肾素前体激活人肾系膜细胞ERK1/2诱导TGF-β的表达

目的:观察肾素前体(prorenin)能否激活体外培养的人肾系膜细胞(HRMCs)膜表面的肾素(前体)受体[(P)RR],从而活化细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)信号通路。方法:体外培养HRMCs。以血管紧张素Ⅱ1型受体(AT1)阻断剂olmsartan和血管紧张素Ⅱ2型受体(AT2)阻断剂PD123319孵育细胞,再以prorenin刺激细胞,并用ERK1/2抑制剂PD98059和HRP(handle region peptide)干预。用免疫蛋白印迹方法(Western blotting)和酶标记免疫吸附测定方法(ELISA)测定目的蛋白水平,以逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法测定mRNA水平。结果:Prorenin作用于体外培养的HRMCs后,在阻断AT1和AT2受体时,能激活(P)RR使ERK1/2磷酸化增强、转化生长因子(TGF-β)水平增高。这种ERK1/2信号通路的激活是(P)RR激活后效应,并可被ERK1/2信号通道阻断剂PD98059阻断。HRP不能阻断(P)RR激活所致的ERK1/2磷酸化,不能使TGF-β表达降低。结论:在体外培养的HRMCs中,prorenin能够激活(P)RR,使ERK1/2信号通道活化导致TGF-β水平增高。而HRP不能阻断(P)RR激活后ERK1/2的磷酸化及TGF-β表达的增多。     

NF-κB活化在IL-1β诱导的小鼠肾小球系膜细胞表达IL-6中的作用

目的：研究NF-κB在rhIL-1β刺激引起的体外培养的鼠肾小球系膜细胞表达IL-6中的作用。方法： NF-κΒ活性检测采用电泳迁移率改变法(EMSA),IL-6 mRNA表达采用逆转录/聚合酶链反应(RT/PR)检测,培养上清IL-6蛋白含量采用ELISA检测。结果：rhIL-1β刺激肾小球系膜细胞时,在上调IL-6蛋白和基因表达的同时亦激活NF-κB,而且这种上调作用可被NF-κB特异性抑制剂PDTC所阻抑。结论： IL-1β诱导鼠肾小球系膜细胞表达IL-6是通过NF-κB调控,NF-κB可能参与肾小球肾炎的免疫炎症反应。     

曲格列汀诱导高糖条件下肾系膜细胞表达HO-1

目的:观察曲格列汀在高糖条件下对人肾系膜细胞(HRMCs)表达血红素氧合酶1(HO-1)的影响,并初步探讨其分子机制。方法:在正常浓度(5 mmol/L)葡萄糖及高糖(25 mmol/L)条件下培养HRMCs,分别加入1、5和10μmol/L曲格列汀作用8～24 h。随后用RT-qPCR以及Western blot分别检测HO-1的mRNA和蛋白表达,比色法测定HO-1酶活性。此外,采用荧光探针检测细胞内活性氧簇(ROS)的变化,Western blot检测Akt磷酸化水平和核转录因子E2相关因子2(Nrf2)的表达水平。结果:高糖条件下HRMCs中HO-1的表达以及酶活性水平轻微增高,而经1、5和10μmol/L曲格列汀作用后,HO-1的mRNA、蛋白表达以及酶活性显著增高(P0.05);同时,曲格列汀也能增加高糖条件下HRMCs的ROS水平并诱导Akt磷酸化,采用ROS清除剂NAC以及PI3K/Akt抑制剂LY294002处理后,HO-1的表达水平明显降低;此外,曲格列汀也可增强HRMCs核内转录因子Nrf2的表达,且NAC和LY294002能抑制曲格列汀诱导的Nrf2的表达。而沉默Nrf2后,曲格列汀诱导的HO-1表达减少。结论:曲格列汀可能能通过ROS和PI3K/Akt途径激活Nrf2而增加高糖条件下HRMCs表达HO-1。     

转化生长因子β介导高糖对系膜细胞生长的抑制作用

转化生长因子β介导高糖对系膜细胞生长的抑制作用南京金陵医院全军肾脏病研究所（南京２１０００２）姚建，黎磊石近来的研究表明：高糖抑制体外系膜细胞的增殖、刺激细胞外基质的产生。高糖的这些作用与转化生长因子β（ＴＧＦβ）对体外系膜细胞的作用相仿，因而推测Ｔ...     

氯沙坦通过ERK1/2 MAPK途径抑制高糖诱导小鼠系膜细胞CTGF表达

目的: 研究高糖环境下, 氯沙坦对CTGF的影响以及其作用机制.方法: 体外培养小鼠系膜细胞株(MMCs), 用高糖(25 mmol/L葡萄糖)刺激细胞分别作用24 h、 48 h、 72 h, 用Western blot方法检测磷酸化ERK1/2的表达.再将细胞分为低糖组(5.6 mmol/L葡萄糖), 山梨醇组(5.6 mmol/L葡萄糖+19.4 mmol/L山梨醇), 高糖组(25 mmol/L葡萄糖), 氯沙坦组(25 mmol/L葡萄糖+10-5 mol/L氯沙坦)以及 ERK抑制剂组(25 mmol/L葡萄糖+ 25 μmol/L PD98059), 48 h后采用Western blot方法检测磷酸化ERK1/2的表达, 72 h后采用Real-time PCR方法及Western blot分别检测 CTGF mRNA表达量以及蛋白的表达.结果: 高糖刺激小鼠系膜细胞后, ERK1/2磷酸化的蛋白表达逐渐增高, 呈现一定时间依赖性.与低糖组相比, 高糖组磷酸化ERK1/2、 CTGF的蛋白表达明显增加(P<0.01), 而与高糖组相比, 氯沙坦组以及ERK抑制剂组磷酸化ERK1/2的蛋白表达以及CTGF的蛋白均明显下降有统计学意义(P<0.05).与低糖组相比, 高糖组CTGF mRNA表达量明显增加(P<0.01), 而与高糖组相比, 氯沙坦组以及ERK抑制剂组CTGF mRNA表达量明显下降, 且有统计学意义(P<0.01).结论: 氯沙坦可抑制高糖对CTGF的诱导作用, 其机制可能与抑制ERK1/2 MAPK途径有关.     

高糖状态下脂多糖介导βtc6细胞自噬的机制

背景:作者团队前期证实糖尿病促进牙周炎的发生发展,而牙周炎是否促进糖尿病发展?目的:探索牙周炎促进糖尿病发展的分子机制.方法:体外培养小鼠胰岛素瘤βtc6细胞,分为对照组、葡萄糖组、脂多糖组、葡萄糖+脂多糖组,采用不同浓度葡萄糖(0,25,50,100 mmol/L)和脂多糖(0,10,20,40 mg/L)单独或联合...     

过表达THEM4抑制高糖诱导小鼠系膜细胞细胞外基质分泌

目的观察过表达硫酯酶超家族成员4(thioesterase superfamily member 4,THEM4)对高糖诱导的小鼠系膜细胞细胞外基质蛋白分泌的影响。方法体外培养小鼠系膜细胞,分别给予高糖(30 mmol/L)刺激0、6、12、24和48 h后收集细胞。提取RNA,RT-PCR技术检测THEM4 mRNA的表达;提取总蛋白,Western blot法检测THEM4、phospho-Akt(Ser 473)、TGF-β1、α-SMA的表达;ELISA法检测细胞上清液Ⅳ型胶原(collagenⅣ,ColⅣ)、纤维粘连蛋白(fibronectin,FN)的分泌情况。为进一步检测过表达THEM4对高糖诱导的细胞外基质沉积的影响及可能机制,将常规培养的系膜细胞随机分为正常对照组(5.5mmol/L)、高糖组(30 mmol/L)、高糖+p Yr-ads-4-THEM4质粒转染组(高糖+THEM4组)、高糖+p Yr-adshuttle-4空质粒对照组(高糖+V组)。后3组经高糖刺激48 h后终止培养并进行上述检测。结果随着高糖刺激时间的延长,小鼠系膜细胞THEM4表达呈下降趋势,phospho-Akt(Ser 473)、TGF-β1、α-SMA的表达增强,伴随细胞外基质蛋白(包括ColⅣ、FN)的分泌增加;过表达THEM4能逆转高糖刺激所导致小鼠系膜细胞Akt蛋白的活化,下调α-SMA、TGF-β1的表达,抑制细胞外基质蛋白(包括ColⅣ、FN)的分泌。结论过表达THEM4能降低高糖诱导的小鼠系膜细胞细胞外基质蛋白的分泌,可能是通过抑制Akt蛋白的活化,下调α-SMA、TGF-β1表达而实现。     

高糖诱导大鼠系膜细胞CTGFmRNA的表达及机制探讨

目的： 观察高糖状态对肾小球系膜细胞中p38丝裂原活化蛋白激酶（p38 MAPK）及其下游因子cAMP反应元件结合蛋白1（CREB1）的表达以及对系膜细胞结缔组织生长因子（CTGF）和细胞外基质蛋白表达的影响。方法: 体外培养大鼠肾小球系膜细胞,分别给予高糖和p38 MAPK抑制剂SB203580干预,采用Western印迹检测p38 MAPK和CREB1及其磷酸化蛋白(p-p38 MAPK、p-CREB1)的表达,半定量RT-PCR检测CTGF和纤维黏连蛋白（FN） mRNA的表达。放免法测定细胞上清液中层黏连接蛋白(LN)和IV型胶原的分泌含量。结果: 与低糖组和低糖加甘露醇组相比,高糖组系膜细胞p-p38 MAPK、p-CREB1表达明显上调,CTGF和FN mRNA的表达增加,细胞上清液中FN和IV型胶原含量增加。SB203580能够明显抑制高糖培养系膜细胞p38 MAPK和CREB1的磷酸化,下调CTGF和FN mRNA表达,抑制细胞上清LN和Ⅳ型胶原的分泌。结论: p38 MAPK信号途径可能参与高糖诱导的肾小球系膜细胞CTGF的表达和细胞外基质的分泌。     

高糖对人肾系膜细胞GSH-PX和PDGF-B表达影响及茶多酚干预作用

目的探讨高糖条件下系膜细胞氧化失衡与血小板源性生长因子—B（PDGF—B）表达之间的关系,通过抗氧化剂茶多酚证实氧化应激在早期糖尿病中的作用。方法将培养的系膜细胞分为正常对照组、高糖组、茶多酚对照组和茶多酚干预组,分别在0、12、24、36、48h采用分光光度法检测上清液还原型谷胱甘肽过氧化物酶（GSH—PX）活性,以及免疫细胞化学法和RT—PCR法检测0、12、36h的PDGF—B mRNA和蛋白的表达情况。结果①高糖条件下GSH—PX活性下降,抗氧化能力下降,氧化失平衡;茶多酚可增加抗氧化酶GSH—PX的活性。②高糖组系膜细胞PDGF—B mRNA和蛋白的表达比正常对照组均增加（P〈0．05）;茶多酚干预组比高糖组有明显下降（P〈0．05）。结论高糖能促进系膜细胞活性氧和PDGF—B的表达增加,茶多酚可抑制该作用。     

ROS介导TGF-β1诱导的大鼠系膜细胞纤维蛋白溶酶活性变化

目的:观察转化生长因子-β1(TGF-β1)对系膜细胞纤维蛋白溶解酶原激活物抑制物-1(PAI-1)表达和纤维蛋白溶酶活性的影响,并探讨反应性氧自由基(ROS)的作用。方法:以体外培养的大鼠系膜细胞为对象,应用TGF-β1刺激,部分实验中应用还原型谷胱甘肽消耗剂BSO或抗氧化剂NAC(N-acetylcysteine)进行干预处理。应用荧光素法测定细胞产生ROS量;应用Westernblot法检测PAI-1蛋白表达;应用RT-PCR和Northernblot检测PAI-1mRNA表达;应用合成的荧光素纤维蛋白溶解酶底物测定纤维蛋白溶解酶活性。结果:外源性TGF-β1可显著增加大鼠系膜细胞产生ROS,并上调细胞PAI-1蛋白和mRNA的表达以及降低纤维蛋白溶解酶活性;BSO可增强TGF-β1诱导的系膜细胞PAI-1mRNA的表达;而NAC可显著地逆转由TGF-β1诱导的PAI-1mRNA表达的上调和纤维蛋白溶解酶活性的下降。结论:TGF-β1可促使系膜细胞产生ROS,ROS作为信号传递分子介导了由TGF-β1诱导的系膜细胞PAI-1表达的上调和纤维蛋白溶解酶活性的下降。     

高糖培养人肾小球系膜细胞对TGF-β1、FN、Smad7表达的影响

目的:通过观察高糖对人肾小球系膜细胞(HMCs)转化生长因子-β1(TGF-β1)、纤维连接蛋白(FN)、Smad7表达的影响,探讨糖尿病肾病(DN)的发病机制。方法:将HMCs于高糖(30mmol/L)环境培养不同时间后,采用RT-PCR方法检测TGF-β1、FN、Smad7 mRNA表达,Western blotting检测Smad7蛋白的表达,采用ELISA检测TGF-β1、FN蛋白水平,同时以低糖培养作为对照组。结果:高糖培养24h、48h、72h后,TGF-β1 mRNA及蛋白的表达均较低糖培养对照组增加,在48h时达到高峰;FN mRNA及蛋白的表达亦较对照组增加,且呈时间依赖性;而Smad7 mRNA及蛋白表达下降。结论:TGF-β1/Smad信号转导途径负反馈调节Smad7蛋白的表达减少,可能是DN发病过程中的重要环节之一。     

依维莫司对高糖诱导肾小球系膜细胞凋亡的保护作用

目的:观察依维莫司对高糖诱导肾小球系膜细胞(HBZY-1)凋亡的保护作用,并探讨其意义。方法:将培养HBZY-1细胞按不同葡萄糖和依维莫司浓度分组处理72h后,用磺酰罗丹明B法测量细胞OD值,计算各组细胞存活率,用Annexin V和PI双标法检测各组细胞凋亡率。结果:30mM葡萄糖处理的细胞存活率明显降低,凋亡率明显增加(均P<0.05)。不同浓度依维莫司均能提高细胞存活率(均P<0.05),其中以200ng/ml依维莫司效果最好(P<0.05);200ng/ml依维莫司具有明显抗HBZY-1细胞凋亡作用。结论:依维莫司对高糖诱导HBZY-1细胞凋亡具有保护作用,从而为其治疗糖尿病肾病提供新的研究方向。     

NF-κB活化在IL-1β诱导的小鼠肾小球系膜细胞表达IL-6中的作用

目的:研究NF-κB在rhIL-1β刺激引起的体外培养的鼠肾小球系膜细胞表达IL-6中的作用。方法:NF-κΒ活性检测采用电泳迁移率改变法(EMSA),IL-6mRNA表达采用逆转录/聚合酶链反应(RT/PR)检测,培养上清IL-6蛋白含量采用ELISA检测。结果:rhIL-1β刺激肾小球系膜细胞时,在上调IL-6蛋白和基因表达的同时亦激活NF-κB,而且这种上调作用可被NF-κB特异性抑制剂PDTC所阻抑。结论:IL-1β诱导鼠肾小球系膜细胞表达IL-6是通过NF-κB调控,NF-κB可能参与肾小球肾炎的免疫炎症反应。     

Egr-1介导了IL-1β诱导的小鼠软骨细胞凋亡

目的:研究早期生长反应蛋白1(earlygrowthresponseprotein1,Egr-1)在白细胞介素1β(interleukin-1β,IL-1β)诱导的软骨细胞凋亡中的作用。方法:体外分离培养小鼠关节软骨细胞,用IL-1β刺激不同的时间后,用Hoechst33258染色,计算发生核皱缩细胞占全部细胞的比例;采用定量RT-PCR(qRT-PCR)方法检测Egr-1mRNA表达水平;采用Westernblotting方法检测Egr-1及激活型caspase-3蛋白的表达水平;采用LipofectamineRNAiMAX将Egr选择性干扰片段转染软骨细胞,采用qRT-PCR及Westernblotting观察RNA片段的干扰效率。结果:IL-1β刺激体外培养的软骨细胞4h、8h和12h后,分别引起约7%、22%和41%细胞凋亡,同时激活型caspase-3表达上调。IL-1β诱导软骨细胞凋亡的同时,Egr-1mRNA及蛋白质呈时间依赖的表达上调。2个siRNA片段成功干扰Egr-1表达后,细胞12h凋亡率从约40%下降到14%和12%,同时激活型caspase-3的表达被有效抑制。结论:Egr-1介导了IL-1β诱导的软骨细胞凋亡,可能在骨关节炎的发病过程中发挥重要作用。     

西格列汀对AGEs作用下系膜细胞自噬的影响

目的:探讨西格列汀对晚期糖基化终末产物(advanced glycation end products,AGEs)作用下系膜细胞细胞外基质和自噬相关蛋白表达的影响。方法:培养大鼠肾小球系膜细胞,共分5组,分别为正常对照(control)组、AGE组和不同浓度(5、10和20μmol/L)西格列汀组。培养48 h后采用MTT法测定细胞活力,采用ELISA法检测细胞培养上清胶原蛋白Ⅳ(collagen IV,Col IV)含量的变化。采用Western blot检测自噬相关蛋白beclin-1、腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine monophosphate-activated protein kinase,AMPK)、p-AMPK、p70S6K和p-p70S6K的蛋白水平。结果:与control组比较,AGEs可明显引起系膜细胞活力和Col IV表达增加,不同浓度的西格列汀均可明显抑制AGEs诱导的系膜细胞活力和Col IV表达的增加;与control组比较,AGEs可引起系膜细胞自噬相关蛋白beclin-1表达和AMPK磷酸化水平下降,p70S6K磷酸化水平增加;不同浓度的西格列汀均可促进系膜细胞自噬相关蛋白beclin-1表达及AMPK磷酸化,抑制p70S6K磷酸化,并呈一定的浓度依赖性。结论:西格列汀可能通过引起系膜细胞的自噬发挥肾脏保护作用。     

茶多酚对高糖所致人肾小球系膜细胞活性氧和TGF-β1表达的影响

目的 探讨高糖对人肾小球系膜细胞活性氧(ROS)和转化生长因子β1，(TGF-β1)表达的影响及茶多酚的干预作用。方法 培养人肾小球系膜细胞，分为正常对照组、高糖组、茶多酚组和茶多酚干预组，培养0、12、36h后，用分光光度比色法测定细胞上清液超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量，用半定量RT-PCR和免疫细胞化学法检测细胞内TGF-β1，mRNA和蛋白表达的变化。结果 高糖导致系膜细胞SOD活性下降和MDA含量升高，上调TGF-β1，mRNA和蛋白表达，随时间延长更为明显；茶多酚干预可拮抗高糖时系膜细胞的上述改变。结论 高糖能促进人肾小球系膜细胞ROS产生增加，上调TGF-β1 mRNA和蛋白表达，茶多酚能抑制高糖对系膜细胞的作用。     

PKC信号通路与醛糖还原酶对转化生长因子β1诱导人肾系膜细胞纤连蛋白表达的影响

目的 探讨PKC信号通路与醛糖还原酶在非高糖条件下对转化生长因子(TGF)-β1诱导人肾系膜细胞(HMC)细胞外基质成分纤连蛋白表达的影响.方法 应用醛糖还原酶抑制剂、PKC信号通路抑制剂G(O)6983、转染pcDNA3-醛糖还原酶及siRNA分别作用于人系膜细胞后,再用TGF-β1刺激,观察刺激前后人系膜细胞表达纤连蛋白的情况.Western blot检测系膜细胞内纤连蛋白和醛糖还原酶的变化,即时RT-PCR鉴定转染和干扰效果.结果 系膜细胞在TGF-β1作用后,醛糖还原酶和纤连蛋白表达升高;单独使用醛糖还原酶抑制剂并不能下调纤连蛋白的表达;但预先使用醛糖还原酶抑制剂孵育后,再用TGF-β1刺激,纤连蛋白表达减少为对照组的34%(P<0.05).单独使用PKC信号通路抑制剂并不能下调纤连蛋白的表达;用PKC信号通路抑制剂后,再用TGF-β1刺激,纤连蛋白表达下降为对照组的42%(P<0.05).预先使用醛糖还原酶抑制剂、PKC抑制剂孵育细胞后,再用TGF-β1刺激,纤连蛋白表达下降;转染pcDNA3-醛糖还原酶后,系膜细胞中醛糖还原酶mRNA表达增多超过10倍,纤连蛋白表达增加了2.5倍(P<0.05),再用TGF-β1刺激,纤连蛋白表达增加了3.6倍(P<0.05);转染siRNA后,系膜细胞中醛糖还原酶mRNA表达减少为对照组的20%,纤连蛋白表达减少为对照组的6%(P<0.01),即使再用TGF-β1刺激,纤连蛋白表达仍然下降,为对照组的12%(P<0.01).结论 醛糖还原酶基因参与了系膜细胞中TGF-β1诱导纤连蛋白表达过程的调控,这一过程可能与PKC信号通路的活化有关.     

人caspase-1基因在肝癌细胞中的表达及对IL-1β水平的影响

目的:将人caspase-1基因真核表达载体转染肝癌细胞后观察其表达水平及对IL-1β水平的影响,为研究cas-pase-1与IL-1β的关系及其在慢性炎症与肿瘤中的作用提供依据。方法:利用阳离子聚合物(jetPEI)将pIRES2-EGFP-caspase-1重组表达载体和pIRES2-EGFP对照载体转染人肝癌细胞HepG2(HepG2/caspase-1、HepG2/mock),48小时后倒置相差荧光显微镜下观察表达情况,利用RT-PCR、Western blot方法检测两组细胞caspase-1表达水平,采用caspase-1底物显色分析研究的方法检测两组细胞中caspase-1的活性。夹心ELISA法检测细胞培养上清以及细胞裂解液中IL-1β的表达水平。结果:转染48小时后倒置相差显微镜下可见,pIRES2-EGFP-caspase-1和pIRES2-EGFP重组表达载体均能在HepG2细胞中高效表达;HepG2/caspase-1细胞中caspase-1 mRNA表达水平显著提高;经LPS刺激后,HepG2/caspase-1细胞中caspase-1总蛋白的水平明显升高;caspase-1的生物活性水平与对照组相比具有显著性差异(t=25.679,P<0.05);HepG2/caspase-1细胞培养上清中IL-1β的水平明显高于HepG2/mock组细胞(t=3.417,P<0.05),胞浆裂解液中的变化相对不显著(t=2.396,P>0.05)。结论:人caspase-1基因真核表达载体pIRES2-EGFP-caspase-1能够在肝癌细胞中高效表达caspase-1,且该重组表达载体在HepG2细胞中能提高活性IL-1β的表达。     

AMPK在高糖诱导大鼠肾小球系膜细胞Ⅳ型胶原过度表达中的作用

目的 观察高糖环境下大鼠肾小球系膜细胞Ⅳ型胶原蛋白表达水平的变化,以及这种变化与AMP活化蛋白激酶（AMPK）的关系。方法 实验分4组：对照组（糖浓度5.6 mmol/L）,高糖组（22.0mmol/L）,低浓度5-氨基-4-甲酰胺咪唑核糖核苷酸（AICAR）组（0.5mmol/L AICAR+高糖）,高浓度AICAR组（1.0mmol/L AICAR+高糖）。孵育24h后,用RT-PCR法测定AMPKα1 mRNA水平,用Western blot法分别测定总AMPKα蛋白（AMPK）、磷酸化AMPKα蛋白（p-AMPK）和Ⅳ型胶原蛋白α5（COL4α5）亚单位的表达水平。结果 高糖组AMPKα1 mRNA水平低于对照组（p＜0.01）;高糖组总AMPKα蛋白和磷酸化AMPKα蛋白表达水平均低于对照组（p＜0.01）,高糖组COL4α5亚单位表达水平高于对照组（p＜0.01）;AMPK激活剂AICAR可在不同程度上纠正上述变化。结论 高糖环境下大鼠肾小球系膜细胞Ⅳ型胶原蛋白表达水平上调,这可能与AMPK表达下调及其活性降低有关。