CRISPR/Cas9基因编辑技术在心血管领域中的研究进展

CRISPR/Cas9基因编辑技术以其独特的优势已经在生物医学领域中被广泛应用。利用该技术在人类心血管疾病的相关研究如:心肌细胞水平、先天性心脏病动物模型建立、冠心病高危因素、心律失常、心力衰竭和心肌病等方面已经取得了很大进步,但目前的基因编辑技术在实际运用中仍然面临着许多问题。     

CRISPR/Cas9在免疫细胞基因编辑中的应用

CRISPR/Cas系统是最近几年才被发现的,它是基于RNA来控制细菌与古细菌中病毒与质粒的入侵.在有CRISPR/Cas免疫系统的原核生物基因中发现了短的重复序列和来自于CRISPR基因座的小RNA,它能引导Cas9蛋白去识别与降解入侵的核苷酸序列.目前,CRISPR/Cas9系统已迅速革新基因工程这片领域,让研究者可以相对轻松地改变多种生物的基因组,而且在免疫系统中能通过编辑免疫细胞达到缓解疾病的程度.     

CRISPR/Cas9技术研究进展

CRISPR/Cas9系统可以很容易的改写多种生物体的基因组,这一技术很快席卷了整个基因组工程领域.在此基础上的实验方法在各个领域都具有相当大的潜力.因而了解以CRISPR/Cas9为基础的基因功能研究,探讨这一技术开发新一代疾病模型的各种途径,疾病治疗以及基因调控等方面的研究进展很有必要.     

CRISPR / Cas9 基因编辑技术在肿瘤免疫治疗中的应用

近年来肿瘤免疫治疗因其显著疗效和创新性备受关注,是肿瘤治疗中最具有前景的研究方向之一。CRISPR基因编辑系统的发展以及其在多领域的延伸应用让研究者看到了它的巨大潜力,在肿瘤免疫治疗研究中也显示出广泛的应用前景。在过继性细胞治疗中,CRISPR/ Cas9 可对TCR-T 和CAR-T 细胞的内源性TCR 以及HLA-Ⅰ分子的基因进行敲除得到通用型效应细胞;在基于免疫检查点阻断的治疗中,其为免疫检查点的抑制和阻断提供了一种新的方法;同时在抗体靶向疗法中,CRISPR/ Cas9 技术在候选靶点筛选及简化抗体制备流程中有着重要应用。CRISPR 从各方面极大地推动了肿瘤免疫治疗的研究,本文将对CRISPR/ Cas9 基因编辑系统在肿瘤免疫治疗方面的应用进行介绍。     

CRISPR/Cas9基因编辑技术及其在肿瘤免疫治疗中的应用

正肿瘤的治疗依旧是医学上的难题,由于其发生发展复杂,往往伴随着免疫逃逸和免疫抑制性肿瘤微环境的形成,且肿瘤细胞易于扩散和迁移~([1])。因此,阻止肿瘤细胞的免疫逃逸是一项重要的治疗途径。肿瘤免疫治疗是指通过增强特异性免疫细胞对肿瘤的防御能力,并阻遏其他调节性免疫细胞对肿瘤的保护作用~([2]),从免疫防御的角度来控制肿瘤细胞     

CRISPR/Cas9基因编辑技术在蚊媒研究中的应用

蚊虫不仅吸血骚扰,而且传播多种疾病,迄今依然是世界性的严重的公共卫生问题。近年来,新型虫媒病不断出现,传统的虫媒病死灰复燃,给蚊媒控制带来了新的挑战。随着基因编辑技术的出现与发展,特别是成簇的规律间隔短回文重复序列系统(Clustered regularly interspaced palindromic repeats-CRISPR associated sequences 9, CRISPR/Cas9)的出现,为开展蚊虫生理、生化、发育、宿主与病原体关系等诸多方面分子生物基础研究提供了靶标特异性的修饰工具,给蚊媒控制技术的发展带来了新的契机。本文主要针对CRISPR/Cas9技术在蚊媒研究领域的应用现状及进展进行综述,并探讨CRISPR/Cas9技术在蚊媒传染病防治的实际应用中所面临的问题,为蚊媒防治措施的应用及改进提供理论参考。     

CRISPR质粒和同源重组模板的共转染可降低CRISPR/Cas9系统的基因编辑效率

目的探讨CRISPR质粒和同源重组模板的共转染对CRISPR/Cas9系统的基因编辑效率的影响以及可行的解决办法。方法用T7E1内切酶实验和RT-qPCR检测只转染CRISPR质粒组和质粒和模板共转染组细胞内Cas9的切割效率,Cas9 RNA和DNA水平的差异;RT-qPCR检测降低共转染的模板DNA的数量时,细胞内Cas9 DNA和RNA水平的变化;RT-qPCR和T7E1内切酶实验检测先转染CRISPR质粒后转染同源重组模板时,细胞内Cas9 DNA和RNA水平以及切割效率的变化。结果与只转染CRISPR质粒组相比,CRISPR质粒和同源重组模板的共转染显著降低了CRISPR质粒的转染效率(P0.001)和Cas9的切割效率(P0.001)。而先转染质粒后转染同源重组模板组和只转染质粒组在CRISPR质粒的转染效率和Cas9的切割效率差别无统计学意义。结论 CRISPR质粒和同源重组模板的共转染降低了CRISPR/Cas9系统的基因编辑效率,而先转染质粒后转染同源重组模板可以解决这一问题。     

基于CRISPR/Cas9系统高效编辑小鼠miR let-7a

目的 构建靶向小鼠miR let-7a的高效CRISPR/Cas9系统。方法 根据小鼠miR let-7a的两个编码位点let-7a-1和let-7a-2的编码序列各设计了两对dual-sgRNAs导向序列,通过sgRNA表达载体的构建、小鼠N2a细胞的共转染、药物筛选、阳性细胞PCR产物测序以及TA克隆测序分析等实验步骤完成了4对dual-sgRNAs导向序列的打靶效力分析。结果 所构建的4对打靶载体在细胞中发挥了作用,打靶位点均出现了碱基插入或缺失,药物筛选阳性细胞打靶位点RCR产物Sanger法测序峰图在4个靶点位置均有套峰出现。TA克隆测序结果表明本研究设计的4对dual-sgRNAs导向序列的打靶效率分别为42.10%、62.50%、52.63%和47.37%。结论 本研究所设计的4对dual-sgRNAs导向序列均可以有效介导Cas9蛋白切割小鼠miR let-7a,形成突变效应。为后续miR let-7a作用靶点的深入挖掘,阐明其发挥抑癌功能的作用机制提供了依据。     

利用CRISPR/Cas9系统构建水通道蛋白9基因敲除小鼠

目的 利用CRISPR/Cas9系统敲除小鼠水通道蛋白9(AQP-9)基因,构建稳定敲除AQP-9基因的纯合子AQP-9-/-小鼠.方法 根据CRISPR/Cas9靶点设计原则,在Ensembl数据库上找到AQP-9基因序列的外显子区域,综合分析选定AQP-9-202的公共外显子2,前期在其两边设计7个小向导RNA (...     

CRISPR/Cas9在人类疾病治疗中的研究进展

成簇规律间隔短回文重复序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR）/ CRISPR相关蛋白9（CRISPR-associated protein 9,Cas9）是利用向导RNA（guide RNA,gRNA）引导Cas9蛋白对靶...     

利用CRISPR/Cas9技术制备TCR V基因敲除小鼠

目的利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术建立TCR V基因敲除小鼠。方法针对Trbv13-3、Trbv19基因编码序列分别设计向导RNA(single guide RNA,sg RNA),制备相应质粒,将表达sg RNA和cas9蛋白的质粒用Lipo2000转染进小鼠成神经瘤细胞N2A中,通过药物筛选获得细胞库。经过单克隆测序检测细胞库中基因组的突变效率,筛选出效率最佳的sg RNA。体外转录获取sg RNA和Cas9 m RNA,进行小鼠受精卵的显微注射,提取出生的小鼠的基因组DNA进行测序鉴定。结果 6号小鼠Trbv13-3和Trbv19基因各有1个bp的增加和减少,形成移码突变,Trbv13-3和Trbv19基因的表达被破坏。结论成功构建出Trbv13-3和Trbv19基因敲除小鼠,为深入研究Trbv13-3和Trbv19基因与TCR谱系形成的关系提供了小鼠模型。     

CRISPR/Cas系统在抗菌治疗领域的研究进展

抗生素能够有效控制细菌感染,但随着抗生素的滥用与细菌适应,细菌耐药性问题日益严重,已对全球公共卫生与环境安全构成重大威胁[1]。削弱细菌的耐药性,防止出现多重耐药以及耐药性传播已经成为急需解决的问题。此外,传统的抗生素一般都是广谱类抗生素,在对致病菌进行灭杀时也会对其他有益菌造成一定的损害,长期使用可能会导致菌群失调并加剧细菌耐药[2]。     

应用CRISPR/Cas9系统构建Rev-erbβ基因敲除的HEK293细胞系

目的利用成簇的、规律间隔的短回文重复序列/Cas9核酸酶(CRISPR/Cas9)基因组编辑技术,构建Rev-erbβ基因敲除的HEK293细胞系。方法通过单向导RNA(sgRNA)介导Cas9蛋白对目的基因靶位点DNA进行特异性的切割,然后经DNA同源重组单向导RNA或非同源末端连接方式进行修复,以实现对Rev-erbβ基因进行敲入、敲除修饰操作的目的。首先,针对Rev-erbβ基因设计4个sgRNA,经筛选选择活性较高的sgRNA1及sgRNA2用于构建p CMV-h Cas9-U6-Rev-erbβsgRNA1sgRNA2串联载体。然后将p CMV-h Cas9-U6-Rev-erbβsgRNA1sgRNA2和p Ad-E1/hRev-erbβdonor质粒载体共转染至HEK293细胞,通过药物筛选、克隆化及序列测序获得整合有外源供体基因片段的一条链,另一条链为片段缺失的Rev-erbβ基因完全敲除的HEK293(Rev-erbβ-/-)细胞系。最后通过用Western blot法和实时定量PCR对敲除Rev-erbβHEK293细胞系(C3-6)进行检测。结果敲除Rev-erbβ基因的HEK293细胞系中均未检测到Rev-erbβmRNA和蛋白质的表达。结论利用CRISPR/Cas9技术,成功构建了基因定点修饰和敲除的Rev-erbβ-/-HEK293细胞系,为Rev-erbβ的功能和作用机制研究提供有效工具。     

CRISPR / Cas9 技术构建小鼠癌症模型的初步研究进展

<正>CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats)首次在K12大肠杆菌的碱性磷酸酶基因位点附近发现,后统一称为规律成簇间隔短回文重复序列,是在大多数细菌、古细菌中广泛存在的一类独特的DNA规律性重复序列~[1]。Cas(CRISPR-associated)基因是位于CRISPR区域临近处的蛋白质编码基因,而且相对保守。Cas基因可与CRISPR转录出的RNA结合并形成核糖核蛋白     

利用CRISPR/Cas9技术制备成对框基因2敲除小鼠

目的 利用成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）/重组CRISPR相关核酸酶9（Cas9）技术双切口法制备成对框基因2（Pax2）敲除小鼠,为探讨Pax2基因在多个系统发育的作用提供动物模型。方法 根据Pax2基因序列设计sgRNA,设计出的sgRNA和Cas9体外转录后显微注射到C57BL/6J 小鼠的受精卵中,F0代小鼠出生后取其基因DNA测序鉴定基因型。共获得8只F0 代小鼠,使敲除成功的F0代小鼠与野生C57BL/6J 小鼠交配,获得F1代小鼠,后均采用基因成功敲除的小鼠与C57BL/6J 小鼠进行交配,可获得稳定的Pax2基因敲除小鼠。结果 成功获得可稳定繁殖的Pax2杂合子基因敲除小鼠,其Pax2基因缺失1628 bp;组织HE染色显示,敲除小鼠的肾小球数量明显减少;Western blotting结果显示,敲除小鼠的肾皮质Pax2蛋白表达较野生型小鼠减少。结论 利用CRISPR/Cas9技术可成功构建Pax2杂合子基因敲除小鼠,为进一步研究Pax2基因的作用奠定基础。     

利用CRISPR/Cas9基因编辑靶向下调FGFR2缓解Apert综合征小鼠颅缝早闭

Apert综合征 (Apert Syndrome, AS) 是一类常染色体显性遗传疾病,主要表现为颅缝早闭、中面部发育不良、 并指 (趾)、智力发育障碍等,多由FGFR2分子功能增强型点突变引起。目前,此疾病主要靠手术矫形来恢复功能,其中大脑等病变部位手术难度大,难以实施,且通常需要多次手术。CRISPR/Cas9基因编辑技术在人类遗传病治疗中具有巨大潜力。本研究筛选到靶向FGFR2基因的gRNA,与Cas9经慢病毒包装后作用于Apert小鼠 (FGFR2^+/P253R) 的原代颅骨细胞、体外培养的颅骨以及活体小鼠颅骨中,可敲低FGFR2的表达,改善Apert原代颅骨细胞的分化程度。CRISPR/Cas9处理体外培养的颅骨及注射至 Apert 小鼠头颅,颅骨冠状缝早闭状态有效缓解,异常降低的颅骨骨量、骨密度等也显著改善,表明 CRISPR/Cas9基因编辑可缓解 Apert小鼠头颅异常。本研究为 Apert综合征的基因治疗提供了实验依据,有望为其它骨骼遗传病治疗提供新的策略与借鉴。     

应用CRISPR/Cas9系统构建敲除APE1基因的AC16心肌细胞株

目的应用CRISPR/Cas9系统构建敲除APE1基因的AC16心肌细胞株,为研究APE1在心肌细胞的功能提供研究基础。方法根据RISPR/Cas9靶向原理设计人APE1基因的导向RNA(sgRNA),构建sgRNA-LentiCRISPRV2重组质粒并转入293T细胞制备sgRNA-Cas9慢病毒;该病毒浸染AC16心肌细胞,嘌呤霉素筛选出阳性细胞并稀释至单克隆。免疫印迹法测定单克隆细胞中APE1蛋白表达。结果免疫印迹法检测的结果显示,筛选出的单克隆细胞的APE1蛋白表达完全缺失;PCR产物测序结果表明,靶向敲除APE1的心肌细胞,不存在sgRNA介导CRISPR-Cas9随机的核苷酸插入。结论应用CRISPR/Cas9系统成功构建了敲除APE1基因的AC16心肌细胞株。     

利用CRISPR/Cas9系统构建4T1细胞CXCR4基因敲除稳定细胞株

目的 利用CRISPR/Cas9系统敲除4T1细胞中的CXCR4基因,构建稳定敲除CXCR4基因的4T1细胞株。 方法 根据CRISPR/Cas9靶点设计原则,在美国国立生物技术信息中心（NCBI）上找到CXCR4基因序列的外显子区域,设计两条sgRNA,用LentiCRISPRv2作为载体构建LentiCRISPRv2-sgRNA重组质粒并转化至感受态的Stbl3菌体中,挑取单克隆测序验证并扩大培养提质粒后转染至293T细胞中包装成慢病毒。 收集病毒并感染4T1细胞,通过嘌呤霉素筛选并用有限稀释法分离培养出单克隆细胞。 提取筛选出的单克隆细胞基因组DNA并对敲除位点附近的DNA片段进行PCR扩增并测序;用Real-time PCR检测细胞株CXCR4基因mRNA表达情况;用免疫印迹法检测CXCR4蛋白质的表达情况。 结果 LentiCRISPRv2-sgRNA重组质粒构建成功;经过基因组DNA片段PCR扩增测序得1株缺失27 bp的稳定敲除CXCR4基因的细胞株;细胞株CXCR4mRNA的表达量低且几乎无CXCR4蛋白质的表达。 结论 通过CRISPR/Cas9系统获得靶向敲除CXCR4基因的重组质粒,并筛选出稳定敲除CXCR4基因的细胞株。