扩大体积透析法对目的蛋白复性有较好的效果。 结论:成功构建出 pET28α-CARDs TX 重组质粒,且 CARDs TX 可在大肠杆菌中高效表达,并可获得高纯度的目的蛋白,为深入研究 CARDs TX 的生物学特性奠定了基础。     

重组蛋白在大肠杆菌中可溶性表达的策略

重组蛋白技术在许多领域已成为一种必要的工具,但有时表达的目的蛋白却未进行正确的折叠而被蛋白酶降解或聚集形成包涵体.因此,人们在表达不同的目的蛋白时采用了多种方法以期获得具有生物学功能的蛋白质,包括共表达分子伴侣、融合表达、定位表达、改善诱导条件、添加促折叠试剂和选择宿主细胞等.本综述整理了近年来优化蛋白表达的成功经验,从以上方面讨论了如何提高目的蛋白表达的可溶性和促进目的蛋白的正确折叠.     

人骨形成蛋白4成熟肽cDNA的克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的：克隆编码人骨形成蛋白4(hBMP4)成熟肽的cDNA基因,并在大肠杆菌中表达．方法：从人胎盘组织中提取总RNA,以其为模板,采用RT—PCR方法得到编码hBMP4的成熟肽段(hBMP4m)cDNA,克隆入表达载体pDH2中,转化大肠杆菌DH5α,温度诱导表达．结果：获得hBMP4m cDNA基因,成功克隆入温度诱导表达载体pDH2,DNA序列分析证实所插入的hBMP4m cDNA序列与设计预期一致;将获得重组表达质粒pDH2-hBMP4m转化大肠杆菌DH5α中,经温度诱导,目的蛋白占细菌总蛋白的41．5％．结论：采用分子克隆的方法得到编码hBMP4成熟肽段的cDNA,克隆入表达载体,在大肠杆菌中成功获得hBMP4成熟肽的高效表达。     

大肠杆菌表达的人血管内皮细胞生长因子的复性与纯化研究

以包涵体的形式在大肠杆菌中表达人血管内皮细胞生长因子（VEGF121）,采用发酵罐进行工程菌的高密度发酵,得到菌干重46g／L,VEGF121包涵体4．5g／L。包涵体经洗涤、溶解、超滤法复性,得率为81％。复性后的目标蛋白经离子交换色谱及SepharcryS-100凝胶过滤色谱纯化,目标蛋白的纯度达到95％,目标蛋白的总得率31％。采用该工艺制备的VEGF121能刺激人脐静脉血管内皮细胞增殖,具有天然VEGF生物学活性。     

使用磁性亲和载体纯化rhIFNα

目的：合成可用于分离基因重组干扰素－α的α－ｇａｒｏｓｅ－单克隆抗体磁性微球，并建立一套磁性亲和载体分离蛋白质的方法．方法：使用物理包埋法制备磁性ａｇａｒｏｓｅ载体，使用ＣＮＢｒ法将抗体连接在磁性微球上制备磁性亲和载体．结果：通过优化合成条件，确定单抗的合成条件为ＣＮＢｒ活化用量为２００ｇ／Ｌ磁性载体，单抗的最大偶联量为１５．１ｇ／Ｌ磁性载体．使用磁性单抗载体进行一步纯化，纯化后ＩＦＮ－α的比活性为１．０ｘ１０１１ＩＵ／ｇ，电泳后使用考马斯亮兰染色其纯度为８８％，活性回收率７０％．结论：磁性亲和技术是一个简单、快速分离蛋白质的好方法．     

重组人源胰岛素原C肽在大肠杆菌中的克隆、表达与纯化(英文)

目的:构建一种新型表达载体(pEDCC),表达并纯化得到人源胰岛素原C肽。方法:将编码截短的门冬酰胺酶突变体(ansB-C),天然C肽,人IgG1铰链区(hinge),额外的酸敏感二肽(DP)以及富含碱性氨基酸的8肽(KRKRKKSR)的核苷酸序列依次分别插入pET28a载体中,构建表达载体pEDCC。在乳糖的诱导下,融合蛋白ansB-C-hinge-DPKRKRKKSRNGS-GR-C-peptide以包涵体形式高效表达。融合蛋白经洗涤和乙醇分级沉淀纯化后,通过酸水解将PKRKRKKSRNGSGR-C-peptide释放出来。C肽N端14肽用胰蛋白酶切割,通过DE52柱与C-peptide分离。结果:构建的表达载体pEDCC序列正确,融合蛋白经分离纯化得到了高纯度的重组人源胰岛素原C肽。结论:以截短的门冬酰胺酶作为融合伙伴,并以富含碱性氨基酸的8肽调节等电点是一种生产重组人源胰岛素原C肽的有效方法。     

常压色谱分离纯化重组人白细胞介素2

作采用７ｍｏｌ／Ｌ盐酸胍直接裂解重组人白细胞介素２（ｒｈＩＬ－２）工程菌，溶解包含体蛋白，利用硫水色谱、凝胶过滤、离子交换分离纯化ｒｈＩＬ－２，各步收率分别为１４０％，８５％，７０％。终产品比活性为１．９×１０＾６Ｕ／ｍｇ，经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ鉴定为单一条带，得到高比活高纯度的ｒｈＩＬ－２。本方法利用疏水色谱既能分离又能促进ｒｈＩＬ－２复性的特点，克服了包含体蛋白较难溶解双易聚合的缺点，提出了ｒｈ     

重组人生长激素作用下成骨细胞细胞周期及细胞骨架改变的体外研究

目的:观察重组人生长激素(rh-gh )对体外成骨细胞(OB)细胞周期及细胞骨架F-actin的影响. 方法:用浓度为10和200 μg/L的重组人生长激素加入大鼠OB培养体系,观察对大鼠OB的细胞周期及细胞骨架的影响. 结果:定量分析表明,在rh-gh 作用下,成骨细胞S期、G2/M期细胞百分比增加,OB的绿色荧光强度、红色荧光强度无显著变化. F-actin纤维呈束状平行排列,荧光染色强,分布均匀. 结论:重组人生长激素对OB的合成代谢有直接影响,但对细胞骨架无显著影响.     

Effect of recombinant human endostatin on endometriosis in mice

Background Direct and indirect evidences have suggested that angiogenesis is a prerequisite for the development of endometriosis. Aiming at offering experimental evidences for anti-angiogenesis therapy, we transplanted the eutopic endometrium from patient with endometriosis into the severe combined immunodeficiency disease (SCID) mice, to evaluate the effect of the endostatin on the growth and angiogenesis of the established endometriosis lesions in SCID mice model.Methods Eutopic endometrium of women with endometriosis was transplanted into the SCID mice. The mice were randomized into treatment (n=10) and control groups (n=10). Two weeks after the implantation of endometrium fragment, the treatment group was injected with recombinant human endostatin YH-16 into the peritoneal cavity (2 mg·kg(-1)·d(-1)), whereas the control group received equivalent volume of PBS (200 µl/d). The volume of endometriotic lesions in SCID mice was measured every three days, and all the treatment lasted for 14 days. Immunohistochemistry was used to determine microvessel density (MVD) and the expression of VEGF. The results were analyzed by t test and χ(2) test to value the treating effect. Results Compared with the control group, growth of endometriosis lesion was reduced in the mice treated with YH-16. Statistically significant differences in the volume and weight of the ectopic lesions were observed between the treatment and the control groups (P<0.05). Microscopical examination showed that after being treated with YH-16, the volume of the endometrial tissues decreased, the glands depauperated, and the glandular epithelium partially degenerated. Necrotic debris was observed in the endometrial stroma. MVD and expression of VEGF in the treatment group were significantly lower than those in the control group (P<0.05). Conclusions Recombinant human endostatin affects the maintenance and growth of endometriotic tissues by inhibiting angiogenesis and reducing the expression of VEGF in ectopic lesion. The angiostatic agent may be promising as a therapy for endometriosis.     

重组人血管内皮抑制素对人脑胶质瘤细胞生长的抑制作用

目的探讨重组人血管内皮抑制素对人脑胶质瘤细胞生长的抑制作用。方法体外培养人脑胶质瘤细胞,设立对照组与重组人血管内皮抑制素实验组（终浓度分别为50、100、150 ng/ml）,采用MTT法来判定该抑制因子对人脑胶质瘤细胞有无抑制作用。结果对照组OD值为0.302±0.012,实验组的OD值分别为0.284±0.006,0.218±0.014,0.175±0.012,P值均〈0.05。结论重组人血管内皮抑制素能够抑制人脑胶质瘤细胞的增殖且呈剂量依赖性。