siRNA抑制人舌癌细胞VEGF表达对MMP-2、MMP-9及TIMP-1蛋白表达的影响

目的:探讨小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)抑制人舌癌Tca8113细胞血管内皮生长因子(vascular endo-thelial growth factor,VEGF)表达对移植瘤基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMP)-2、MMP-9及基质金属蛋白酶抑制剂-1(tissue inhibitors of metalloproteinase-1,TIMP-1)蛋白表达的影响。方法:以稳定转染携带针对VEGF的siRNA真核表达载体的人舌癌Tca8113细胞(VEGF-siRNA1、VEGF-siRNA2)为实验组,以转染空载体的人舌癌Tca8113细胞及未转染的人舌癌Tca8113细胞为实验对照组和空白对照组,将各组细胞分别接种于裸鼠皮下,用明胶酶谱实验及蛋白免疫印迹法分别测定各组移植瘤TIMP-2、TIMP-9及TIMP-1的蛋白表达。结果:各组明胶酶谱实验结果均有较明显MMP-9蛋白表达,活性MMP-9蛋白含量较少,MMP-2蛋白表达量明显少于MMP-9蛋白表达,而活性MMP-2几乎完全没有可见条带出现。各组中MMP-2、MMP-9及活性-MMP-9条带酶量差异均尚不具统计学意义(P>0.05)。以scion图像分析系统分别读取各样本TIMP-1条带灰度值及β-actin条带灰度值,各组中TIMP-1蛋白相对含量差异亦无统计学意义(P>0.05)。结论:以siRNA干扰人舌癌Tca8113细胞VEGF基因,可明显抑制肿瘤内VEGF的蛋白表达,但是对MMP-2、MMP-9及TIMP-1蛋白的表达无明显影响。     

EFFECTS OF VEGF SUPPRESSION BY SIRNA ON THE EXPRESSION OF MMP-2, MMP-9 AND TIMP-1 IN HUMAN TONGUE SQUAMOUS CELL CAICINOMA

目的:探讨小干扰RNA (small interfering RNA,siRNA)抑制人舌癌Tca8113细胞血管内皮生长因子 (vascular endothelial growth factor,VEGF)表达对移植瘤基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMP)-2、MMP-9及基质金属蛋白酶抑制剂-1(tissue inhibitors of metalloproteinase-1,TIMP-1)蛋白表达的影响.方法:以稳定转染携带针对VEGF的siRNA真核表达载体的人舌癌Tca8113细胞(VEGF-siRNA1、VEGF-siRNA2)为实验组,以转染空载体的人舌癌Tca8113细胞及未转染的人舌癌Tca8113细胞为实验对照组和空白对照组,将各组细胞分别接种于裸鼠皮下,用明胶酶谱实验及蛋白免疫印迹法分别测定各组移植瘤TIMP-2、TIMP-9及TIMP-1的蛋白表达.结果:各组明胶酶谱实验结果均有较明显MMP-9蛋白表达,活性MMP-9蛋白含量较少,MMP-2蛋白表达量明显少于MMP-9蛋白表达,而活性MMP-2几乎完全没有可见条带出现.各组中MMP-2、MMP-9及活性-MMP-9条带酶量差异均尚不具统计学意义(P＞0.05).以scion图像分析系统分别读取各样本TIMP-1条带灰度值及β-actin条带灰度值,各组中TIMP-1蛋白相对含量差异亦无统计学意义(P＞0.05).结论:以siRNA干扰人舌癌Tca8113细胞VEGF基因,可明显抑制肿瘤内VEGF的蛋白表达,但是对MMP-2、MMP-9及TIMP-1蛋白的表达无明显影响.     

靶向舌癌Tca8113细胞血管内皮细胞生长因子基因的siRNA表达载体构建及体外抑制作用

目的构建靶向舌癌Tca8113细胞血管内皮细胞生长因子（VEGF）基因的siRNA表达载体并在体外检测其对VEGF基因表达的抑制作用。方法设计合成靶向舌癌Tca8113细胞VEGF基因的siRNA cDNA序列并与Psilencer2.1-U6-neo连接,构建VEGF-siRNA表达载体（Pu-VEGF-siRNA）,酶切鉴定和测序确认后,经脂质体Lipofectamine2000转染入Tca8113细胞,以空载体组为实验对照组（Pu-HK）,未转染组为空白对照组。采用酶联免疫吸附（ELISA）和免疫组化方法检测染后Tca8113细胞VEGF蛋白表达差异。结果经过双酶切鉴定和测序分析,成功构建了靶向Tca8113细胞VEGF基因的siRNA表达载体。与实验对照组和空白对照相比较,转染Pu-VEGF-siRNA后Tca8113细胞的VEGF蛋白表达明显下降（P〈0.05）,但两对照组间差异无统计学意义（P〉0.05）。结论成功构建了靶向舌癌Tca8113细胞VEGF基因的siRNA表达载体,且该载体在体外能有效抑制Tca8113细胞VEGF蛋白的表达。     

RNA干扰沉默血管内皮生长因子抑制人舌癌细胞增殖的实验研究

目的:通过转染能特异性沉默血管内皮生长因子(VEGF)表达的小干扰RNA(siRNA),观察能否抑制人舌癌Tca8113细胞株的增殖.方法:将自行构建的两对表达siRNA的重组质粒(PU-VEGF-siRNA1,PU-VEGF-siRNA2)转染到舌癌Tca8113细胞株中,以空载体组转染为实验对照组,以正常生长的舌癌细胞做空白对照组.实验组和实验对照组经G418筛选后,与空白对照组以逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测VEGF mRNA的表达,流式细胞技术分析细胞凋亡,MTT比色法检测细胞的生长抑制率.结果:与实验对照组相比,PU-VEGF-siRNA1,PU-VEGF-siRNA2重组体显著降低舌癌细胞VEGF mRNA的表达(P＜0.01),MTT的结果显示分别在24、48、72、96 h对细胞增殖的抑制率增加(P＜0.05),细胞凋亡率也明显增高(P＜0.01);而空载体转染组与空白对照组相比,对Tca8113细胞株增殖无抑制作用,对细胞凋亡变化无明显影响(P＞0.05).结论:PU-VEGF-siRNA在细胞内表达的siRNA 不仅能显著降低VEGF表达,而且能有效抑制人舌癌细胞的增殖.     

VEGF—siRNA对人舌癌TCA8113细胞体内及体外生长影响的初步研究

目的探讨针对血管内皮生长因子(VEGF)的小分子RNA干扰(siRNA)对舌癌TCA8113细胞体内和体外生长的影响。方法将两对特异性针对VEGF的siRNA真核表达载体,以空载体组做实验对照组,经脂质体转染人舌癌TCA8113细胞,经G418筛选后获得稳定表达,以未转染舌癌细胞作空白对照组,MTT检测转染后各组细胞增殖情况;将稳定转染的各组细胞接种裸鼠,接种后7 d开始,每4 d测量瘤体积,绘制肿瘤生长曲线,比较各时间段肿瘤生长,接种后47 d处死,比较瘤体积和瘤重。结果与实验对照组和空白对照组相比较,两个实验组细胞生长速度降低,细胞抑制率均显著增高,差异有统计学意义(P<0.05),裸鼠接种肿瘤生长缓慢,处死后测量到瘤体体积小、重量轻(P<0.05),而实验对照组和空白对照组细胞抑制率、瘤体体积、瘤重等差异无统计学意义(P>0.05)。结论VEGF-siRNA在体内和体外能有效的抑制人舌癌细胞的生长。     

增强DNA聚合酶beta基因表达对人舌癌细胞生物学行为的影响

目的探讨DNA聚合酶beta（polβ）对人舌癌Tca8113细胞增殖和侵袭力的影响。方法运用野生型人polβ重组绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-C3-polβ转染Tca8113细胞,分别用RT-PCR、Western blot检测polβ转录及蛋白表达水平;细胞生长实验检测舌癌细胞增殖的变化;Boyden室细胞侵袭实验检测舌癌细胞侵袭能力的变化。结果 pEGFP-C3-polβ转染Tca8113细胞获得稳定细胞株,与空白对照组及空载体组比较,polβmRNA及蛋白表达水平均明显增高,野生型polβ导入的舌癌细胞增殖和侵袭能力均明显减弱（P〈0.05）。结论 DNA polβ表达增强能够降低人舌癌细胞的增殖和侵袭能力。     

量子点为载体转染survivin siRNA至人舌鳞癌Tca8113细胞的研究

目的靶向survivin基因的siRNA通过量子点为载体转染至人舌鳞癌Tca8113细胞中,研究其对survivin基因表达的影响,为量子点在肿瘤的基因治疗方面提供实验依据。方法 Survivin siRNA通过量子点转染至人舌鳞癌Tca8113细胞中,同时设立LIPOFECTTAMINE2000脂质体为转染载体的对照组以及未转染的空白组,采用实时定量RT-PCR检测各组Tca8113细胞中survivin mRNA表达的改变情况。结果实验组用50pmolQD转染100pmol survivin siRNA入Tca8113细胞48h后,检测到survivin siRNA mRNA表达量相对于空白组下降64%,QD与siRNA的使用比例为1∶2;对照组中用100pmol lipofectamine2000脂质体转染100pmol survivin siRNA入Tca8113细胞48h后,检测到survivin siRNA mRNA表达量相对于空白组下降90%,QD与siRNA的使用比例为1∶1。结论量子点为载体转染survivin siRNA能够有效的抑制Tca8113细胞survivin mRNA的表达,量子点有望作为RNA干扰技术的新型载体。     

那可丁联合奥沙利铂对人舌鳞状细胞癌 Tca8113 细胞增殖及凋亡的影响

目的 探究那可丁联合奥沙利铂对人舌鳞状细胞癌Tca8113 细胞增殖及凋亡的影响。方法 将 体外培养的人舌鳞状细胞癌Tca8113 细胞随机分为空白对照组、奥沙利铂组、那可丁组和联合用药组。 CCK-8 法检测各组药物对Tca8113 细胞的存活率;Hoechst33342 染色荧光显微镜下观察凋亡形态变化;流 式细胞术检测细胞凋亡率;Western blotting 法检测各组细胞中Bax、Bcl-2、PARP、Cleaved Caspase-9 及 Cleaved Caspase-3 蛋白的表达水平。结果 奥沙利铂组、那可丁组和联合用药组Tca8113 细胞存活率较空白 对照组低（P <0.05）,联合用药组较奥沙利铂组、那可丁组低（P <0.05）。Hoechst33342 染色法结果显示：奥 沙利铂组、那可丁组和联合用药组处理后均使人舌鳞状细胞癌Tca8113 细胞发生凋亡特征性改变。奥沙利铂组、 那可丁组和联合用药组Tca8113 细胞凋亡率较空白对照组高（P <0.05）,联合用药组较奥沙利铂组、那可丁 组高（P <0.05）。奥沙利铂组、那可丁组和联合用药组Bax、PARP、Cleaved Caspase-9 及Cleaved Caspase-3 的蛋白表达较空白对照组高（P <0.05）,而Bcl-2 的蛋白表达较空白对照组低（P <0.05）,联合用药组Bax、 PARP、Cleaved Caspase-9 及Cleaved Caspase-3 的蛋白表达较奥沙利铂组、那可丁组高（P <0.05）,Bcl-2 的 蛋白表达较奥沙利铂组、那可丁组低（P <0.05）。结论 那可丁联合奥沙利铂对人舌鳞状细胞癌Tca8113 细 胞的生长具有协同抑制作用,并促其凋亡,其作用机制可能与调节细胞凋亡相关蛋白表达有关。     

血管内皮生长因子及其受体在舌癌细胞中表达及意义

【目的】探讨人舌癌细胞株血管内皮生长因子(VEGF)及其受体KDR、Flt-1的表达,进一步认识VEGF在舌癌生长过程中的作用机制。【方法】以人脐静脉血管内皮细胞ECV304和小鼠成纤维细胞系L929作为对照,应用免疫组化染色和RT-PCR方法,检测体外培养的人舌癌细胞系Tca8113、GNM中VEGF及其受体的表达。【结果】GNM、Tca8113中皆有VEGF表达,Tca8113表达KDR和FLT-1,GNM表达KDR。【结论】在舌癌的生长过程中可能存在VEGF的自分泌机制。     

过表达长链非编码RNA MT1JP抑制视网膜母细胞瘤SO-RB50细胞的增殖、侵袭和体内移植瘤的生长

目的 探讨过表达长链非编码RNA MT1JP抑制视网膜母细胞瘤SO-RB50细胞的增殖、侵袭和体内移植瘤的生长机制。方法 体外培养视网膜母细胞瘤SO RB50细胞,并分为空白对照组（control组）、转染对照组（Vector组）及过表达组（MT1JP组）;采用RT PCR检测各组MT1JP的表达;克隆形成检测各组SO-RB50细胞生长情况;流式细胞仪检测细胞凋亡情况;Transwell检测细胞侵袭情况;Western blot检测Ki67、VEGF蛋白表达情况。小鼠皮下注射SO-RB50细胞,建立移植瘤模型;RT PCR检测长链的表达;统计裸鼠生存时间,绘制生存曲线;检测小鼠肿瘤重量;免疫组化检测小鼠肿瘤组织中Ki67和VEGF的表达情况。结果 与空白对照组比较,转染对照组的MT1JP表达、单位面积细胞侵袭数目、Ki67、VEGF蛋白表达均无显著变化（P＞0.05）;与转染对照组比较,过表达组MT1JP的表达、细胞凋亡率显著升高（P＞0.05）,克隆实验细胞形成率、Ki67、VEGF蛋白表达、单位面积细胞侵袭数目显著降低（P＜0.05）;小鼠体内实验显示：与空白对照组比较,转染对照组小鼠肿瘤质量、生存期、Ki67、VEGF蛋白表达均无显著差异（P＞0.05）;相比转染对照组,过表达组小鼠MT1JP表达、小鼠生存率显著提高（P＜0.05）;肿瘤质量、Ki67、VEGF蛋白表达显著降低（均P＜0.05）。 结论 过表达长链非编码RNA MT1JP可以抑制视网膜母细胞瘤SO-RB50细胞的增殖、侵袭,促进SO RB50细胞的凋亡并抑制体内移植瘤的生长。     

青蒿琥酯联合阿霉素对人舌鳞癌Tca8113细胞抑制作用的实验研究

目的研究青蒿琥酯(Art)与阿霉素(ADM)联合应用对人舌鳞癌Tca8113细胞增殖的影响。方法通过MTT法测定Art和ADM对Tca8113细胞增殖的抑制作用;应用流式细胞术分析细胞周期变化;利用吖啶橙-溴化乙锭(AO-EB)染色观察经Art作用前后Tca8113细胞形态的改变;应用透射电镜观察药物对细胞超微结构的影响。结果 Art和ADM对Tca8113有显著地抑制增殖和诱导凋亡作用,并呈明显的时间-剂量效应(P0.05);Art(25μg.mL-1)和ADM(0.39～1.56μg.mL-1)联合给药可对Tca8113产生增强的联合杀伤效果(P0.01);流式细胞术检测Art可使细胞周期阻滞于G2/M期和S期;透射电镜和荧光染色观察可见凋亡细胞染色质凝聚、边集呈新月形。结论 Art对Tca8113细胞有显著地抑制作用,其机制可能为阻滞细胞周期于G2/M期和S期以及诱导细胞凋亡。Art与ADM合用具有较好联合效应,可增强Tca8113对ADM的敏感性。     

Notch 1 对舌麟状细胞癌Tca8113细胞表皮生长因子受体表达的影响及其意义

目的：将编码Notch 1胞內域（NICD）转染人舌麟状细胞癌（舌麟癌）Tca8113细胞,探讨Notch 1在Tca8113细胞中的作用及其对表皮生长因子受体（EGFR）表达的影响。方法：采用脂质体法将编码NICD的pRAMIC-IRES2-EGFP目的质粒和pIRES2-EGFP对照质粒分别转染人舌麟癌Tca8113细胞,实验分为目的质粒pRAMIC-IRES2-EGFP转染组、对照质粒pIRES2-EGFP转染组和非转染组。采用RT-PCR法、Western blotting法和免疫细胞化学法观察细胞中Notch 1mRNA及蛋白和EGFR mRNA及蛋白表达水平,MTT法检测Tca8113细胞的增殖活性并计算细胞存活率。结果：转染后,与非转染组和对照质粒pIRES2-EGFP转染组比较,pRAMIC-IRES2-EGFP目的质粒转染组Notch 1 mRNA和蛋白表达水平明显升高（P<0.05）,而EGFR mRNA和蛋白表达水平明显降低（P<0.05）,细胞存活率明显降低（P<0.05）。与非转染组比较,对照质粒pIRES2-EGFR转染组Notch 1 mRNA和蛋白表达水平、EGFR mRNA和蛋白表达水平及细胞存活率差异无统计学意义（P>0.05）。结论：Notch 1对舌麟癌Tca8113细胞增殖的影响可能与EGFR的表达下调有关。     

人舌癌移植瘤模型中血管内皮细胞来源的实验研究

目的观察人舌癌裸鼠皮下移植瘤模型中肿瘤新生血管内皮细胞的来源。方法通过皮下移植人舌癌Tca8113-M1细胞建立人舌癌裸鼠移植肿瘤模型,并于肿瘤生长至直径1cm时切除肿瘤,对移植瘤进行病理组织学观察,利用免疫组织化学方法检测移植瘤内新生血管内皮细胞的来源,抗体为鼠抗人单克隆抗体CD34和大鼠抗小鼠单克隆抗体CD34;并进行微血管密度（microvessel density,MVD）计数及血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）表达检测。结果右腋窝皮下接种人舌癌Tca8113-M1细胞2周后,6只裸鼠的肿瘤直径都达到1cm以上,切片HE染色可见肿瘤组织病理形态为鳞状上皮细胞癌,MVD平均值为10．72±2．12,其中肿瘤新生血管内皮细胞大鼠抗小鼠CD34免疫组化结果是阳性,而鼠抗人CD34阴性。VEGF在6例移植瘤标本中均阳性表达,平均阳性率为（67±5．6）％。结论人舌癌移植瘤模型中血管内皮细胞主要来源于宿主裸鼠,并且可能与肿瘤细胞分泌的VFGE诱导有关。     

沉默SNAI1对口腔鳞状细胞癌细胞生物活性的影响

目的 探讨沉默转录因子SNAI1对口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinoma,OSCC）Tca8113细胞生物活性的影响。方法 体外培养Tca8113细胞,将其分为Tca8113细胞组、sh-control组和sh-SNAI1组,其中sh-control组、sh-SNAI1组分别用sh-control、sh-SNAI1转染Tca8113细胞。采用MTT法和流式细胞术分别检测各组细胞的增殖和凋亡能力;Transwell实验检测各组细胞的侵袭能力;划痕愈合实验检测各组细胞的迁移能力;实时荧光定量聚合酶链反应检测SNAI1 mRNA表达水平;蛋白质印迹法检测SNAI1、c-Myc、cyclin D1、Bcl-2、Bax、caspase-3、基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase,MMP）-2、MMP-9蛋白表达水平。结果 与Tca8113细胞组、sh-control组比较,sh-SNAI1组的细胞存活率、侵袭细胞数、划痕愈合率、SNAI1 mRNA及蛋白SNAI1、cyclin D1、MMP-2、MMP-9、c-Myc、Bcl-2水平显...     

无血清培养法分选舌癌侧群细胞及其特性的鉴定

目的探索人舌鳞癌细胞株Tca8113中侧群细胞的分选方法。方法利用流式细胞仪分选传统含血清培养方法获得的人舌鳞癌细胞系Tca8113中的侧群细胞(SP),并与无血清培养方法分离出的侧群细胞(TSC-SP)进行形态学比较和平板形成克隆实验及成瘤实验的比较,富集并验证肿瘤干细胞相关亚群。结果人舌癌细胞系Tca8113中SP细胞的含量为0.2%,而Tca8113细胞系的细胞在无血清培养基中能够成活,3~5 d后增殖并形成悬浮的肿瘤干细胞球,并随着培养时间的延长而肿瘤干细胞球体积增大和更加致密;而应用无血清悬浮法培养的Tca8113细胞系中TSC-SP细胞的含量为0.4%;SP与TSC-SP细胞在平板形成克隆实验的形成率均为100%;接种16 d后,104、105数量级的TSC-SP和SP接种裸鼠背部均出现瘤体。结论人舌鳞癌细胞系Tca8113中含极少量的SP细胞,利用无血清培养基可以达到富集肿瘤干细胞亚群的目的。     

Ebp1基因对舌鳞状细胞癌Tca8113细胞增殖的抑制作用

 目的 研究异位表达ebp1基因对舌鳞状细胞癌Tca8113细胞增殖能力的影响。方法 pcDNA3.1- ebp1真核表达载体稳定转染舌鳞状细胞癌细胞系（Tca8113）。Western blot和RT-PCR验证稳定转染细胞中ebp1的表达;观察细胞生长、增殖,细胞周期改变,通过软琼脂克隆形成,裸小鼠体内成瘤等方法来评价ebp1抑制肿瘤细胞生长的作用。结果 Ebp1转染细胞的细胞生长、增殖明显受抑制,细胞周期改变,G0/G1和G2/M细胞增多,而S期细胞减少,软琼脂克隆形成率明显下降;移植小鼠模型中肿瘤平均直径和重量Tca-0细胞明显大于Tca-1细胞和Tca-3细胞。结论 Ebp1异位表达对Tca8113有多种抗肿瘤特性,可进一步探讨将ebp1基因作为舌鳞状细胞癌的治疗措施的可能性。     

蟾毒灵体外抑制人舌鳞癌Tca8113细胞增殖和促凋亡作用及对Na+/K+-ATP酶的影响

目的 探索蟾毒灵对舌鳞状细胞癌Tca8113细胞增殖、凋亡的影响及可能作用机制.方法 以人舌鳞癌Tca8113细胞为研究对象,MTT法检测10、20、40、80、160 nmol/L浓度蟾毒灵体外抑制Tca8113细胞增殖的活性;检测蟾毒灵干预下肿瘤细胞Na+-K+-ATP酶活性的变化;Western blot发检测Bcl-2、Bax、caspase-3蛋白表达.结果 蟾毒灵有抑制Tca8113细胞的活性,且呈剂量-时间依赖性;在蟾毒灵干预下Tca8113细胞Na+-K+-ATP酶收到抑制;Western blot结果显示凋亡相关Bax、caspase-3蛋白表达上调,Bcl-2蛋白表达下调.结论 蟾毒灵通过抑制细胞膜Na+-K+-ATP酶活性,通过调节Bcl-2凋亡通路的相关蛋白,最终激活caspase-3,诱导人舌鳞癌Tca8113细胞凋亡.