应用人胚肺成纤维细胞MRC-5培养分离寨卡病毒研究

目的 应用人胚肺成纤维细胞MRC-5培养并分离鉴定寨卡病毒。 方法 收集寨卡病毒病确诊病例的精液样本并在MRC-5细胞中进行培养,观察致细胞病变效应（CPE）。 采用实时荧光PCR（real-time PCR）方法鉴定培养,同时对培养物进行序列测定和比对分析。 结果 病例精液样本经MRC-5细胞盲传3代,未观察到明显的特异性致CPE,MRC-5细胞3代培养物寨卡病毒经real-time PCR检测结果呈阳性。 毒株命名为Henan/001/2016,GenBank编号为MF593625,属于亚洲基因簇系。Henan/001/2016与Natal RGN株的亲缘关系最为接近,在E基因区段的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为99.7%和100%。 结论 MRC-5细胞适用于寨卡病毒的分离、培养和鉴定。      

浙江省湖州市诺如病毒GⅡ.17型变异株的全基因组序列分析

目的分析浙江省湖州市检出的诺如病毒GⅡ.17型变异株的基因序列和系统发育与进化关系,为国内诺如病毒的遗传进化研究提供序列参考。方法根据GⅡ.17型诺如病毒保守序列,自行设计3对引物,扩增覆盖整个基因组的3个重叠片段,对来自急性胃肠炎病例的一株诺如病毒GⅡ.17型毒株进行全基因序列测定和系统发育和进化分析。结果在2015年3月湖州市急性胃肠炎病例标本中分离鉴定出一株诺如病毒株GⅡ.17［P17］变异株（毒株编号:NS15217）,获得该病毒基因组全长7556 bp,编码3个开放阅读框（ORF）,ORF1长5109 bp（5～5113 nt）;ORF2长1623 bp（5094～6716 nt）;ORF3长780 bp（6716～7495 nt）。 湖州NS15217毒株在ORF1和ORF2中均属于GⅡ.17型基因型,且与LC037415.1/Hu/GⅡ.17/Kawasaki308和湖州MG692610毒株最接近。 在VP1结构域中有106个插入/缺失/替换的残基,13个（12.3%）在S区,30个（28.3%）位于P1区;大多数替换和插入是位于P2域,有63个氨基酸（59.4%）。结论湖州地区2015年分离的诺如病毒GⅡ.17型变异株进化分支属于3b簇。 其全基因组序列将有助于诺如病毒的遗传进化研究以及快速诊断试剂的研制。     

我国脑膜炎奈瑟菌中nalP基因的分布特征

目的 了解我国脑膜炎奈瑟菌（Nm）菌株的nalP基因分布特征,为其功能和作用机制研究提供依据。 方法 采用多位点序列分型方法对187株分离自我国的Nm菌株进行分子分型。利用菌株全基因组框架图获得nalP基因及其两侧序列,对基因序列进行同源性比对及聚类分析。 结果 178株Nm携带nalP基因;Nm中nalP基因与淋病奈瑟菌（Ng）中nalP基因的同源性为95% ~ 96%,但系统进化分析明显分为两支,两侧间隔区同源性＞85%。9株无nalP基因菌株中6株为?nalP2型,新发现3种排布方式。C群患者和健康携带者来源phase on菌株数差异有统计学意义。 结论 Nm中nalP基因可能由Ng获得后各自独立进化,无nalP基因菌株可能是nalP基因丢失,能够表达NalP的C群患者来源菌株可能缺失NalP的补偿机制。      

2012－2016年北京市朝阳区33株风疹病毒分离株基因特征分析

目的 通过对北京市朝阳区疑似风疹病例咽拭子标本进行细胞培养及基因特征分析,了解其分子流行病学特征。 方法 使用Vero/SLAM细胞对2012 — 2016年北京市朝阳区暴发和散发病例的风疹咽拭子标本进行病毒分离,应用反转录–聚合酶链式反应扩增风疹病毒E1基因序列,对扩增产物进行核苷酸序列测定。 使用分子生物信息学软件,将获得风疹病毒毒株核酸序列与世界卫生组织推荐风疹病毒13个基因型的32个参考毒株及16株中国部分省市流行株E1基因739个核苷酸序列进行系统发生树的构建及对比分析。 结果 共分离出33株风疹病毒毒株,其中8株为1E基因型,25株为2B基因型。 1E型风疹流行株分离自2012 — 2013年,2B型风疹流行株分离自2012 — 2016。 2B型流行株组内遗传距离及组间遗传距离均小于1E型流行株的组内遗传距离和组间遗传距离。 结论 2012 — 2016年北京市朝阳区风疹病毒流行优势株为2B基因型,1E基因型正在逐步被2B基因型代替。 2B基因型风疹流行株核酸序列更稳定,并逐渐成为优势基因型。      

2017年辽宁省人感染汉坦病毒G2片段基因序列特征分析

目的 了解2017年辽宁省肾综合征出血热（HFRS）患者感染汉坦病毒的（HV）的基因型别及变异情况。 方法 采集HFRS患者急性期血清,采用酶联免疫吸附试验筛选IgM抗体阳性标本,从阳性标本全血中提取HV的RNA,通过反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增G2基因片段并进行基因分型,对扩增产物进行核苷酸序列测定,利用DNAStar软件包分析。 结果 10份标本经RT-PCR提取扩增出的目的片段,4份为汉滩型（HTN型）,6份为汉城型（SEO型）。 扩增产物测序结果与已测得国内毒株及部分国际标准株比较,4份HTN型HV之间核苷酸同源性达到95.6% ~ 98.9%。 与HTN76–118株同源性最高,为89.3% ~ 90.1%,氨基酸同源性为98.4% ~ 99.2%。 6份SEO型HV间核苷酸同源性高达98.3% ~ 99.8%。 与80–39株同源性最高,为96.3% ~ 96.6%,推导氨基酸同源性为99.3% ~ 99.6%。 结论 辽宁省是以SEO型HV为主的SEO型和HTN型混合型疫区,病毒G2基因片段间高度同源,无明显变异,遗传物质相对稳定。      

浙江省啮齿动物携带心病毒的遗传特征研究

目的 了解我国浙江省的啮齿动物携带心病毒情况,并分析其遗传特征。方法 用反转录-聚合酶链反应选啮齿动物粪便标本中的心病毒,扩增其全基因组;利用Lasergene软件分别对多聚蛋白、P1蛋白、2C+3CD蛋白序列与GenBank下载的序列进行同源性分析;分析其基因组与多聚蛋白的特征;利用PhyML软件构建系统发生树。结果 浙江省啮齿动物携带心病毒。毒株Ruian-Rn93-1、Longquan-Aa3-1、Ruian-Rn93-3的多聚蛋白、P1以及2C+3CD蛋白与心病毒B的同源性分别为71.9%~85.4%、65.2%~89.8%与78.3%~95.4%,属于心病毒B;毒株Wencheng-Rn416的多聚蛋白、P1以及2C+3CD蛋白与Boone心病毒的同源性分别为92.5%、85.3%与96.9%,属于心病毒C。系统发生分析也表明毒株Ruian-Rn93-1、Longquan-Aa3-1、Ruian-Rn93-3与心病毒B的亲缘关系最近,Wencheng-Rn416与Boone心病毒的亲缘关系最近。系统发育分析发现啮齿动物在心病毒的起源与进化过程中起着重要的作用,并且可能发生跨种间传播而感染人。结论 我国浙江省啮齿动物携带心病毒,并可能跨种间传播到人。     

江西省赣州市两株冠状病毒的全基因组遗传特征分析

目的 分析江西省赣州市2株亚洲鼩鼱携带冠状病毒的全基因组遗传特征。方法 用反转录-聚合酶链式反应及RACE方法从亚洲鼩鼱粪便中扩增其全基因组;利用MegAlign软件进行序列同源性分析;利用phyML软件构建系统发育树。结果 全基因组的同源性分析表明毒株GZ01、GZ02与已知的亚洲鼩鼱携带冠状病毒的序列具有很高的同源性（88.6%~92.1%）。系统发育分析表明毒株GZ01、GZ02与上述序列有最近的亲缘关系。结论 赣州市亚洲鼩鼱携带属冠状病毒,与已知的毒株为同一种冠状病毒,系统发育分析发现亚洲鼩鼱在冠状病毒的起源与进化过程中起着重要作用。     

肠道病毒71型中国西安分离株全基因组核苷酸序列分析

目的 分析肠道病毒71型西安分离株（XA87-2008）全基因组核苷酸序列特征.方法 参考相关毒株序列,设计7对可重叠扩增全基因组的引物.提取一株2008年分离自西安市儿童医院手足口病病例标本的病毒基因组RNA,合成cDNA,进而扩增出7个目的片段,插入T载体克隆,对阳性克隆测序.利用MegAlign进行同源性分析,MEGA4软件进行进化分析.结果 XA87-2008毒株基因组全序7 414 bp,同源性分析与安徽阜阳2008年毒株高度同源,与其它基因亚型相差较大;进化分析显示其VP1区和全基因组序列均与C4基因亚型在同一进化支.结论 XA87-2008毒株为C4亚型,在进化关系上与近年来中国大陆流行株关系密切.     

云南新分离四株流行性乙型脑炎病毒全基因组序列特征研究

目的 对云南省2009年和2010年分离的4株流行性乙型脑炎(乙脑)病毒进行全基因组序列测定和分析,阐明近期乙脑病毒流行株的分子生物学特征及基因型。 方法 通过反转录-聚合酶链反应和核苷酸序列测定方法获得病毒全基因组序列,采用Clustal X、DNAstar和Mega等生物学软件进行核苷酸和推导氨基酸序列分析及系统进化分析。 结果 2009年和2010年在云南省中部和西部地区三带喙库蚊(Culex tritaeriorhynchus)中分离到4株乙脑病毒,其中YN09M57株基因组全长10 967 bp,DH10M865、DH10M978和DHL10M62株基因组全长均为10 965 bp,均编码3432个氨基酸。这4株病毒核苷酸和氨基酸同源性分别为98.3%～99.9%和99.5%～99.9%,与来自GenBank的7株基因Ⅰ型乙脑病毒核苷酸和氨基酸同源性分别为98.3%～99.9%和99.7%～99.9%;与基因Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ型参考株核苷酸和氨基酸同源性分别在78.7%～89.7%和91.4%～98.4%;与乙脑减毒活疫苗SA14-14-2株在E蛋白编码区有15个氨基酸位点差异,均位于抗原关键位点之外。基于E基因、全基因组系统进化分析显示云南4株乙脑病毒均为基因Ⅰ型,并形成2个进化分支,分别与相邻省份和东南亚流行株进化关系较近。 结论 云南新分离4株乙脑病毒属基因Ⅰ型,虽然它们之间及其与该型参考株核苷酸和氨基酸位点存在某些差异,但决定病毒毒力和抗原性的关键位点未见明显变化。本研究提示这些乙脑病毒流行株具有稳定的遗传特性和地域特征。     

2012－2016年广州市人感染恙虫病东方体基因型与流行病学特征分析

目的 了解广州市2012 — 2016年人感染恙虫病东方体的基因分型与流行病学特征。 方法 收集2012 — 2016年广州市临床诊断恙虫病患者全血,利用巢式聚合酶链式反应（PCR）扩增56 kDa型特异性抗原基因并测序,通过MEGA 5.0软件构建系统发生树并进行同源性分析。 结果 共收集到临床诊断恙虫病患者标本906份,其中220份经巢式PCR检测阳性（阳性率24.3%）,包括Karp型138株、Kato型29株、Gilliam型39株和TA763型13株,另有1株未确定型别。 两个发病高峰期为5 — 6月和9 — 10月,发病区域集中在从化区、增城区等农村地区。 结论 近年来广州市恙虫病东方体基因型呈现多样性,但以Karp型为主要流行型,需要加强对恙虫病东方体的分子流行病学监测分析工作。      

猪链球菌wzy基因与血清型别的相关性分析

目的 分析wzy基因序列与血清分型相关性,评价基于wzy基因的基因组水平血清分型的可行性。 方法 建立了33个已知血清型（1 ~ 31,33与1/2型）及21种新型cps型别（NCL1 ~ 20与Chz型）的wzy基因的氨基酸序列数据库,用来检索公开发表的767个有传统血清分型结果的基因组序列,以确定它们的分子血清型别,并与其用传统血清分型结果进行比对。 结果 767个基因组中,有765个基因组含有1种且仅含有1种数据库中的wzy基因,剩余的2个基因组携带数据库中没有的wzy基因,本研究中将其cps型别命名为NCL21。 94.13%（722/767）基因组的分子血清型别与其传统血清分型结果一致。 在二者结果有差异的基因组中,其cps基因簇的核苷酸序列与其传统血清分型结果相应的血清型标准菌株cps序列有明显的差异。 结论 基因组水平检测血清型特异性的wzy基因的分型策略,显著优于传统的血清分型方法。      

光滑假丝酵母菌和热带假丝酵母菌环境分离株的氟康唑敏感性与多位点序列分型分析

目的 分析分离自树叶、树皮和腐殖质的光滑假丝酵母菌和热带假丝酵母菌,对其进行耐药性分析和分子流行病学分型,比较环境分离株与临床分离株的进化关系,为流行病学调查及有效控制侵袭性假丝酵母菌感染提供理论支持。 方法 2017年9月采集云南省境内环境标本,分离培养提取菌株DNA进行转录间隔区测序鉴定;使用微量肉汤稀释法进行氟康唑药敏实验;采用多位点序列分型进行分子流行病学分型;利用eBURST分析菌株亲缘性。 结果 采集环境标本200份,分离光滑假丝酵母菌3株和热带假丝酵母菌10株。 13株环境分离株均对氟康唑敏感。 3株光滑假丝酵母菌的序列型均为ST3,10株热带假丝酵母菌被分为7个二倍体序列（DST）,包括4个新DST型（DST813 ~ DST816）。 eBURST分析显示,光滑假丝酵母菌均为CC3型,CC730是热带假丝酵母菌环境株的主要型别。 结论 环境分离株与临床分离株存在相同的起源株。 树叶、树皮或腐殖质中的光滑假丝酵母菌和热带假丝酵母菌可能对人类健康造成危害,是人类假丝酵母菌感染的潜在来源。      

中国莱姆病螺旋体菌株OppA2基因中人B细胞表位多态性分析

目的 研究中国莱姆病螺旋体菌株中OppA2基因及其人B细胞抗原表位区的序列多态性,了解不同地域OppA2的变化特征,为中国莱姆病的早期诊断提供线索和依据。 方法 选取59株莱姆病螺旋体分离株,PCR扩增其OppA2基因并测序后,结合3种基因型参考菌株序列,与免疫表位数据库（IEDB）中查询到的B细胞表位序列进行比对分析。 结果 中国莱姆病螺旋体中OppA2基因序列在Borrelia burgdorferi sensu strict（B.b.s.s）, Borrelia garinii（B.g）和Borrelia afzelii（B.a）3个基因型间存在明显的多态性。 但OppA2基因序列在B.b.s.s和B.a型内保守;在B.g型内存在异义突变。 B细胞表位改变主要发生在B.g基因型的亚簇2、亚簇3以及JC2-2分离株。 B.g基因型的亚簇2、亚簇3以及JC2-2菌株的296aa变异和亚簇3的295aa变异使3个B细胞抗原表位受影响;JC2-2菌株的372aa变异使1个B细胞抗原表位受影响;这些表位区的变异使部分B细胞表位序列（4/7,57.1%）呈现多态性。 结论 中国莱姆病螺旋体OppA2基因及其人B细胞抗原表位区在3个基因型间和B.g型内存在多态性;其中有3个B细胞抗原表位区（191～225aa、276～290aa和381～400aa）在B.b.s.s,B.g和B.a三种基因型内高度保守,可作为中国莱姆病早期诊断的候选抗原。      

一起单增李斯特菌引起新生儿败血症的溯源研究

目的 调查自贡市1例单核细胞增生性李斯特菌所引起的新生儿败血症病原学及流行病学特征,为防控提供参考。 方法 检测新生儿血液样本、产妇阴道及外阴拭子样本中的单增李斯特菌,采集该新生儿家庭住所的食品及环境样本、住所附近农贸市场的食品样本,检测样本中的单增李斯特菌,同时对产妇进行问卷调查;对分离到的单增李斯特菌进行血清型鉴定,并运用多位点序列分型（MLST）,脉冲场凝胶电泳（PFGE）技术研究菌株的同源性。 结果 从新生儿及其母亲样品中分离到7株单增李斯特菌、居住地附近的农贸市场凉拌熟食摊中分离到1株,8株菌株的血清型均为1/2b,ST型均为ST87型,PFGE带型相似度100%。 感染母亲与市场中污染凉拌熟肉的单增李斯特菌来自同一污染源,新生儿李斯特菌感染由母婴垂直传播导致。 结论 凉拌熟肉制品很可能是孕产妇单增李斯特菌感染的危险因素,需要在食品安全风险监测项目中重点监测。 围产期妇女单增李斯特菌感染的筛查应作为产妇产检的重要内容。      

土壤中军团菌污染状况调查研究

目的 了解土壤中军团菌的污染状况和分离菌株的分子型别、对抗生素的敏感性和细胞内的生长能力。 方法 采集北京市公共场所土壤样本123份,采用军团菌GVPC选择性培养基培养法和荧光定量PCR检测法对土壤中军团菌进行检测分析。用小鼠巨噬细胞J774细胞对分离菌株进行菌株致病性研究;用脉冲场凝胶电泳（PFGE）技术对分离菌株进行分型分析;用E-test试纸药敏实验法对分离菌株进行红霉素、阿奇霉素、利福平、左氧氟沙星、莫西沙星5种抗生素敏感性检测。 结果 荧光定量PCR检测法在花鸟市场和夏季水库样本中检出军团菌,检出阳性率分别为50.00%和24.24%,平板培养法仅在夏季水库样本中检出军团菌,阳性率为6.06%。 分离的2株军团菌TR1和TR2均为嗜肺军团菌,血清型分别为5型和8型。 2株嗜肺军团菌均具有较高的细胞内生长能力,PFGE分型显示2株菌为不同带型,药敏实验显示2株菌均对红霉素、阿奇霉素、利福平、左氧氟沙星、莫西沙星5种常用抗生素表现敏感性。 结论 公共场所土壤中可检出嗜肺军团菌,且分离株有较高的细胞内生长能力,提示具有致病性,存在导致军团菌病散发流行或暴发的危险,应加强对公共场所土壤中军团菌的监测。      

2013-2017年浙江省温州市产超广谱β-内酰胺酶沙门菌的血清型及耐药性分析

目的 研究2013 — 2017年温州地区产超广谱 β-内酰胺酶（ESBLs）沙门菌的血清型分布及耐药性,为临床病情的预防、诊断与治疗提供依据。 方法 对2013年1月 至2017年12月本单位及各区疾病预防控制中心上送的294株沙门菌菌株进行E-test定量法确认产ESBLs菌株的血清分型、药物敏感性及其流行病学特征分析。 结果 294株沙门菌筛查出产ESBLs菌株68株,检出率为 23.13%,共有3种血清型。 产ESBLs鼠伤寒沙门菌41株（60.29%,41/68）、产ESBLs肠炎沙门菌19株（27.94%,19/68）、产ESBLs德比沙门菌8株（11.76%,8/68）。 患者年龄以3 ~ 5岁幼儿（61.76%,42/68）和0 ~ 2岁婴儿（17.65%,12/68）为主。 而标本类型以肠道标本为主,占69.12%（47/68）,其次来源自血液,占30.88%（21/68）。 产ESBLs沙门菌对头孢吡肟、复方新诺明、四环素的耐药率分别为41.18%、52.94%和47.06%;未发现亚胺培南、环丙沙星、左氧氟沙星耐药株。 结论 产ESBLs沙门菌菌株传播较严重,主要血清型为鼠伤寒沙门菌,在婴幼儿中多见;产ESBLs沙门菌对抗生素耐药性不同,尤其头孢吡肟、复方新诺明、四环素等敏感性较差,临床上应加强多重耐药监控。      

2014－2017年烟台市腹泻病患者中致泻性大肠埃希菌的检测与病原特征分析

目的 了解烟台市腹泻病患者中致泻性大肠埃希菌（DEC）的感染状况和致病型分布特点，对社区和综合医院中两家哨点医院腹泻门诊的腹泻患者进行DEC监测，为DEC的防治提供依据。 方法 采用全自动毛细管电泳仪对生化反应符合DEC特征的菌落进行聚合酶链式反应确认，根据5种DEC特征基因，确定型别。 结果 在1 174例腹泻病患者的粪便中共检出生化反应鉴定为DEC的268株，进行基因确认25株，感染率为2.13%，其中肠聚集性大肠埃希菌（EAEC）15株，占阳性菌株的60.00%，肠产毒性大肠埃希菌8株、肠致病性大肠埃希菌2株、肠出血性大肠埃希菌和肠侵袭性大肠埃希菌均未检出，毒力基因pic占53.33%，20 ~ 44岁年龄组患者检出率最高（64.00%），6 — 10月检出率为84.00%。 结论 烟台市DEC感染的致病型以EAEC为主，基因型以pic为主，DEC感染年龄主要集中在20 ~ 44岁年龄组，全年均有感染，夏秋季多发，应注意加强季节性防控。