多药耐药基因多顺反子逆转录病毒载体的构建及转染人脐血CD34+细胞的研究

临床上对肿瘤的治疗多采用联合化疗 ,因此将不同耐药谱系的多个基因导入造血干 /祖细胞可对该类细胞提供多重保护 ,对防止骨髓抑制 ,提高化疗药物剂量 ,增强疗效 ,具有重要意义[1,2 ] 。六氧甲基鸟嘌呤ＤＮＡ甲基转移酶 (ＭＧＭＴ)是决定细胞对亚硝基脲药物耐受性的分子基础。我们从人肝组织克隆了ＭＧＭＴ基因 ,采用新近发展起来的多基因表达技术[3] ,将ＭＧＭＴ与ＭＤＲ1基因同时构建在含内核糖体进入位点 (ＩＲＥＳ)多顺反子逆转录病毒表达载体上 ,转导脐血ＣＤ34 细胞 ,进行 2种不同耐药基因的表达研究。一、材料和方法1 主要试剂 :ＤＮ…     

人多药耐药基因1在CHO细胞中的表达及功能研究

目的:构建人多药耐药基因(MDR1)的真核表达载体,转染CHO细胞,研究MDR1基因在真核细胞中的表达及功能。方法:将MDR1全长基因克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+),利用阳离子脂质体转染CHO细胞,RT-PCR检测MDR1转染阳性细胞,并用G418筛选稳定表达MDR1基因的细胞,通过测定细胞对Rh123的外排作用以及对阿霉素的耐受性确定MDR1基因在正常细胞中的功能。结果:酶切鉴定和测序结果证明构建的重组表达载体pcDNA-MDR1序列正确。RT-PCR分析以及荧光显微镜观察结果表明:该重组表达载体已在CHO细胞中有效转录并稳定表达。Rh123外排和MTT药敏实验结果显示:转染pcDNA-MDR1的CHO细胞对Rh123外排作用显著高于未转染的CHO细胞,并且转染后的CHO细胞对阿霉素的耐药性也有显著提高。结论:成功构建了稳定表达MDR1并具有多药耐药功能的细胞株,有望成为多药耐药性药物研究的细胞模型。     

Endostatin基因转染人脐带血CD34+ 造血干细胞的实验研究

目的检测人endostatin(血管内皮抑制素)基因转染人脐带血CD34+造血干细胞后的表达和分泌情况.方法电穿孔法将Plncx/endo转染包装细胞PA317,G418筛选阳性克隆后用NIH3T3细胞测定病毒的滴度,RT-PCR法测定耐药的包装细胞中是否存在endostatin基因.取新鲜人脐带血40～80 ml,用Ficoll分离出单个核细胞,再用免疫磁珠(MiniMACS)进一步分离出CD34+造血干细胞,流式细胞仪(FCM)检测CD34+造血干细胞的浓度和纯度.将病毒上清与人脐带血CD34+造血干细胞共同培养72 h,应用RT-PCR及Western blot检测人endostatin的表达和分泌.结果 Plncx/endo质粒克隆扩增后,经酶切鉴定有endostatin基因存在.RT-PCR证实,转染人endostatin基因的PA317/endo、NIH3T3/endo细胞中存在人endostatin特异性片段,病毒滴度为1.3×105 cfu·ml-1.FCM检测,CD34+干细胞在脐血中的初始含量＜5%,经Mini-MACS分离纯化后纯度超过90%.从1×108的界面细胞平均可以分离获得(5～20)×105CD34+个干细胞.RT-PCR证实,脐带血CD34+/endo造血干细胞基因组中含有人550 bp endostatin特异性片段, Western blot分析显示人endostatin在转染细胞中获得稳定表达和分泌.结论逆转录病毒可以介导endostatin基因转导人脐带血CD34+造血干细胞并表达endostatin蛋白.     

逆病毒载体介导的双耐药基因在小鼠骨髓细胞的转移

目的　增强造血细胞对化疗药物的耐受性 ,探讨逆转录病毒介导的基因转移效率及耐药基因导入在造血细胞保护性基因治疗中的作用。方法　应用电穿孔基因转移法将逆转录病毒载体G1Na MGMT IRES MDR1导入病毒包装细胞GP E86及PA3 17,以VCR加压筛选后的阳性克隆上清感染小鼠骨髓细胞 ,应用PCR、Southernblot及流式细胞仪检测耐药基因MGMT及MDR1在细胞中的转移与表达。结果　加压筛选及乒乓效应使病毒滴度由 ( 0 .2～ 7.6)× 10 4CFU/mL提高到 ( 1.9～ 5 .7)× 10 6 CFU/mL ,从DNA、RNA及蛋白水平上分别证实了双耐药基因在小鼠骨髓细胞中获得了有效转移和表达 ,而转基因后的小鼠骨髓细胞对VCR、高三尖杉酯碱和BCNU的耐药性比未转导细胞分别提高了 5 .7、5 .0和 8.5倍。结论　双耐药基因成功导入小鼠骨髓细胞为肿瘤基因治疗的临床研究提供了实验基础。     

多药耐药基因转染脐血造血干祖细胞在白血病鼠在化疗中骨髓保护作用研究

目的 :白血病化疗失败的主要原因之一是骨髓抑制(ｍｙｅｌｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ)。多药耐药 (ＭＤＲＩ)基因编码的Ｐ糖蛋白(Ｐ ｇｐ)能将多种化疗药物排出瘤细胞外 ,瘤细胞产生耐药使疗效降低 ,骨髓细胞Ｐ ｇｐ表达极低甚至不表达 ,这是骨髓造血细胞对化疗药敏感的主要原因 ,致使化疗中骨髓受到抑制而导致化疗失败。为此 ,我们将脐血干祖细胞移植和基因转染技术有机地结合 ,将带有ＭＤＲＩ基因的脐血干细胞输入白血病鼠体内 ,期望在增大化疗剂量、取得显著疗效的同时保护造血干细胞。方法和结果 :采用含有ＭＤＲＩ基因表达质粒 ｐＨａＭ…     

多药耐药基因转染骨髓单个核细胞移植联合化疗治疗乳腺癌的实验研究

目的研究外源性人多药耐药基因(human multidrug resistance gene 1,hMDR1)转染骨髓单个核细胞(mono-nuclear cells,MNCs)移植联合超剂量表阿霉素化疗在4T1乳腺癌治疗中的骨髓保护和治疗作用。方法用携带目的基因hMDR1和绿色荧光蛋白(green fluorescence protein,GFP)报告基因的复制缺陷型重组腺病毒(rAd-hMDR1-GFP)转染原代培养的MNCs以获取hMDR1基因修饰的MNCs(MNCs-rAd-hMDR1-GFP),将修饰后的MNCs移植到4T1乳腺癌模型体内,在表阿霉素超剂量化疗中观察骨髓造血功能的保护和肿瘤的治疗效果。结果 hMDR1基因成功转入小鼠骨髓单个核细胞,体外转染率达26.26%;转染细胞移植后能定植于受体骨髓中并功能性表达。在超剂量化疗中,hMDR1基因能有效保护受体骨髓的造血功能,荷瘤动物能耐受3倍剂量表阿霉素化疗,外周血白细胞数能维持在(5.7±0.6)×109/L;同时超剂量化疗能迅速杀灭肿瘤细胞,使荷瘤动物存活时间明显延长(P<0.05),治愈率明显提高(P<0.05)。结论 hMDR1基因转染骨髓造血细胞移植能明显提高受体骨髓对化疗药物的耐受性,联合超剂量化疗能快速、有效的杀灭肿瘤细胞,提高恶性肿瘤的治愈率。     

VIP对人脐血CD34+细胞向肝系分化的影响初探

目的探讨血管活性肠肽(VIP)对人脐血造血干细胞(HSC)向肝系分化的影响.方法采用免疫磁分选技术纯化人脐血CD34+细胞,流式细胞术鉴定纯度;VIP和混合因子(包括VIP、EGF、HGF)作用CD34+细胞后,酶联免疫化学法测定CD34+细胞及上清AFP水平,免疫细胞化学法检测CD34+细胞上肝系标志AFP、白蛋白(ALB)、细胞角质素19(CK-19)的表达,Western blot方法检测CD34+细胞上ALB表达;巢式RT-PCR方法检测CD34+细胞上AFP、ALB的mRNA表达,随机选送ALB产物测序.结果免疫组化结果显示CD34+细胞上不表达CK-19蛋白,但有AFP和ALB蛋白表达;VIP作用CD34+细胞14 d后, 细胞内的AFP质量浓度(165.00±8.51 pg/mL)较对照组(270.00±11.37 pg/mL)显著下降(P<0.05).Western blot显示VIP作用后CD34+细胞内ALB蛋白表达有减弱趋势.人脐血CD34+细胞表达了AFP mRNA和ALB mRNA,随机选取ALB产物测序与GeneBank中ALB基因序列完全相同.结论人脐血CD34+细胞表达肝系标志AFP、ALB,虽未见CK-19表达,但仍提示造血干细胞有向肝细胞横向分化的可能.VIP降低了人脐血CD34+细胞AFP及ALB表达.这种对造血干细胞内胚层细胞标志物表达的抑制,提示VIP对HSC向肝细胞横向分化具有抑制作用.     

人脐带血CD34+细胞的提取及慢病毒载体转染的初步研究

目的探讨人脐带血CD34 细胞提取以及慢病毒转染的方法。方法脐带血20袋,采用直接梯度离心法,或6%羟乙基淀粉沉淀加梯度离心法收集单个核细胞,检测CD34 阳性率,经MACS磁珠分离获得CD34 细胞,分为完全培养基组、增强感染剂(ENis)组,过夜培养,每组按MOI 1∶1、1∶10、1∶50加入带GFP标记的慢病毒载体进行转染,每小组再分组分别加入0、1、5ng/mL polybrene,转染后36~48h,3、5、7d分别在荧光显微镜下观察转染情况。结果直接梯度法获得的单个核细胞中红细胞含量高,CD34 阳性率为0.8%vs 1.2%,MACS分离获得CD34 细胞阳性率达84.6%以上。转染后观察增强感染剂组感染率低于完全培养基组,以MOI 1∶50组荧光最强,但细胞死亡较多,加入5ng/mL polybrene组细胞大片快速裂解死亡,荧光持续时间短,以MOI 1∶10结合1ng/mL polybrene组阳性率高且荧光表达持续时间长。结论MOI 1∶10结合1ng/mL polybrene可能是慢病毒转染较理想的方法。     

反向MDR1及TNF-α重组表达载体的构建及其在乳腺癌耐药细胞中的表达

目的克隆MDR1及TNF-α基因cDNA,构建反向pEGFP-MDR1重组表达载体和pDsRed2-TNF-α重组表达载体,并在乳腺癌耐药细胞株MCF-7/ADR中进行表达.方法应用RT-PCR和DNA重组技术构建反向绿色荧光蛋白pEGFP-MDR1融合蛋白表达载体和红色荧光蛋白pDsRed2-TNF-α融合蛋白表达载体,经脂质体分别和同时导入乳腺癌耐药细胞株MCF-7/ADR中进行表达,应用荧光显微镜直接观察融合蛋白的表达情况,G418筛选阳性克隆.结果转染了反向pEGFP-MDR1载体的MCF-7/ADR细胞在胞浆和胞核均可见到绿色荧光.而转染了pDsRed2-TNF-α载体的MCF-7/ADR细胞在胞浆和胞核均可见到红色荧光.而同时转染了反向pEGFP-MDR1载体和pDsRed2-TNF-α载体的细胞胞浆和胞核均可见到红色及绿色荧光.结论反向pEGFP-MDR1融合蛋白和pDsRed2-TNF-α融合蛋白能在乳腺癌耐药细胞MCF-7/ADR中分别及同时获得表达,为进一步研究基因治疗联同免疫治疗逆转乳腺癌耐药建立了很好的基础.     

多药耐药肝癌细胞模型的建立

目的:构建人多药耐药基因(MDR1)的肝脏特异性真核表达载体,转染HepG2细胞,建立多药耐药肝癌模型。方法:将小鼠清蛋白启动子序列(pALB)克隆到已成功构建的MDR1基因真核表达载体pcDNA-MDR1中,替换其中的CMV启动子序列,构建MDR1肝脏特异性真核表达载体pcDNA-ALBMDR1,利用KeyGenTransⅢ阳离子转染试剂转染HepG2细胞,用G418筛选稳定表达MDR1基因的细胞,并用RT-PCR方法检测MDR1基因的表达,通过测定细胞对阿霉素的耐受性以及阿霉素与多药耐药逆转剂维拉帕米联合用药情况确定MDR1基因在肝脏细胞中的功能。结果:酶切鉴定和测序结果证明构建的重组表达载体pcDNA-ALBMDR1序列正确。RT-PCR分析以及荧光显微镜观察结果表明:该表达载体已在HepG2细胞中有效转录并稳定表达。MTT药敏实验结果显示:转染pcDNA-ALBMDR1质粒的HepG2细胞对阿霉素的耐药性有显著提高,同时维拉帕米能够显著提高转染细胞对阿霉素的敏感性。结论:成功构建了稳定表达MDR1并具有多药耐药特性的肝癌细胞模型,该模型的建立将有助于多药耐药逆转剂的筛选与研究。     

CD34~+脐血造血干细胞的体外培养及其生物学特性研究

目的:建立稳定的CD34+脐血造血干细胞(CD34+UHSC)的体外分离、培养扩增体系,并研究其生物学特性。方法:密度梯度离心及免疫磁珠法从脐血中分离CD34+UH-SC,加入细胞因子SCF、IL-3和IL-6进行体外培养扩增,观察细胞形态及其生长特性。应用流式细胞仪测定细胞周期及其CD34分子的表达,研究其增殖、生长和分化特性。以RT-PCR法检测干细胞高表达基因ABCG2的转录表达。结果:在体外培养条件下,CD34+UHSC悬浮生长,约1周后易形成克隆球,增殖旺盛,呈现指数生长期;细胞增殖周期随体外培养时间延长而逐渐趋缓;CD34+UHSC表面标志亦随体外培养时间延长而表达下降,同时ABCG2基因的表达亦逐步下调。结论:体外获得纯化的CD34+UHSC,生长稳定、增殖能力强,但随体外培养时间的延长,CD34+分子标志逐步丢失,提示在增殖旺盛的指数生长期7～21d内最适用于各项相关实验研究。     

人脐血CD34~+细胞在NOD/SCID小鼠上有效重建造血系统

目的探讨人脐血CD34+造血干细胞在非肥胖糖尿病/重症联合免疫缺陷(no obese diabetic/severecombined Immunodeficiency,NOD/SCID)小鼠模型上造血重建的作用。方法利用密度梯度离心法,从新鲜脐血中分离出单个核细胞,利用免疫磁珠分选法筛选CD34+造血干细胞,经尾静脉输注入经亚致死剂量照射后的NOD/SCID小鼠体内,移植后3、7、10、14 d分别用断尾法取小鼠外周血,血常规计数外周血动态变化情况;移植后4、6、8、10周,取其外周血,运用PCR法检测外周血中人特异性Alu基因的表达情况。结果免疫磁珠分选得到的CD34+细胞浓度达91.2%,照射后小鼠骨髓腔内有核细胞和巨细胞数量明显减少或消失,达到清髓目的。移植后第3天移植组小鼠外周血各系细胞均明显低于正常组(P<0.01),移植后第7天,移植组小鼠外周血象开始恢复,明显高于阴性对照组[白细胞:(3.90±0.53)×109/L vs(1.30±0.18)×109/L,血红蛋:(139.8±5.0)g/L vs(79.8±11.0)g/L,白血小板:(253.0±17.5)×109/L vs(52.0±6.9)×109/L,(P<0.01)],移植后第10天,移植组小鼠外周血象恢复到辐照前水平,与正常组无差别。移植4周后,PCR方法在小鼠外周血中可检测到人特异Alu基因序列,未移植组小鼠照射后2周内全部死亡。结论经照射后的NOD/SCID小鼠通过人脐血CD34+细胞植入可建立起人鼠嵌合模型。NOD/SCID小鼠经照射后,不破坏骨髓造血微环境及造血基质,可用于异基因细胞移植模型。人脐血CD34+细胞移植入NOD/SCID小鼠,其造血系统能有效重建。     

成人骨髓间充质干细胞对脐血CD34+细胞的体外扩增作用

目的: 探讨骨髓间充质干细胞(MSCS)对脐血CD34 细胞体外扩增作用. 方法: 分离培养成人MSCS作为滋养层,联合SCF, IL-11和GM-CSF分别组成对脐血CD34 细胞的不同扩增体系,培养3 wk后观察脐血有核细胞、CFCs以及CD34 细胞扩增倍数的变化. 结果: MSCS联合细胞因子组较其他组培养体系对有核细胞总数、CFCs含量及CD34 细胞含量均具有明显的扩增作用,分别扩增了114.2±2.4, 40.5±8.6, 11.3±0.4 倍. 结论: 成人MSCS协同其他细胞因子可增强脐血CD34 细胞的体外扩增作用.     

生长抑素对人脐血CD34+细胞增殖能力的影响

目的 探索生长抑素(SST)对造血干/祖细胞增殖能力的影响以及可能机制.方法 采用免疫磁珠分选技术纯化人脐血CD34+细胞;SST孵育人CD34+细胞后,体外集落形成、扩增培养了解细胞增殖;ELISA测定细胞内外TNF-α、TGF-β水平;RT-PCR分析其受体亚型.结果 在1×10-5～1×10-10mol/L浓度范围内,SST抑制人CD34+细胞集落形成及扩增倍数,其细胞集落形成抑制与SST浓度呈正相关(r=0.903,P＜0.01).SST使CD34+细胞内、外TNF-α及TGF-β1浓度显著增加(P＜0.05);人脐血CD34+细胞表达SST-3型受体.结论 SST通过人脐血CD34+细胞上SST-3型受体介导,提高造血抑制因子TNF-α、TGF-β水平,抑制人CD34+细胞的增殖,维持其干细胞特性.     

人脐血CD34~+细胞在NOD/SCID小鼠体内重建体液免疫的实验研究

目的探讨人脐血CD34+造血干细胞(HSC)在NOD/SCID小鼠模型体内体液免疫功能重建的作用。方法从新鲜脐血中分离出单个核细胞(MNC),利用免疫磁珠分选法筛选CD34+造血干细胞,经尾静脉输注入经亚致死剂量照射的NOD/SCID小鼠体内,移植后4、6、8、10周分批处死存活的小鼠,取其脾脏和外周血,分别进行细胞表型分析、体液免疫分析,监测小鼠体液免疫功能重建情况。结果照射2周后,阴性对照组小鼠全部死亡,6周后移植组小鼠存活率为37.5%,空白对照组小鼠存活率为100%。移植4、6、8、10周移植组外周血人CD45+细胞表达(%)分别为4.87±1.23、9.22±2.07、12.34±2.38、8.14±2.36,CD19+B淋巴细胞表达(%)分别为1.07±0.50、2.17±0.95、3.34±0.90、1.67±0.90。移植后10周,在移植组小鼠脾脏可见CD19+B淋巴细胞分布。结论经照射后的NOD/SCID小鼠通过人脐血CD34+细胞植入可建立起人鼠嵌合免疫模型。缺少相应细胞因子刺激,CD34+细胞分化能力随时间减弱。     

脐带间充质干细胞对脐血CD_(34)~+祖细胞免疫反应的影响

目的 探讨脐带来源的间充质干细胞(UC-MSCs)是否能有效抑制脐血CD_(34)~+祖细胞的免疫反应,影响反应过程中免疫调节细胞因子的分泌.方法 从脐带中分离、培养MSCs,观察其生长形态,流式细胞术检测表面标志;将不同数量的UC-MSCs加入脐血CD_(34)~+祖细胞、外周血单个核细胞(PBMC)共培养体系中作为实验组,不加UC-MSCs的CD_(34)~+祖细胞、PBMC共培养体系为阴性对照;另设用Tramwell将UC-MSCs和脐血CD_(34)~+祖细胞、外周血单个核细胞共培养体系分隔培养,分别收集各组上清液,ELISA检测IFN-γ和IL-10水平.结果 UC-MSCs高表达CD_(105)、CD_(90)、CD_(29)、CD_(49);不表达CD_(40)、CD_(80)、CD_(86)、HLA-DR;加UC-MSCs组与阴性对照组相比,IFN-γ的分泌量减少(19.30±0.78) vs(27.00±1.11),(P＜0.05);IL-10的分泌量增多(50.28±1.29)、vs(31.68±3.08),(P＜0.05).而且具有数量依赖性;Transwell分隔培养组与阴性对照组相比,IFN-γ的分泌量减少(18.33±0.475)vs(27.00±1.11),(P＜0.05);IL-10的分泌量增多(48.47±1.18)vs(31.68±3.085,(P＜0.05);与接触培养组相比,IFN-γ的分泌量增多(18.33±0.47)vs(7.14±0.13),(P＜0.05),IL-10的分泌量减少(85.19±2.36)vs(48.47±1.18),(P＜0.05).结论 UC-MSCs能抑制脐血CD_(34)~+祖细胞的免疫反应中IFN-γ的分泌,同时促进IL-10分泌,并且这种作用部分依赖于细胞间的相互接触.UC-MSCs和CD_(34)~+祖细胞共移植可作为干细胞移植治疗缺血性心肌病的有效方式.     

Effect of Angiotensin Ⅱ on Cord Blood CD34^＋ Cells Expansion in vitro

Summary In order to investigate the influence of angiotensin II on hematopoietic system, CD34⁺ cells in cord blood were purified, and the effects of angiotensin II in combination with various cytokines on their growth and differentiation were studied by cell culturein vitro. It was found that angiotensin II in suspending medium could stimulate both BFU-E and CFU-GM expansion. The number of BFU-E and CFU-GM was increased with the increases of angiotensin II concentrations during a certain range. In addition, the expansion fold of CFU-GM was increased from 2.3±0.8 times to 7.8±2.3 times when angiotensin II was added in the presence of SCF+G-CSF+GM-CSF+IL-3 cytokines mixture. Similarly, the expansion fold of BFU-E was increased from 3.1±1.8 times to 9.2±2.3 times with angiotensin II in the presence of SCF+EPO+TPO+IL-3. In the semi-solid medium, angiotensin II could stimulate CFU-GM expansion but had no effect on the growth of BFU-E. In conclusion, angiotensin II had some etimulating effects on cord blood hematopoietic progenitors expansionin vitro in the presence of other cytokines. PENG Cheng, female, born in 1978, Resident