汉滩病毒核蛋白在大肠杆菌中高效表达

提高汉滩病毒核蛋白的表达量，进一步研究核蛋白的功能，并利用其建立ＨＦＲＳ的血清学诊断方法。利用已有的含ＰＲＰＬ启动子的汉滩病毒核蛋白编码区的表达载体－Ｓ２２，通过酶切和连接的方法，将汉滩病毒Ｓ片段核蛋白的编码区基因插入融合蛋白表达载体ｐＧＥＸ－４Ｔ－１和ＧＳＴ基因的３’末端，构建了一种表达核蛋白的融合质粒－ｐＴＨａｎＳ。结果；经薄层扫描仪扫描，ｐＴＨａｎＳ核蛋白的表达量占细胞总蛋白量的３２％。并对     

汉坦病毒感染体外诱导VeroE6细胞热休克蛋白的表达

目的 研究汉坦病毒（HTV）感染后对细胞应激基因表达的影响。方法 用HTV感染其敏感细胞株VeroE6细胞,用Western印迹杂交、RNA斑点杂交及原位杂交分别分析热休克蛋白（HSP）的表达及编码HSP的mRNA水平的变化。结果 病毒感染后细胞内HSP70及热休克蛋白mRNA水平均有增高,而HSP65及HSP27的表达则无明显改变。结论 HTYV感染可以直接诱导HSP70的高表达,可能在保护细胞免受病毒感染损伤方面具有一定意义。     

人热休克蛋白70基因在大肠杆菌中的表达及纯化

目的:构建人热休克蛋白70(HSP70)的原核表达载体,诱导其表达并纯化.方法:应用PCR技术从人胆管癌组织中扩增出HSP 70基因片段,经T-A克隆连接到末端经平滑处理后的pMD18-T Simple质粒并测序.利用双酶切技术构建重组原核表达载体pGEX-4T-1-HSP 70,并转化大肠杆菌JM 109,经IPTG诱导后表达得到HSP70融合蛋白.应用Glutathione-Sepharose4B亲和层析柱提纯融合蛋白,用生物素化凝血酶分离并纯化目的蛋白,最后行Wsetern blot鉴定.结果:PCR扩增结果与预计目的基因大小一致;序列分析与GeneBank中收录完全一致;重组表达载体pGEX-4T-1-HSP 70构建成功;Western blot结果显示目的蛋白可以与兔抗人的HSP70单克隆抗体特异性结合.结论:HSP 70编码序列已经成功克隆至原核表达载体pGEX-4T-1,并在大肠杆菌JM 109中获得表达.     

50℃热疗对肿瘤细胞热休克蛋白70表达作用的实验研究

目的观察50℃时不同热疗时间对体外培养各种肿瘤细胞热休克蛋白(heat shock protein,HSP)表达的影响。方法①选择4种不同的肿瘤细胞株:慢性髓系白血病敏感型细胞株(K562/S细胞)、人胃癌AGS细胞株(AGS细胞)、BALB/c小鼠来源的结肠癌细胞CT-26株(CT-26细胞)、乳腺癌药物敏感细胞株MCF(MCF细胞)。②选取对数生长期的各肿瘤细胞制成细胞爬片,将细胞爬片分为实验组和对照组。③实验组:将爬片水浴加热各时间段(5分钟、10分钟、20分钟、30分钟、50分钟),后置于37℃、5%CO2的培养箱中继续培养24小时。对照组:将各细胞爬片37℃水浴放置各时间段。免疫组织化学法(immuno-histochemistry,IH)检测热疗后各肿瘤细胞HSP70的表达情况。结果 IH发现,热疗后HSP70的表达量明显提高,在加热到20分钟时各肿瘤细胞中HSP-70强阳性表达,但在加热30分钟后随着细胞大量坏死,HSP-70阳性表达逐渐减弱,在50分钟时HSP-70阳性表达基本消失。结论 HSP70的阳性表达率随时间的延长而提高,直至细胞死亡而停止表达。     

热休克预处理诱导HSP70蛋白表达减轻神经细胞的缺血损伤

目的 :研究热休克预处理对脑缺血再灌后热休克蛋白 70 (HSP70 )的表达影响及对缺血神经细胞损伤的保护作用。方法 :采用沙鼠短暂前脑缺血再灌损伤模型 ,光镜观察缺血再灌后神经细胞损伤情况 ,免疫组化方法检测脑缺血后不同时期额叶HSP70蛋白表达。结果 :沙鼠脑缺血后HSP70蛋白仅在再灌后 1d有少量表达 (P <0 .0 1) ;缺血神经细胞在再灌后第 7d大多出现损伤改变 ;热休克预处理能增加沙鼠脑缺血再灌后各期HSP70蛋白表达 (P <0 .0 1) ,明显减轻缺血神经细胞损伤 (P <0 .0 1)。结论 :热休克预处理能通过增加HSP70蛋白表达 ,减少缺血神经细胞损伤。     

人热休克蛋白70D的基因克隆、表达及蛋白纯化

目的：研究热休克蛋白70D(heat shock protein 70D，HSP70D)的基因克隆、重组表达及纯化。方法：采用RT-PCR方法从HeLa细胞中克隆HSP70D全长编码区cDNA序列，构建原核表达载体pET24a（ ）-HSP70D，经过DNA序列测定证实共序列正确。完成基因工程人HSP70D的高表达工程菌的筛选后，对其发酵、蛋白表达条件及重组蛋白的纯化条件进行优化。结果：重组表达载体经序列测定及酶切鉴定与理论推测结果相符，高表达工程菌经优化表达条件后rhHSP70D的表达量可占菌体总蛋白的20％以上。经过低浓度乙醇沉淀、DEAE阴离子交换、疏水柱层及S200凝胶过滤柱后，获得了纯度大于95％的rhHSP70D。结论：本研究为进一步开展以HSP70D为基础的肿瘤免疫治疗研究提供了实验基础。     

热休克蛋白70-Ⅱ型单纯疱疹病毒糖蛋白D DNA疫苗的构建及表达

目的：针对Ⅱ型单纯疱疹病毒（HSV-2）包膜糖蛋白D（gD）,以热休克蛋白70（Hsp70）为载体,构建pVAX-Hsp70-HSV2gD DNA疫苗。方法：将Hsp70和HSV-2gD蛋白的基因分别克隆至真核表达载体pVAX,构建成重组质粒pVAX-Hsp70-gD并测序鉴定。重组质粒pVAX-Hsp70-gD转染COS-7细胞,用免疫组化、SDS-PAGE和West-ern blotting方法鉴定重组质粒的表达情况。结果：测序证实重组质粒序列正确,表达产物的SDS-PAGE分析发现,在相对分子量为92 000处有外源蛋白表达,与预期蛋白带一致。免疫组化方法和Western blotting也证明,构建的重组质粒能在COS-7细胞内表达。pVAX-Hsp70-HSV2gD组核酸疫苗免疫的小鼠,其脾淋巴细胞培养上清中γ-干扰素的水平高于其他组（P〈0.05）。结论：成功构建了pVAX-Hsp70-HSV2gD DNA疫苗,为其进一步的研究打下了基础。     

Expression of Hantaan virus 26 kD fragment of nucleocapsid protein in insect cells and prelimimary study on its immunogenicity

Objective: To express the 26 kD fragment of Hantaan virus nucleocapsid protein that contains the major an-tigenic epitopes in insect cells, and make a preliminary analysis of its immunological characteristics. Methods: The re-combinant baculovirus bat-S0. 7 with the 700 bp fragment of S gene 5‘ terminal of Hantaan virus was constructed, and the anfigenicity of the expression product was tested. Mice were injected with Sf9 cells infected by the recombinant bac-ulovirus. The humoral and cellular immunological effects were identified by indirectassay, micro-cell culture neutralization test and T lymphocytes stimulation test. Results: Immunized by bac-S0. 7 infecting insect cells, specific antibody with the highest titer of 1:1 600 was observed. The stimulation indexes of splenocytes of immu-nized mice to nucleocapsid protein of Hantaan virus was higher than the negative control. Conclusion: The expression product of SO. 7 gene fragment in insect cells is immunogenic.     

人HSC70基因真核表达载体的构建和表达

目的构建HSC70（HSC）真核表达质粒，并在HepG2细胞中表达。方法采用RT—RCR方法从正常人肝细胞系QZE中得到HSC70的cDNA序列，然后克隆入pcDNA^TM3．1／V5-His^A载体，构建重组质粒pcDNA-HSC70；经酶切和测序鉴定后，将pcDNA-HSC70体外转染HepG2细胞系，瞬时表达带有His标签的HSC70融合蛋白；并通过免疫细胞化学方法检测蛋白表达情况。结果RT—PCR扩增到1960bp的HSC70 cDNA片断，经测序分析与GenBank中已知序列一致；重组质粒pcDNA—HSC70转染后的HepG2细胞中，可检测到瞬时表达的HSC70-His融合蛋白。结论成功构建重组质粒pcDNA—HSC70，并可以在真核细胞HepG2中瞬时表达。     

急性高眼压条件下大鼠视网膜节细胞热休克蛋白70的表达

目的 :通过对急性高眼压条件下大鼠视网膜节细胞(RGCs)热休克蛋白 70 (HSP70 )表达变化的分析 ,初步探讨热休克蛋白在高眼压导致视网膜节细胞缺血时的保护作用 .方法 :Wistar大鼠 2 1只一侧眼球在维持 7.98kPa(1mmHg=0 .133kPa)前房压力持续灌注 2h后 ,然后降低眼内压恢复视网膜血液再灌注 ,根据再灌注时间随机分为 0 ,2 ,4 ,8,2 4和4 8h组 ,对照组行前房穿刺 .采用HE染色观察节细胞密度变化情况 ,采用免疫组化方法和图像分析研究视网膜节细胞热休克 70表达及其变化情况 .结果 :再灌注 4 8h组节细胞密度 (3.2 2± 1.6 4个 / 10 0 μm)较其他各组均低 (P <0 .0 5 ) ,对照组和再灌注不同时间后大鼠视网膜节细胞层HSP70表达灰度值之间差异有显著性 ,2 4h组灰度值 (14 8.35 8± 8.0 5 0 )较其他各组低 (P <0 .0 5 ) .结论 :HSP70的表达与缺血再灌注时间关系密切 ,HSP70在视网膜节细胞损伤与防护环节中可能起到重要作用     

热休克蛋白70对骨骼肌细胞纤维类型分化的影响

目的：探讨高表达热休克蛋白70（heat shock protein 70,Hsp70）对骨骼肌细胞（C2C12细胞）纤维类型分化的影响。方法：通过构建重组pTRE2 hyg-Hsp70质粒稳定转染C2 C12细胞系,建立Hsp70高表达的C2C12细胞系。经过诱导分化形成骨骼肌纤维,观察不同时间点（0、3、7 d）C2C12细胞的分化情况,并检测骨骼肌类型标志肌球蛋白重链（ myosin heavy chain ,MHC）的表达情况。结果：与对照组相比,高表达Hsp70的C2C12细胞系分化后的3、7 d,MHCⅠmRNA及蛋白的表达明显增高（P＜0．05）,而在分化后7 d,MHCⅡb mRNA及蛋白的表达明显下降（ P＜0．05）。结论：高表达Hsp70的骨骼肌细胞C2 C12可以诱导MHCⅠ的表达,促进骨骼肌细胞向Ⅰ型肌纤维转化。     

汉滩病毒S基因-重组痘苗病毒的制备和表达鉴定

目的 :制备和鉴定汉滩病毒 (HTNV)S基因 重组痘苗病毒 ,为进一步建立肾综合征出血热 (HFRS)患者HTNV核衣壳蛋白特异性细胞毒T淋巴细胞 (CTL)的靶细胞奠定基础。　方法 :用野生型痘苗病毒和HTNVS基因 重组痘苗病毒分别感染Vero细胞 ,进行病毒扩增和滴度测定。用PCR和斑点杂交鉴定重组痘苗病毒基因组中的HTNVS基因 ,用间接免疫荧光和westernblot检测核衣壳蛋白的表达。　结果 :制备了含HTNVS基因的重组痘苗病毒 ,滴度为 4 .0 2× 10 7。该重组痘苗病毒基因组中存在HTNVS基因 ,它在Vero细胞中能有效地表达核衣壳蛋白。　结论 :制备了较高滴度、能有效表达HTNV核衣壳蛋白的重组痘苗病毒。     

强脉冲光对皮肤热休克蛋白70表达的影响

目的 观察强脉冲光对皮肤热休克蛋白70表达的影响,探讨光子嫩肤的分子生物学机制。方法 选择15只SD大鼠,每只选3个部位用强脉冲光照射,采用同一照射参数,能量密度34J/cm²,分为3个脉冲,脉宽各为4、5、6ms,脉冲延时为20及25ms。照射后第1、3、5、7、15、30天分别于治疗及非治疗部位切取皮肤样本,免疫组化染色,观察。结果 照射部位第1天皮肤表皮、皮脂腺细胞、毛细血管内皮细胞均呈阳性染色,第7天达高峰,第15天染色渐弱,第30天染色基本消失,非治疗部位染色阴性。结论 强脉冲光照射皮肤后可引起热休克蛋白70表达的增加,提示热休克蛋白70在光子嫩肤过程中起一定作用。     

腹腔感染大鼠肠黏膜屏障功能障碍与热休克蛋白-70表达的研究

目的 观察人参皂甙Rb1针剂(Ginsenoside Rb1,GRb1)对腹腔感染大鼠肠黏膜细胞热休克蛋白-70(HSP-70)的影响,探讨GRbl对肠黏膜屏障的保护作用机制.方法 30只SD雄性大鼠随机分为正常组、对照组及实验组,各10只.对照组及实验组建立腹腔感染模型.实验组于造模前7d予GRb1针剂(20mg/kg),其他组予等量生理盐水,每天腹腔注射1次.各组造模后42 h,管饲已标记的大肠杆菌.48 h处死后,取小肠作病理学分析及免疫组织化学检测小肠黏膜HSP.70的表达;取胰腺、肾脏、脾脏、肝脏组织,检测大鼠移位标记菌变化.结果 与对照组相比,GRb1能明显提高腹腔感染大鼠小肠黏膜的HSP-70表达,并减轻小肠黏膜组织破坏程度,减少胰腺、肾脏、脾脏、肝脏等周围器官的细菌移位.结论 GRb1能提高肠黏膜细胞HSP-70的表达,减轻其肠黏膜损伤,减少细菌移位,具有一定的肠黏膜屏障保护作用.     

HSP-70与细胞保护的研究进展

热休克蛋白70（HSP-70）是生物体产生的一种有高度保守性的应激蛋白,可以增强细胞对损害的耐受程度,维持细胞的正常代谢功能,提高细胞的生存率。在中枢神经系统、心肌、肝脏、肺等组织器官损伤中具有保护作用。     

分枝杆菌穿梭表达质粒pJHSP70的构建及鉴定

目的 用结核分枝杆菌热休克蛋白70(heat shock protein70,HSP70)启动子改建分枝杆菌穿梭质粒pJEM11为分枝杆菌穿梭表达质粒pJHSP70,并对其功能进行鉴定.方法 以卡介苗(BCG)基因组DNA为模板,利用聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增HSP70启动子,克隆至pMD18-T载体,经鉴定后,再定向克隆入pJEM11的Apa Ⅰ位点与SnaB Ⅰ位点之间,构建pJHSP70载体,并对载体进行PCR及酶切鉴定,然后再将幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,HP)尿素酶B亚单位(urease B subunit,UreB)基因克隆入pJHSP70载体,评价其在耻垢分枝杆菌(Mycobacteria smegmatis,M. smegmatis)mc2 155中的表达情况.结果 从BCG基因组中扩增出160 bp的基因片段,所构建的穿梭质粒经酶切和PCR鉴定与预期结果一致.测序结果证实插入片段正确,UreB基因在M. smegmatis中成功表达.结论 成功改建穿梭质粒pJEM11为穿梭表达质粒pJHSP70.     

Heat shock protein 70 expression in relation to apoptosis in primary bladder transitional cell carcinoma

Bladder carcinoma is the most common tumor in the urinary system. In 1996, a sampleinvestigation showed that bladder carcinoma, in which more than 90% was mainly primary bladder transitional cell carcinoma （BTCC）, was one of the ten highest mortality malignant tumors in China. Bladder carcinoma represented 2% of all malignant tumors and has the fifth most common malignancy in men in Europe and North America.     

次声作用后大鼠脑中热休克蛋白70的表达和分布

观察次声作用后大鼠脑中热休克蛋白ＨＳＰ７０的表达和分布。方法：ＳＤ大鼠接受频率为８Ｈｚ和１６Ｈｚ,声压为９０ｄＢ和１２０ｄＢ次分别作用１,３,７,１４,２１ｄ后,采用免疫组织化学方法观察大鼠脑中ＨＳＰ７０的表达和分布。结果：各参数次声作一定时间后,ＨＳＰ７０阳性神经元主要布在下丘脑,边缘系统,听觉中枢,皮质,海马等脑区,各脑区出现阳性反应的时间不同,且随次声频率增高、声压增强及作用次数增加,ＨＳＰ     

COPD患者肺组织中热休克蛋白的表达及意义

目的研究热休克蛋白70（HSP70）在慢性阻塞性肺疾病（COPD）中的表达情况与临床意义。方法通过免疫组化和PCR技术，研究COPD患者肺组织标本中HSP70的表达，以及与肺功能的关系。所有患者分为三组，正常组34例，轻度COPD组33例，中重度COPD组15例。结果82例患者肺组织中，阳性率100%，随着严重程度的不同，表达有逐渐增强的趋势，且在吸烟组的非CODP患者的表达高于非吸烟组。结论HSP70在COPD呈高表达状况，且与肺功能的严重程度和吸烟密切相关，对肺组织的慢性损伤有保护作用。