利用CRISPR/Cas9系统构建4T1细胞CXCR4基因敲除稳定细胞株

目的 利用CRISPR/Cas9系统敲除4T1细胞中的CXCR4基因,构建稳定敲除CXCR4基因的4T1细胞株。 方法 根据CRISPR/Cas9靶点设计原则,在美国国立生物技术信息中心（NCBI）上找到CXCR4基因序列的外显子区域,设计两条sgRNA,用LentiCRISPRv2作为载体构建LentiCRISPRv2-sgRNA重组质粒并转化至感受态的Stbl3菌体中,挑取单克隆测序验证并扩大培养提质粒后转染至293T细胞中包装成慢病毒。 收集病毒并感染4T1细胞,通过嘌呤霉素筛选并用有限稀释法分离培养出单克隆细胞。 提取筛选出的单克隆细胞基因组DNA并对敲除位点附近的DNA片段进行PCR扩增并测序;用Real-time PCR检测细胞株CXCR4基因mRNA表达情况;用免疫印迹法检测CXCR4蛋白质的表达情况。 结果 LentiCRISPRv2-sgRNA重组质粒构建成功;经过基因组DNA片段PCR扩增测序得1株缺失27 bp的稳定敲除CXCR4基因的细胞株;细胞株CXCR4mRNA的表达量低且几乎无CXCR4蛋白质的表达。 结论 通过CRISPR/Cas9系统获得靶向敲除CXCR4基因的重组质粒,并筛选出稳定敲除CXCR4基因的细胞株。     

利用CRISPR/Cas9系统构建水通道蛋白9基因敲除小鼠

目的 利用CRISPR/Cas9系统敲除小鼠水通道蛋白9(AQP-9)基因,构建稳定敲除AQP-9基因的纯合子AQP-9-/-小鼠.方法 根据CRISPR/Cas9靶点设计原则,在Ensembl数据库上找到AQP-9基因序列的外显子区域,综合分析选定AQP-9-202的公共外显子2,前期在其两边设计7个小向导RNA (...     

利用CRISPR/Cas9技术制备TCR V基因敲除小鼠

目的利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术建立TCR V基因敲除小鼠。方法针对Trbv13-3、Trbv19基因编码序列分别设计向导RNA(single guide RNA,sg RNA),制备相应质粒,将表达sg RNA和cas9蛋白的质粒用Lipo2000转染进小鼠成神经瘤细胞N2A中,通过药物筛选获得细胞库。经过单克隆测序检测细胞库中基因组的突变效率,筛选出效率最佳的sg RNA。体外转录获取sg RNA和Cas9 m RNA,进行小鼠受精卵的显微注射,提取出生的小鼠的基因组DNA进行测序鉴定。结果 6号小鼠Trbv13-3和Trbv19基因各有1个bp的增加和减少,形成移码突变,Trbv13-3和Trbv19基因的表达被破坏。结论成功构建出Trbv13-3和Trbv19基因敲除小鼠,为深入研究Trbv13-3和Trbv19基因与TCR谱系形成的关系提供了小鼠模型。     

利用CRISPR/Cas9技术构建DOC-1R基因敲除的HEK-293稳转细胞系

目的利用CRISPR/Cas9技术敲除人胚肾(human embryonic kidney cell,HEK-293)细胞中DOC-1R,构建DOC-1R敲除的HEK-293稳转细胞系,用于进一步讨论DOC-1R的生物学功能。方法根据CRISPR/Cas9设计原则,设计向导RNA(single-guide RNA,sgRNA),构建表达载体,对sgRNA测序并转染包装HEK-293T收集上清液测定病毒滴度。前期用Cas9-puro慢病毒感染HEK-293,用已制备的DOC-1R慢病毒感染稳转Cas9的HEK-293,72 h后显微镜下观察HEK-293表达红色荧光蛋白,并用Western blot检测HEK-293中DOC-1R的表达以确定沉默效果。结果测序显示插入的sgRNA序列正确,表达载体成功构建,显微镜下观察到,90%以上HEK-293表达红色荧光蛋白,HEK-293中DOC-1R蛋白表达减少,确定了DOC-1R敲除效果最明显的序列为GCCTACCTATGCTGGCAGCA。结论利用CRISPR/Cas9技术成功构建DOC-1R基因敲除的细胞系,为进一步研究该基因的功能奠定了基础。     

基于CRISPR/Cas9技术构建SETD2基因敲除鼻咽癌细胞株并分析其增殖特性

目的:基于CRISPR/Cas9技术构建SETD2基因敲除鼻咽癌(NPC)细胞株,并对该细胞株的增殖特性进行分析。方法:采用RT-PCR及Western blot检测永生化鼻咽黏膜细胞系NP-69及不同分化NPC细胞系CNE1、CNE2Z和C666-1中SETD2的表达情况,筛选出SETD2高表达细胞系CNE1。应用CRISPR/Cas9技术敲除CNE1细胞中的SETD2基因,筛选SETD2稳定敲除细胞株。采用CCK-8和平板集落形成实验分析SETD2基因敲除前后CNE1细胞的增殖能力,流式细胞术检测细胞周期的分布,Western blot检测细胞周期相关蛋白的表达。结果:与NP-69细胞相比,随着细胞分化程度的降低,SETD2在CNE1、CNE2Z和C666-1细胞中的表达逐渐下降(P 0. 01)。基于CRISPR/Cas9方法成功地从15个转染了小向导RNA(small guide RNA,sgRNA)的CNE1细胞单克隆中筛选出2个SETD2稳定敲除的细胞株CNE1-SETD2-KO-#5和#9。CCK-8及平板集落形成实验结果证实,相对于CNE1-WT细胞,CNE1-SETD2-KO-#5和#9细胞的增殖能力增强(P 0. 05);流式细胞术分析表明,CNE1-SETD2-KO-#5和#9细胞G1期减少而G2/M和S期均增加(P 0. 05); Western blot证实,SETD2敲除后增殖细胞核抗原(PCNA)、细胞周期素D1(cyclin D1)、cyclin B1、cyclin A2、cyclin E1、细胞周期素依赖性激酶2(CDK2)和CDK4表达增加,p21表达减少(P 0. 05)。结论:基于CRISPR/Ca9技术成功构建SETD2基因敲除NPC细胞株。NPC细胞中SETD2表达与细胞分化程度有关; SETD2表达缺失通过上调cyclin D1、cyclin B1、cyclin A2、cyclin E1、CDK2和CDK4并下调p21表达而促进细胞增殖。     

RNA靶向的CRISPR/CasRx系统在小鼠精原细胞系GC1-spg中的应用

目的 探究CRISPR/CasRx介导的RNA水平的基因敲降在小鼠精原细胞系GC1-spg的应用.方法 利用同源重组的方法构建EF1a core promoter.CasRx.SV40.U6.DRs表达质粒(CasRx-gRNA)和EF1a.EGFP、EF1a.mCherry、EF1a.tdToamto 3种荧光蛋白表...     

利用CRISPR / Cas9 技术构建Fbxw7 敲低的Raw264-7 稳定细胞株及其生理功能检测

目的:应用CRISPR/Cas9技术构建Fbxw7表达抑制的Raw264.7稳定巨噬细胞株,并检测其生理功能。方法:转染Fbxw7_Cas9KO质粒到Raw264.7细胞,用含嘌呤霉素的培养基培养,挑取单克隆并筛选带荧光标记的细胞进一步培养;然后采用qRT-PCR和Western blot分别检测Fbxw7基因与蛋白表达水平;Confocal进一步检测Fbxw7蛋白表达分布;测序分析基因突变情况;CCK-8和流式细胞术分别检测Fbxw7基因敲低后Raw264.7细胞增殖能力与凋亡率。结果:Fbxw7敲低组的mRNA和蛋白表达水平较正常Raw264.7细胞显著降低,Confocal观察发现敲低组Raw264.7细胞中Fbxw7蛋白表达微弱;测序结果显示Fbxw7敲低组存在多位点突变;Fbxw7敲低后Raw264.7细胞增殖能力明显降低,凋亡率增加。结论:利用CRISPR/Cas9技术可以实现Fbxw7基因在Raw264.7细胞稳定低表达,所筛选出的稳定细胞株可用于后续细胞水平的实验研究。     

利用CRISPR/Cas9技术制备成对框基因2敲除小鼠

目的 利用成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）/重组CRISPR相关核酸酶9（Cas9）技术双切口法制备成对框基因2（Pax2）敲除小鼠,为探讨Pax2基因在多个系统发育的作用提供动物模型。方法 根据Pax2基因序列设计sgRNA,设计出的sgRNA和Cas9体外转录后显微注射到C57BL/6J 小鼠的受精卵中,F0代小鼠出生后取其基因DNA测序鉴定基因型。共获得8只F0 代小鼠,使敲除成功的F0代小鼠与野生C57BL/6J 小鼠交配,获得F1代小鼠,后均采用基因成功敲除的小鼠与C57BL/6J 小鼠进行交配,可获得稳定的Pax2基因敲除小鼠。结果 成功获得可稳定繁殖的Pax2杂合子基因敲除小鼠,其Pax2基因缺失1628 bp;组织HE染色显示,敲除小鼠的肾小球数量明显减少;Western blotting结果显示,敲除小鼠的肾皮质Pax2蛋白表达较野生型小鼠减少。结论 利用CRISPR/Cas9技术可成功构建Pax2杂合子基因敲除小鼠,为进一步研究Pax2基因的作用奠定基础。     

利用CRISPR/Cas9技术构建22q-Enh3增强子元件敲除型A549稳定细胞系

目的 增强子元件敲除细胞系是探索增强子功能的理想细胞模型,为了探索位于22q12.2肺癌易感染色质区的增强子元件22q-Enh3的生物学功能,建立敲除22q-Enh3增强子元件的纯合细胞系.方法 利用CRISPR/Cas9(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/crispr-associated 9)基因敲除技术在非小细胞肺癌A549细胞系中敲除22q-Enh3增强子,并运用流式细胞术、细胞培养以及PCR技术筛选和鉴定敲除型克隆.结果 我们最终获得了3个敲除增强子元件22q-Enh3的纯合子细胞克隆.结论 本研究为进一步研究22q-Enh3增强子元件的生物学功能提供了细胞模型,并为应用CRISPR/Cas9基因敲除技术建立其他增强子元件敲除型纯合子细胞模型积累了宝贵经验.     

利用CRISPR/PITCH系统构建表达CSDE1-EGFP的B16细胞株

目的用新型CRISPR/PITCH系统构建表达CSDE1-EGFP的小鼠黑色素瘤B16细胞株,分选出低表达CSDE1与高表达CSDE1的B16细胞株,并进行功能探讨。方法用微同源介导的末端连接(MMEJ)方法将增强型绿色荧光蛋白(EGFP)编码序列插入到CSDE1基因最后一个外显子上;用流式细胞测量术、PCR、免疫荧光及活细胞成像来检测CSDE1-EGFP是否插入成功,检验EGFP的荧光强弱与CSDE1的表达高低是否一致;用Transwell小室法、小鼠荷瘤模型实验观察低表达CSDE1与高表达CSDE1的B16细胞株之间的功能差异。结果分选出低表达CSDE1与高表达CSDE1的B16细胞株,检测出EGFP表达强弱与CSDE1表达高低一致。观察到CSDE1蛋白表达量不同的B16细胞株在功能上有所差异。结论为研究CSDE1在其他肿瘤细胞内的动态定位以及因表达量不同而产生的功能差异,新型CRISPR/PITCH系统提供了快速有效的直观方法。     

应用CRISPR/Cas9系统构建敲除APE1基因的AC16心肌细胞株

目的应用CRISPR/Cas9系统构建敲除APE1基因的AC16心肌细胞株,为研究APE1在心肌细胞的功能提供研究基础。方法根据RISPR/Cas9靶向原理设计人APE1基因的导向RNA(sgRNA),构建sgRNA-LentiCRISPRV2重组质粒并转入293T细胞制备sgRNA-Cas9慢病毒;该病毒浸染AC16心肌细胞,嘌呤霉素筛选出阳性细胞并稀释至单克隆。免疫印迹法测定单克隆细胞中APE1蛋白表达。结果免疫印迹法检测的结果显示,筛选出的单克隆细胞的APE1蛋白表达完全缺失;PCR产物测序结果表明,靶向敲除APE1的心肌细胞,不存在sgRNA介导CRISPR-Cas9随机的核苷酸插入。结论应用CRISPR/Cas9系统成功构建了敲除APE1基因的AC16心肌细胞株。     

CRISPR/Cas9载体优化及CHD1L条件性敲除肝癌细胞系的构建

目的利用优化的pLV-Tet3G-CRISPR/Cas9载体系统构建条件性敲除CHD1L的QGY-7703肝癌细胞系,验证敲除效果及其对细胞生物学的影响,为研究CHD1L促肿瘤细胞恶性表型机制提供重要的细胞模型。方法用点突变方法优化pLV-Tet3G-Cas9载体以降低其脱靶效应,进而将Cas9改造成eSpCas9;其次,通过筛选获得稳定表达eSpCas9的QGY-7703细胞株;将mCherry基因插入载体pLVXhU6-SgRNA中,获得携带mCherry荧光基因的pLVX-mCherry-hU6-SgRNA载体;设计和筛选特异性靶向CHD1L的SgRNA序列,用重叠PCR方法获得hU6-CHD1L-SgRNA片段,筛选具有CHD1L切割活性的靶点,随后,将其克隆到pLVX-mCherry-hU6-SgRNA载体中;用293FT细胞进行病毒包装,获得慢病毒颗粒;转染7703eSpCas9细胞株,利用Western blot验证Dox诱导下的CHD1L敲除效果,划痕和Transwell实验检测Dox诱导的CHD1L敲除对肝癌细胞生物学功能的影响。结果 pLV-Tet3G-Cas9载体Cas9成功优化为eSpCas9序列;成功构建pLVX-mCherry-hU6-CHD1L-SgRNA载体;通过转染及筛选,获得Dox诱导的CHD1L敲除QGY-7703肝癌细胞系;细胞实验显示Dox可诱导eSpCas9表达,靶向性切割CHD1L,抑制QGY-7703细胞的迁移侵袭。结论成功构建Dox诱导的CHD1L敲除肝癌细胞株,此载体系统可为靶向肿瘤特异性基因研究提供细胞模型。     

CRISPR/Cas9技术研究进展

CRISPR/Cas9系统可以很容易的改写多种生物体的基因组,这一技术很快席卷了整个基因组工程领域.在此基础上的实验方法在各个领域都具有相当大的潜力.因而了解以CRISPR/Cas9为基础的基因功能研究,探讨这一技术开发新一代疾病模型的各种途径,疾病治疗以及基因调控等方面的研究进展很有必要.     

应用CRISPR/Cas9系统构建Rev-erbβ基因敲除的HEK293细胞系

目的利用成簇的、规律间隔的短回文重复序列/Cas9核酸酶(CRISPR/Cas9)基因组编辑技术,构建Rev-erbβ基因敲除的HEK293细胞系。方法通过单向导RNA(sgRNA)介导Cas9蛋白对目的基因靶位点DNA进行特异性的切割,然后经DNA同源重组单向导RNA或非同源末端连接方式进行修复,以实现对Rev-erbβ基因进行敲入、敲除修饰操作的目的。首先,针对Rev-erbβ基因设计4个sgRNA,经筛选选择活性较高的sgRNA1及sgRNA2用于构建p CMV-h Cas9-U6-Rev-erbβsgRNA1sgRNA2串联载体。然后将p CMV-h Cas9-U6-Rev-erbβsgRNA1sgRNA2和p Ad-E1/hRev-erbβdonor质粒载体共转染至HEK293细胞,通过药物筛选、克隆化及序列测序获得整合有外源供体基因片段的一条链,另一条链为片段缺失的Rev-erbβ基因完全敲除的HEK293(Rev-erbβ-/-)细胞系。最后通过用Western blot法和实时定量PCR对敲除Rev-erbβHEK293细胞系(C3-6)进行检测。结果敲除Rev-erbβ基因的HEK293细胞系中均未检测到Rev-erbβmRNA和蛋白质的表达。结论利用CRISPR/Cas9技术,成功构建了基因定点修饰和敲除的Rev-erbβ-/-HEK293细胞系,为Rev-erbβ的功能和作用机制研究提供有效工具。     

利用CRISPR/Cas9技术构建FARS2基因定点突变的大鼠模型

目的:利用CRISPR/Cas9技术构建FARS2基因特定位点突变的大鼠模型。方法:根据FARS2基因序列,设计FARS2基因特异性的单链向导RNA(sgRNA)引物序列并克隆入p U57-T7-GDNA载体。利用T7 RNA聚合酶体外转录sgRNA和Cas9 mRNA。将体外转录的sgRNA/Cas9 mRNA显微注射入SD大鼠受精卵,通过PCR和基因测序对FARS2基因特定位点突变进行检测和鉴定。繁育FARS2基因敲除大鼠并分析后代突变情况。结果:基因测序证实成功构建表达sgRNA载体,成功将sgRNA和Cas9 mRNA直接注射入大鼠受精卵。基因测序鉴定获得5只F0代初建鼠。DNA测序结果证实5号大鼠(ID#5)发生了gac tac突变,该突变并可遗传至子代大鼠。结论:利用CRISPR/Cas9技术成功制备FARS2基因定点突变的大鼠模型,为进一步研究FARS2的功能奠定了基础。     

CRISPR/Cas9结合Cre-loxP技术制备溴结构域蛋白4基因敲除小鼠

背景:目前CRISPR/Cas9结合Cre-loxP技术制备溴结构域蛋白4(bromodomain-containing protein 4,BRD4)基因敲除小鼠的实验方法非常少见.目的:运用CRISPR/Cas9技术敲除小鼠基因组中BRD4基因片段,构建BRD4基因敲除小鼠.方法:根据BRD4基因的外显子序列,设计...     

运用CRISPR/Cas9技术构建敲除体轴抑制蛋白1(AXIN1)基因的ACT-1人未分化甲状腺癌细胞系

目的构建体轴抑制蛋白1(AXIN1)基因敲除的ACT-1人未分化甲状腺癌单克隆细胞系。方法用分子克隆技术及成簇的规律间隔的短回文重复序列/Cas9核酸酶(CRISPR/Cas9)基因编辑技术构建AXIN1基因敲除的单克隆细胞系;采用实时荧光定量PCR检测ACT-1细胞的AXIN1 mRNA水平, Western blot法检测AXIN1蛋白水平。结果通过T7检测成功获得有效的两个单链导向RNA(sgRNA)Cr3及Cr5;通过酶切鉴定及测序成功构建携带绿色荧光蛋白(GFP)的靶向AXIN1的sgRNA病毒载体;成功获得包括阴性对照在内的4个单克隆ACT-1未分化甲状腺癌细胞系;敲除组细胞AXIN1 mRNA及蛋白水平均明显降低。结论采用CRISPR-Cas9技术成功建立了敲除AXIN1基因的ACT-1未分化甲状腺癌细胞系。     

核仁磷酸蛋白基因NPM1敲除人宫颈癌细胞株的构建及功能

目的通过CRISPR/Cas9系统定向敲除人类宫颈癌细胞(HELA)的核仁磷酸蛋白1基因(nucleophosmin1, NPM1),探讨敲除对HELA细胞生物学行为的影响。方法利用http://crispr.mit.edu sgRNA在线设计工具设计sgRNA,通过T7E1系统筛选合适的sgRNA,将设计好的质粒通过转染的方式转入HELA细胞株,通过博来霉素(zeocin)抗生素进行筛选,通过Western blot,PCR,基因测序等手段确认敲除细胞系的建立,通过免疫荧光的方式观察敲除细胞株。结果 T7E1酶切PCR退火产物之后琼脂糖凝胶结果表明,CRISPR/Cas9系统对HELA细胞基因组进行了切割,并在同源重组时发生了碱基错配;Western blot结果说明基因敲除后NPM1蛋白表达消失;基因测序的结果表明敲除细胞系建立的成功;免疫荧光的结果表明该细胞系出现异常核仁现象。结论 NPM1敲除后细胞核仁异常,可能影响细胞正常生命进程。     

CRISPR / Cas9 技术构建小鼠癌症模型的初步研究进展

<正>CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats)首次在K12大肠杆菌的碱性磷酸酶基因位点附近发现,后统一称为规律成簇间隔短回文重复序列,是在大多数细菌、古细菌中广泛存在的一类独特的DNA规律性重复序列~[1]。Cas(CRISPR-associated)基因是位于CRISPR区域临近处的蛋白质编码基因,而且相对保守。Cas基因可与CRISPR转录出的RNA结合并形成核糖核蛋白