Cotransduction of tyrosine hydroxylase and aromatic L-amino acid decarboxylase genes into cultured striatal cells using adeno-associated virus vectors

OBJECTIVE To examine whether tyrosine hydroxylase (TH) and aromatic L-amino acid decarboxylase (AADC) genes can be cotransduced into the same target striatal cells using adeno-associated virus (AAV) vectors, and to determine whether the cotransduction would result in better biochemical change than the TH gene alone.

METHODS TH and AADC genes were cotransduced into cultured striatal cells with separate AAV vectors. Expressions of TH and AADC were detected by immunocytochemistry; intracellular catecholamine levels were assayed by high-performance liquid chromatography (HPLC).

RESULTS TH and AADC genes were efficiently cotransduced into the striatal cells. Specifically, the coexpression of TH and AADC resulted in more effective dopamine production compared with the TH gene alone.

CONCLUSIONS Using AAV vectors, coexpression of TH and AADC in the striatal cells might be a useful approach to gene therapy for Parkinson's disease.

     

多巴胺合成酶相关基因治疗帕金森病的实验研究

目的探讨重组多巴胺合成酶基因在体内外的表达、生成蛋白的活性及对帕金森病模型大鼠的治疗作用。方法在腺相关病毒介导下,将多巴胺合成酶相关基因酪氨酸羟化酶(TH)基因、芳香族氨基酸脱羧酶(AADC)基因与GTP环化水解酶Ⅰ(GCH-Ⅰ)基因导入COS7细胞,分别通过原位杂交与免疫组化的方法检测目的基因的转录与表达,通过高压液相分析检测酶活性。将携带目的基因的运载细胞移植到帕金森病模型大鼠纹状体,每周进行诱发旋转行为的检测。10周后高压液相分析脑内多巴胺含量,以进一步评估复合基因的治疗效果。结果重组多巴胺合成酶基因在体外可以表达并被正确修饰,具有联合酶促催化功能。当把表达TH、AADC与GCH-Ⅰ基因的细胞共培养时,在底物左旋酪氨酸存在的情况下,可以生成大量多巴胺。而且,把携带治疗基因的细胞移植到大脑后,经检测三基因移植组脑内多巴胺的生成量较单基因移植组多,且前者与后者相比,其行为学改善更为明显。但是三基因移植组与双基因组相比,脑内多巴胺生成量差异无显著意义。结论在帕金森病基因治疗策略中,应根据多巴胺能神经元的损伤程度来选择加入基因的组合量。复合基因治疗的效果明显好于单基因。     

酪氨酸羟化酶和GTP环水解酶-1基因修饰永生化成纤维细胞及其表达研究

目的 探讨酪氨酸羟化酶（TH）和GTP环水解酶－1（GCH）基因修饰的永生化成纤维细胞的可行性和表达能力，为其混合移植治疗帕金森病（PD）作准备。方法 SV40大T抗原转化成纤维细胞使其永生化。构建TH和GCH基因真核表达质粒并转染永生化成纤维细胞，利用免疫组化和RT－PCR检测其在体内外的表达。结果 TH和GCH基因修饰的永生化成纤维细胞在体外可长期传代培养且可有效表达，脑内移植后TH基因至少可表达8周以上。结论 TH基因和GCH修饰的永生化成纤维细胞在PD治疗方面具有较好的应用前景。     

携带抑癌基因的重组腺相关病毒载体的构建及病毒包装滴定方法探讨

目的　构建携带多肿瘤抑制基因p16 (mts 1)及抑癌基因p2 1WAF1的腺相关病毒 (AAV)载体 ,通过病毒包装、纯化及滴定 ,获得高纯度高感染性的病毒液 ,为进行肝癌基因治疗的实验研究奠定基础。方法　以p16cDNA及p2 1cDNA全长为目的基因 ,构建AAV载体prAAV AFP p16 ,prAAV AFP p2 1,prAAV CMV p16及prAAV CMV p2 1。其中前两种载体能在人肝癌细胞中特异表达目的基因。应用脂质体将重组载体与辅助质粒PspRC72、腺病毒粘粒共转染包装细胞 ,2d后感染野生型腺病毒 ,至细胞裂解病变明显时收获。纯化后用聚合酶链反应法扩增倍比稀释后病毒液内的甲胎球蛋白或巨细胞病毒启动子DNA ,进行病毒DNA颗粒滴度测定。然后用重组腺相关病毒与腺病毒 (MOI均为 10 )共感染C12细胞 ,至细胞裂解病变明显时再收获。结果　重组载体经酶切鉴定测序证实。 2 93细胞、C12细胞包装病毒效果良好 ,病毒颗粒滴度介于 10 13 ～ 10 14 个 /ml之间。携带GFP的感染性AAV滴度为 5× 10 10 个 /ml。电镜下病毒呈小圆形空斑状 ,直径 2 5～ 30nm。MOI值 10 0时 ,rAAV AFP GFP病毒感染肝癌细胞的阳性率达 70 % ,为携带目的基因的AAV病毒用于肝癌细胞的促凋亡研究提供了定量指标。结论　成功构建了AAV载体 ,探讨了病毒包装方法 ,即第一次转染成功后 ,     

不同血清型腺相关病毒载体转染小鼠视网膜后的表达效率

目的:研究不同血清型腺相关病毒 (adeno-associated virus,AAV) 载体介导的外源基因在视网膜中的表达效率, 同时比较AAV载体和两种眼科常用启动子组合后转染小鼠视网膜的表达效率高低,为视网膜色素变性基因治疗选择合适的AAV载体与启动子提供依据。方法:AAV病毒根据衣壳蛋白不同可分为不同血清型,本课题选取视网膜疾病基因治疗中常用的AAV2/2、AAV2/5、AAV2/8和AAV2/9四种血清型AAV载体,并以绿色荧光蛋白 (green fluorescent protein, GFP) 作为报告基因,用GFP的表达强度判断AAV载体介导的外源基因在视网膜中的表达效率。AAV载体纯化后滴度为1.00×10 ¹³ mg/L,注射1 μL至C57BL/6J小鼠视网膜下腔, 于2周取眼球做成冰冻切片,在共聚焦显微镜下观察 GFP在小鼠视网膜各层的表达情况。选取在感光细胞内特异性表达最强的AAV2/8于第4周取眼球冰冻切片继续观察是否能持续稳定表达。随后选取眼科基因治疗最常用的广谱启动子CMV和由CMV增强子与鸡β-肌动蛋白启动子组成的CAG启动子,并构建AAV2/8-GFP-CMV和AAV2/8-GFP-CAG两种不同启动子的病毒载体注射至视网膜下腔,于2周取眼球做成冰冻切片,在共聚焦显微镜下观察不同启动子的AAV2/8在小鼠视网膜各层的表达情况。结果: 注射AAV-GFP后未见典型的术后细菌感染及明显免疫反应。AAV2/2、AAV2/5、AAV2/8和AAV2/9四种血清型AAV载体视网膜下腔注射2周后,AAV2/8和AAV2/9在小鼠视网膜的GFP绿色荧光明显,说明这两种AAV载体转染小鼠视网膜后的表达效率高,而在这两种血清型中,AAV2/8的GFP绿色荧光主要集中在感光细胞内,AAV2/9 在视网膜全层均有表达,说明AAV2/8对视网膜感光细胞特异性更强。对AAV2/8的进一步实验表明在视网膜下腔注射4周后小鼠视网膜的GFP绿色荧光明显,说明AAV2/8载体介导的外源基因能在体内稳定表达。使用CMV启动子时GFP在感光细胞与视网膜色素上皮细胞均有表达,而使用CAG启动子时GFP主要在感光细胞表达。结论:视网膜下腔注射AAV病毒载体可在视网膜细胞内稳定表达报告基因;AAV2/2、AAV2/5、AAV2/8和AAV2/9四种血清型AAV载体中,AAV2/8和AAV2/9在视网膜表达能力最强,AAV2/8对视网膜感光细胞特异性最好;CMV和CAG两种启动子,CAG启动子对感光细胞特异性更高。     

汉族多巴反应性肌张力障碍患者中的GTP环化水解酶Ⅰ基因缺失

目的：基于对汉族人群中的多巴反应性肌张力障碍（DRD）患者基因突变的研究,进一步探究GTP环化水解酶Ⅰ基因（GCH1）、酪氨酸羟化酶基因（TH）、Epsilon-sarcoglycan编码基因（SGCE）上是否存在外显子缺失。方法：对来自4个DRD家系共8名患者及其5名无症状家属、10名散发性DRD患者和3名正常对照者的GCH1、TH、SGCE基因的22个外显子进行多重连接式探针扩增（MLPA）分析,对MLPA结果出现异常的外显子采用实时定量PCR（qPCR）进行验证,然后使用ddCt法与正常对照者比较分析GCH1、TH、SGCE基因是否存在外显子缺失。结果：1名散发性DRD患者的GCH1基因1号外显子出现杂合缺失,正常对照均未发现此外显子缺失。其余家系或散发性患者未检测到外显子缺失或扩增。结论：在汉族人群中,散发性DRD患者GCH1基因存在外显子缺失,但出现频率较低;对于突变阴性的散发性DRD患者,有必要检测其GCH1基因是否存在缺失。     

不同血清型腺相关病毒载体转染小鼠视网膜后的表达效率

目的:研究不同血清型腺相关病毒 (adeno-associated virus,AAV) 载体介导的外源基因在视网膜中的表达效率, 同时比较AAV载体和两种眼科常用启动子组合后转染小鼠视网膜的表达效率高低,为视网膜色素变性基因治疗选择合适的AAV载体与启动子提供依据。方法:AAV病毒根据衣壳蛋白不同可分为不同血清型,本课题选取视网膜疾病基因治疗中常用的AAV2/2、AAV2/5、AAV2/8和AAV2/9四种血清型AAV载体,并以绿色荧光蛋白 (green fluorescent protein, GFP) 作为报告基因,用GFP的表达强度判断AAV载体介导的外源基因在视网膜中的表达效率。AAV载体纯化后滴度为1.00×10 ¹³ mg/L,注射1 μL至C57BL/6J小鼠视网膜下腔, 于2周取眼球做成冰冻切片,在共聚焦显微镜下观察 GFP在小鼠视网膜各层的表达情况。选取在感光细胞内特异性表达最强的AAV2/8于第4周取眼球冰冻切片继续观察是否能持续稳定表达。随后选取眼科基因治疗最常用的广谱启动子CMV和由CMV增强子与鸡β-肌动蛋白启动子组成的CAG启动子,并构建AAV2/8-GFP-CMV和AAV2/8-GFP-CAG两种不同启动子的病毒载体注射至视网膜下腔,于2周取眼球做成冰冻切片,在共聚焦显微镜下观察不同启动子的AAV2/8在小鼠视网膜各层的表达情况。结果: 注射AAV-GFP后未见典型的术后细菌感染及明显免疫反应。AAV2/2、AAV2/5、AAV2/8和AAV2/9四种血清型AAV载体视网膜下腔注射2周后,AAV2/8和AAV2/9在小鼠视网膜的GFP绿色荧光明显,说明这两种AAV载体转染小鼠视网膜后的表达效率高,而在这两种血清型中,AAV2/8的GFP绿色荧光主要集中在感光细胞内,AAV2/9 在视网膜全层均有表达,说明AAV2/8对视网膜感光细胞特异性更强。对AAV2/8的进一步实验表明在视网膜下腔注射4周后小鼠视网膜的GFP绿色荧光明显,说明AAV2/8载体介导的外源基因能在体内稳定表达。使用CMV启动子时GFP在感光细胞与视网膜色素上皮细胞均有表达,而使用CAG启动子时GFP主要在感光细胞表达。结论:视网膜下腔注射AAV病毒载体可在视网膜细胞内稳定表达报告基因;AAV2/2、AAV2/5、AAV2/8和AAV2/9四种血清型AAV载体中,AAV2/8和AAV2/9在视网膜表达能力最强,AAV2/8对视网膜感光细胞特异性最好;CMV和CAG两种启动子,CAG启动子对感光细胞特异性更高。     

MPTP对小鼠黑质纹状体神经递质代谢相关基因表达的影响

目的 研究1－甲基－4－苯基－1，2，3，6－四氢吡啶（1－methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine,MPTP)诱导的的黑质纹状体系统神经递质代谢相关基因表达的变化。方法 通过MPTP注射诱导C57BL小鼠神经元损伤，利用逆转录PCR方法检测酪氨酸羟化酶（TH），单胺氧化酶B（MAO－B），多巴胺转运体（DAT），胆碱乙酰基转移酶（ChAT)以及谷氨酸脱羟酶（GAD65）五种神经递质代谢相关基因的表达变化。结果 在小鼠黑质与纹状体中，MPTP导致TH基因表达显著降低以及GAD65基因表达的上升。MAO－B，DAT，ChAT基因的表达变化在黑质与纹状体则有所不同，在黑质MPTP导致MAO－B与ChAT基因表达的上升以及DAT基因表达下降，在纹状体MPTP导致MAO－B与ChAT基因表达下降，而对DAT基因表达没有明显影响。结论 MPTP对不同神经递质代谢相关基因表达有不同的影响，且具有一定的脑区特异性。     

自噬参与DJ-1保护大鼠黑质多巴胺能神经元抵抗鱼藤酮损伤

目的 观察过表达DJ-1是否缓解鱼藤酮致SD大鼠中脑黑质多巴胺能神经元损伤及其机制。方法 在大鼠黑质致密部注射携带DJ-1、LacZ或者GFP-DJ-1、GFP的腺相关病毒颗粒,4周后注射鱼藤酮。通过免疫组织化学方法鉴定基因表达情况,并检测 TH阳性神经元数量,验证DJ-1保护作用。通过Western blotting方法检测自噬相关蛋白表达水平。结果 鱼藤酮损伤4周时,可见过表达DJ-1组大鼠损伤侧黑质的TH阳性神经元数目显著高于单纯鱼藤酮损伤组,差异有统计学意义(P<0.05)。蛋白印迹检测动物损伤侧黑质自噬相关蛋白Beclin1、p-mTOR的表达和LC3 Ⅱ/Ⅰ的比值,发现DJ-1过表达组中Beclin1与LC3 Ⅱ/Ⅰ的比值均较对照组增加,差异有统计学意义;而p-mTOR的表达较对照组降低,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 DJ-1能抵抗鱼藤酮对大鼠黑质多巴胺能神经元的损伤,DJ-1能上调自噬水平。     

AAV载体靶向修饰策略在基因治疗中的研究进展

腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)是微小病毒科的一种,它能以其广泛的宿主范围及低的免疫原性对人及灵长类进行感染,而且经过改造后的AAV能够更有效的转导特异组织及细胞。腺相关病毒作为一种基因治疗载体其生物学特性已被深入了解,通过改造腺相关病毒的血清型和蛋白衣壳结构能够扩宽其应用范围。本文对AAV病毒载体的衣壳蛋白基因工程修饰、转录水平调控修饰、基因改造和衣壳蛋白共价偶联修饰的靶向机理以及相关的一些研究成果进行介绍。     

Targeted Expression and Secretion of Human Apoprotein AI, Apoprotein E and Lecithin cholesterol Acyltransferase from Myogenic Cells

Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓａｎｄｉｔｓｃｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅｓａｃｃｏｕｎｔｆｏｒｍｏｓｔｍｏｒｂｉｄｉｔｙａｎｄｍｏｒｔａｌｉｔｙｉｎｔｈｅｗｏｒｌｄ.Ａｎｕｍｂｅｒｏｆｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｉｃａｌｓｔｕｄｉｅｓｈａｖｅｄｅｍｏｎ ｓｔｒａｔｅｄａｎｉｎｖｅｒｓｅｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｂｅｔｗｅｅｎ ｐｌａｓｍａｈｉｇｈ ｄｅｎｓｉｔｙｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ (ＨＤＬ)ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎａｎｄｔｈｅｉｎｃｉｄｅｎｃｅｏｆａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ[1 ] .Ｉｔｉｓｗｉｄｅｌｙａｃ ｃｅ…     

hIL-2与ZsGreen双基因共表达腺相关病毒的包装及鉴定

[目的]包装并鉴定带有人白介素2（hIL-2）及ZsGreen的双基因共表达的重组5型腺相关病毒（recombinant adeno-associated virus 5,rAAV5）,为今后利用5型重组腺相关病毒载体进行胰腺癌基因治疗提供研究基础。[方法]以5型腺相关病毒包装系统（helper-free system）为模版,PCR法扩增pLVX-IRES-ZsGreen和PES-IL-2模板上的IRES-ZsGreen和IL-2基因,利用酶切位点插入重组腺相关病毒骨架质粒,获得重组质粒pAAVhIL-2-IRES-ZsGreen。经三质粒共转染AAV293细胞包装重组腺相关病毒rAAV5-hIL-2-IRES-ZsGreen。荧光显微镜下检测病毒包装效率,超速离心纯化、浓缩重组病毒,qPCR测定病毒的滴度。重组病毒转导细胞经荧光显微镜检测、外源基因经PCR检测证实病毒包装结果。[结果]5型重组腺相关病毒骨架质粒pAAV-IL-2-IRES-ZsGreen经双酶切和测序鉴定,确定其序列正确。荧光显微镜下观察三质粒共转染AAV293细胞72h后,病毒包装效率达90%以上。5型重组病毒感染HEK 293细胞48h有荧光出现,重组病毒基因组成功扩增出外源基因IL-2,证明有感染力的重组病毒包装成功。[结论]成功包装带有hIL-2及ZsGreen标记的双基因共表达重组腺相关病毒,滴度达到2.62×1012。     

氧相关HRE启动子控制下表达hVEGF165基因重组2型腺相关病毒的获得及鉴定

目的包装及鉴定低氧反应元件（HRE）启动子控制下缺氧诱导目的基因hVEGF165基因表达的2型重组腺相关病毒。方法磷酸钙三质粒共转染方法将pAAV—HRE9-VEGF165、pAAV—Rep／cap、pHelper质粒转染HEK293T细胞，制备2型重组腺病毒相关病毒（rAAV2）。分离培养S—D大鼠心肌细胞，转染rAAV，细胞固定后做免疫细胞荧光染色，检测细胞内血管内皮细胞生长因子（VEGF165）蛋白的表达。结果pAAV—HRE9-VEGF165质粒经测序鉴定，结果与NCBIGenBank公布的人VEGF165 eDNA核苷酸序列（AB021221）完全一致，含HRE启动子及目的基因hVEGF165的2型重组非复制型腺相关病毒包装成功，可感染原代培养的大鼠心肌细胞，缺氧可诱导VEGF165蛋白表达。结论成功包装并鉴定了rAAV—HRE9-hVEGF165载体，可有效转染心肌细胞，VEGF165基因的适时表达，为缺血性心肌疾病的“分子搭桥”治疗提供了更可能的安全性。     

腺相关病毒介导的人血管内皮生长因子体外转染兔骨髓内皮祖细胞

目的:探讨腺相关病毒-2(AAV-2)介导人血管内皮生长因子-165(hVEGF165)转染兔骨髓内皮祖细胞(EPCs)及其对EPCs增殖能力的影响。方法:构建携带hVEGF165基因的重组腺相关病毒(rAAV)载体pAAV-hVEGF165;制备携带hVEGF165基因的rAAV(rAAV-2-hVEGF165)和携带β-半乳糖苷酶(-βgal)基因的rAAV(rAAV-2-LacZ);体外培养和鉴定兔骨髓EPCs;分别用rAAV-2-hVEGF165和rAAV-2-LacZ体外转染EPCs(AAV/VEGF-EPC和AAV/LacZ-EPC);用RT-PCR、免疫细胞化学、流式细胞术等法检测hVEGF165和-βgal的表达,MTT法检测AAV/VEGF-EPC的增殖能力。结果:经酶切鉴定和DNA测序,得到了序列正确的重组质粒pAAV-hVEGF165;AAV/VEGF-EPC能够表达hVEGF165蛋白,AAV/LacZ-EPC能够表达-βgal;rAAV-2-hVEGF165对于EPCs的转染率为64.4%;AAV/VEGF-EPC的增殖能力明显强于AAV/LacZ-EPC和EPCs。结论:EPCs可以被rAAV-2-hVEGF165高效转染,其增殖能力明显增强。本文为进一步探讨AAV/VEGF-EPC用于缺血性血管疾病治疗的可能性奠定了基础。     

GAP-43基因及TH基因治疗帕金森病的实验研究

目的：利用基因工程化细胞及双基因表达的方式对生长相关蛋白质（Growth associated protein,GAP-43)基因及酪氨酸羟化酶（Tyrosine hydroxylase,TH)基因在治疗帕金森病（Parkinson's disease,PD)中的作用进行探讨。方法：将GAP－43及TH基因分别构建入逆转录病毒载体中，再将含重组DNA的病毒上清感染培养的星形胶质细胞后移植入PD大鼠脑内，了解PD鼠旋转行为的改善情况。结果：TH基因治疗组及TH＋GAP－43基因治疗组PD鼠旋转行为改善明显，GAP－43基因治疗组无明显治疗作用，结论：TH对PD有明显的治疗作用，GAP－43可促进TH的疗效。     

腺相关病毒基因治疗载体的改良与应用

腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)的非致病特性使得以其为基础的重组病毒载体具有卓越的安全性,成为在基因治疗中最富吸引力的候选载体之一,并且在多种疾病的临床治疗中广泛应用。在过去的十余年中,随着分子病毒学领域对AAV基础研究的进展,研究者不断地为重组腺相关病毒的生产和改良提供新的思路和方案,以改善其对宿主或靶向细胞的感染选择性和转导效率,其中相当部分已逐渐向临床试验阶段过渡。本综述将在介绍AAV基本生物学特征的同时,结合一些实验室研究的成功案例,重点讨论AAV的改良策略、实施方案与应用特点,并对当前以AAV为载体的基因治疗的全球现状及其所面临的挑战与前景进行分析和探讨。     

An experimental study on rat model of parkinsonism by gene therapy.

ＡｎｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｓｔｕｄｙｏｎｒａｔｍｏｄｅｌｏｆｐａｒｋｉｎｓｏｎｉｚｍｂｙｇｅｎｅｔｈｅｒａｐｙＸｕＱｕｎｙｕａｎ徐群渊，ＴｉａｎＪｉｎｇｓｈｅｎｇ田竟生，ＺｈａｎｇＪｉｎｌｕ张进禄，ＹａｎｇＨｕｉ杨慧，ＺｈｅｎｇＳｈａｏｐｅｎｇ郑少...     

利用腺病毒提高腺相关病毒对肿瘤细胞的转导效率

目的 探讨小量腺病毒作为辅助病毒能否增强腺相关病毒（AAV）对肿瘤细胞和裸鼠肿瘤模型的转导效率并对增强的机理进行初步探讨。方法 采用绿色荧光蛋白（EGFP）标记的AAV2联合不同滴度的非复制型腺病毒（Ad-null）感染人非小细胞肺癌细胞系（AAV2＋Ad-null组）,并以相同剂量的AAV2单独感染（AAV2组）作为对照。用荧光显微镜观察EGFP阳性细胞,流式细胞仪检测EGFP阳性细胞的百分率和单个细胞平均荧光强度,Western印迹检测EGFP蛋白表达的变化以比较各组病毒转导效率。换用萤光素酶（Luc）标记的AAV2,通过Luc检测系统检测两组对体外肿瘤细胞及裸鼠肿瘤模型的转导效率。荧光定量PCR检测感染后肿瘤细胞DNA及mRNA的EGFP相对拷贝数,观察Ad—null对AAV2复制及转录的影响。结果 随着Ad-null滴度的增加,AAV2＋Ad—null组的肿瘤细胞EGFP阳性细胞数明显增加。流式细胞仪计数的EGFP阳性细胞率按0．01、0．1、1、10MOI Ad—null滴度依次为10．9％,18．0％,36．2％,55．2％,明显高于AAV2组（6．4％）。AAV2＋10 MOI Ad—null组单个细胞的荧光强度约为AAV2组的1．32倍。各AAV2＋Ad-null组EGFP在细胞中的蛋白表达水平也均高于AAV2组。体外、体内Luc检测均显示Ad-null显著增强AAV2对肿瘤的转导效率,荧光素信号分别为AAV2单独感染的28和4．5倍。Ad-null可提高肿瘤细胞内AAV2的mRNA水平,当Ad—null滴度为1、10MOI时AAV2＋Ad—null组的EGFP拷贝数明显高于AAV2组,而Ad-null对细胞内从V2的DNA影响不大,AAV2＋Ad-null组与AAV2组的EGFP拷贝数差别不大。结论 联合使用少量腺病毒可明显提高AAV对肿瘤细胞的转导效率,可能与其提高AAV转录水平有关,为今后应用AAV作为肿瘤基因治疗的载体提供了实验证据。     

高滴度表达抑制转录因子的重组腺相关病毒的制备

目的 获得表达小鼠抑制转录因子ROG(repressor of GATA-3)基因；构建表达ROG的重组腺相关病毒载体，制备腺相关病毒。方法 设计、合成引物，通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)从CTLL-2细胞总RNA中扩增ROG基因，测序成功后，最终连接于pAAV-MCS，双酶切、PCR鉴定阳性重组质粒，并在Hela细胞中表达；制备高滴度重组腺相关病毒。结果 成功扩增了小鼠ROG基因，构建表达ROG基因的重组腺相关病毒表达载体，并成功表达于Hela细胞。结论 本实验构建的小鼠ROG重组腺相关病毒将为哮喘的基因治疗研究奠定物质基础。     

Experimental Study on Heterograft of Glomus Cells of Carotid Body for Hemiparkinsonian Rats

Parkinson disease(PD) is a neuro- degenerativedisorder commonly found in middle- aged or olderpeople,which ischaracterized by the loss ofmelanin-containing neurons in the substantia nigra pars com-pacta(SNpc) and a reduction in dopamine in stria-tum.After several years of treatment by dopamineprecursor,L- dihydroxyphenylalanine (L - DOPA ) ,and due to the reduced effectof L- DOPA and dyski-nesia,some PD patients need to be switched to othertherapeutic approaches such as neural transplant…