套式PCR检测滤纸干血滴中间日疟原虫

从滤纸干血滴上用Ｃｈｅｌｅｘ处理洗脱下的疟原虫ＤＮＡ,经套式ＰＣＲ扩增间日疟虫ＳＳＵｒＲＮＡ基因特异性１２１ｂｐ片段,分析该方法的敏感性和特异性。３７例血栓检测结果一部阳性,当原虫密度低全２５个原虫／ｕＬ血时仍可成功检测到该特异条带,且其它三种人疟原虫（恶性疟虫,三日疟原虫和卵疟原虫）血样均为阴性。提示滤纸干血滴与ＰＣＲ扩增技术相结合,是疟疾诊断或流行病学调查的实用工具。     

套式/多重PCR检测疟疾感染的应用研究

目的了解标签引物-套式/多重PCR技术在检测疟疾感染中的现场应用价值。方法随机采取我省疟疾流行区有发热症状的居民及家庭成员的耳垂血79份,同时制作厚血片和滤纸血样本各1份,用标签引物-套式/多重PCR检测所采集滤纸血样本中的疟原虫,并与镜检法进行比较。结果79份样本中,用标签引物-套式/多重PCR技术检出间日疟原虫阳性6例,镜检初检出10例间日疟原虫阳性,经复查血片后有4例排除了疟疾感染。镜检复核阳性的6例样本PCR均为阳性。以镜检复核为标准,两法阳性和阴性符合率为100%。结论标签引物-套式/多重PCR检测疟疾感染具高度敏感性和特异性,对疟疾鉴别诊断和明确诊断具有重要价值。     

间日疟原虫中国湖北分离株传播阻断疫苗候选抗原Pvs 28的基因多态性分析

从间日疟原虫感染患者血样制备的干滤纸片中提取寄生虫基因组DNA,以实验室Sall株的Pvs28基因序列设计合成特异性引物,以各分离株基因组DNA为模板,采用PCR技术扩增间日疟原虫传播阻断疫苗候选抗原Pvs28基因全长,其大小为696Bp的片段,将PCR产物直接测序.所获得的序列用Mac Vector软件分析并以Sall株为标准进行突变比较.结果表明,该Pvs28基因在核苷酸水平共存在两种突变形式,即3个点突变与5～7个不同数目的重复片段.点突变情况与我们以前的研究相同,但重复片段数目5和7与以前报道有差异.本文是对我国间日疟原虫单纯流行区湖北省疟原虫分离株传播阻断疫苗候选抗原Pvs28基因多态性的首次报导,研究结果为我国间日疟原虫传播阻断疫苗的实际开发与应用提供了必需的前提依据.     

粪便标本溶组织内阿米巴原虫Real-Time PCR检测方法的建立及初步评价∗

为建立粪便标本溶组织内阿米巴原虫Real-Time PCR检测方法,并评价该方法在临床粪便标本检测中的应用价值,本文基于溶组织内阿米巴原虫小亚基核糖体RNA(SSU rRNA)基因序列设计了特异性引物并使用Real-Time PCR方法对溶组织内阿米巴原虫标准株DNA进行扩增,以建立溶组织内阿米巴原虫感染的Real-T...     

环介导等温扩增技术检测间日疟原虫方法的建立及应用分析

目的建立一种快速、简便的检测间日疟原虫的环介导等温扩增方法（LAMP）并与常规PCR方法作比较。方法根据间日疟原虫环子孢子蛋白（CSP）基因序列合成2对特异性LAMP引物,优化Mg2＋浓度、dNTPs浓度、BstDNA聚合酶添加量、反应温度、时间以及设计引物缺省试验。评估优化后的LAMP反应的特异性和灵敏性。检测133份患者血样,以显微镜检方法为金标准,比较LAMP和多重PCR法检测间日疟原虫的敏感性和特异性。结果 LAMP法检测重组质粒DNA（Pv-rDNA）的灵敏度达到10-10,为传统PCR方法的100倍。镜检确诊的68例间日疟、43例恶性疟和22例非疟疾患者中,LAMP法和多重PCR检测间日疟原虫的敏感性为98.53%和97.06%,两法基本相当（χ2=0.34,P〉0.05）;特异性为86.15%和100%,LAMP法低于多重PCR法,差异有统计学意义（χ2=9.67,P〈0.05）。LAMP法的阳性预测值和阴性预测值分别为88.16%和98.25%,多重PCR的阳性预测值和阴性预测值分别为100%和97.01%。结论 LAMP法检测间日疟原虫具有快速简便、敏感性高、设备要求低的特点,具有较好的应用前景。     

重组酶介导恒温扩增技术检测疟原虫方法的建立?

本研究利用重组酶介导恒温扩增RAA技术，建立了一种快速检测疟原虫的方法。选取疟原虫18S rDNA序列，设计了检测疟原虫的通用引物，并对引物进行筛选和特异性检测。筛选出4组扩增效果较好的引物。该方法整个反应过程在37℃下进行，扩增时间短（40 min），并具有良好的特异性。结果表明，成功建立了一种检测疟原虫的RAA法，并且该方法适合于进出口岸疟原虫的快速检测。     

间日疟原虫SSUrDNA特定片段的体外扩增及鉴定

根据已知序列，设计出一对含克隆位点的寡聚核苷酸引物，用于间日疟原虫ＳＳＵｒＤＮＡ特定片段扩增；采用双温度点ＰＣＲ法，从我国间日疟患者血样ＤＮＡ抽提物中，直接扩增出预期大小片段（约６４０ｂｐ），而培养红内期恶性疟原虫株、人源利什曼原虫株，人源弓形虫株及正常人ＤＮＡ样本均无此扩增带出现。扩增片段进一步经限制性酶切和Ｎｏｒｔｈｅｒｎ印迹杂交分析，证实确为间日疟原虫ＳＳＵｒＤＮＡ目的片段。     

应用多聚酶链反应技术检测疟原虫的初步研究

根据编码恶性疟原虫(P．f)红细胞结合抗原(EBA-175)的部分DNA片段和间日疟原虫(P．v．)小亚基核糖体RNA基因序列设计合成恶性疟原虫和间日疟原虫的特异性引物各一对并进行多聚酶链反应(PCR)检测恶性疟和间日疟病人标本。扩增产物经琼脂糖电泳分析，可见在P．f.样本中扩增出特异的492bp大小的DNA片段，P．v．样本中扩增出特异的714bp大小的DNA片段。而在健康人血的白细胞、伯氏疟原虫样本和食触猴疟原虫样本中均不能扩增出以上片段。其结果与镜检符合率分别达95％和93.3％以上，表明该方法是一种特异、敏感的检测方法。     

直接PCR法检测血液中伊氏锥虫感染

为建立伊氏锥虫动基体DNA(KinetoplastDNA,kDNA)的PCR扩增技术,血液直接PCR法检测伊氏锥虫的感染,本文以伊氏锥虫kDNA片段为靶扩增DNA设计引物,确定最适PCR反应条件,建立kDNA片段的PCR扩增技术,应用直接扩增缓冲液(Ampdirect)从感染小鼠的滤纸血标本直接PCR检测伊氏锥虫。结果发现,PCR扩增伊氏锥虫kDNA片段分子量为364bp,能检测的最小DNA量是0·06pg,与布氏锥虫、活动锥虫没有交叉反应。应用直接扩增缓冲液不需进行样本的DNA抽提,直接PCR能检测感染小鼠的早期滤纸血样本,敏感性高于镜检法。本实验建立的直接PCR法检测伊氏锥虫具有较高的敏感性和特异性,方法快捷,可进一步应用于伊氏锥虫病的早期诊断以及现场调查。     

新孢子虫核酸检测方法的建立及应用评价

以新孢子虫Nc-5基因为目的基因,建立检测新孢子虫的PCR方法并初步应用。根据Gen Bank发布的新孢子虫Nc-5特异性基因序列设计引物,以新孢子虫基因组DNA为模板,利用梯度PCR法优化反应条件,建立PCR检测方法。以弓形虫、疟原虫、牛环形泰勒虫、包拉米虫和马尔太虫为模板进行扩增以验证建立方法的特异性。采用紫外分光光度计测定新孢子虫基因组DNA浓度和纯度,倍比稀释后的DNA进行PCR扩增,产物电泳分析确定建立方法的敏感性;选择高浓度和低浓度的新孢子虫基因组DNA重复检测3次,分析建立方法的重复性和稳定性。利用该方法对实验室建立的小鼠感染模型进行初步应用,评价建立方法的检测效果。结果成功建立新孢子虫的核酸扩增检测方法,扩增序列与Gen Bank(LN714476.1)中Nc-5基因序列一致性为100%,建立的新孢子虫核酸扩增检测方法与弓形虫、疟原虫、牛环形泰勒虫、包拉米虫和马尔太虫均无交叉反应,最低能检测新孢子虫DNA浓度为0.5788 pg/μL,应用该方法检测感染新孢子虫的BALB/c小鼠模型,可在肺和脑组织中检测到新孢子虫的感染。结果表明,建立的新孢子虫核酸扩增检测方法有效,并为后续研究奠定基础。     

恶性疟原虫已糖转运体编码基因的体外扩增及克隆

目的：体外扩增恶性疟原虫海南分离株的已糖转运体基因(PfHT1)，并将该基因克隆至pEGFF真核表达载体内使其高效表达，为研究DNA疫苗创造条件。方法：特定PCR引物的设计；恶性疟原虫FCC1／HN株的体外培养；提取基因组DNA；PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳分析；酶切、连接及PCR分析鉴定。结果：从恶性疟原虫簿南分离株基因组DNA中扩增出特异性的编码FfhTl的基因序列．片段太小为1516bp，克隆鉴定结果表明插人片段大小正确。结论：体外成功扩增出恶性疟原虫PfHTl编码序列，与预期长度相符，并成功构建pEGFF-Htl真核表达载体。为研究其结构、功能和免疫原性奠定基础，     

微量连续流动荧光法筛查新生儿葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症实验研究

目的研究微量连续流式荧光法测定滤纸干血样葡萄糖-6-磷酸脱氢酶,并评价其在新生儿葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症筛查中的应用价值。方法取直径3.2mm的新生儿滤纸干血样经萃取后用微量连续流动荧光分析仪测定葡萄糖-6-磷酸脱氢酶浓度,确定葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症的筛查阳性临界值。结果新生儿滤纸干血样经30～120min萃取后,葡萄糖-6-磷酸脱氢酶在0～150μM NADPH浓度范围内线性良好,最低检出限为2.0μM NADPH。批内变异度为5.4%,批间变异度为5.9%,测定平均回收率为99.2%,并与Perkin Elmer公司G6PD荧光定量法测定结果高度相关。142 847例新生儿滤纸干血样G6PD呈非正态分布,用95%百分位数法确定筛查新生儿G6PD缺乏症的临界值为G6PD小于42μM NADPH为阳性,葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症筛查阳性率为0.15%,发病率为0.038%。结论微量连续流式荧光分析法检测新生儿滤纸干血样葡萄糖-6-磷酸脱氢酶含量,具有灵敏度高、特异性强、重复性好的特点,为筛查新生儿葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症提供了简便、快速、费用低廉的实验方法。     

吉林省延边地区一例输入性卵形疟复发病例亚型鉴定及基因特征分析

为确诊一例输入性卵形疟复发病例并鉴定其亚型,采集已开始服用青蒿素哌喹片的输入性卵形疟复发病例患者静脉血,通过薄血膜涂片吉姆萨染色镜检查看其形态特征,采用巢式PCR方法扩增其18S rRNA特异性基因,鉴定其疟原虫种类,再通过基因测序进行同源性比对和遗传进化分析。薄血膜涂片吉姆萨染色镜检结果显示,该患者血液红细胞中疟原虫已开始萎缩破裂,形态不典型,巢式PCR检测为卵形疟原虫强阳性。基因序列分析显示其序列与NCBI GenBank卵形疟Curtisi亚型序列同源性达99%。     

应用甲基化特异性多重连接依赖性探针扩增和甲基化特异性PCR检测Prader-Willi综合征

目的比较甲基化特异性多重连接依赖性探针扩增和甲基化特异性PCR两种方法检测Prader–Willi综合征。方法应用细胞遗传学、甲基化特异性多重连接依赖性探针扩增和甲基化特异性PCR方法检测1个Prader–Willi综合征家系。结果甲基化特异性多重连接依赖性探针扩增和甲基化特异性PCR方法均能对患者进行检测,为缺失型致病,而其父母未见异常。结论甲基化特异性多重连接依赖性探针扩增方法检测Prader–Willi综合征比甲基化特异性PCR方法提供更多的致病信息。     

应用PCR法从血凝块和干血样品中检测基因突变

为适应流行病学调查,探讨从血凝块或干血样中提取DNA样品,应用PCR扩增DNA片段的方法技术极其必要。本文详细叙述了用人血凝块和干血样品提取DNA模板,通过固定、煮沸等步骤,可以应用多聚酶链反应体系得到目的基因的扩增片段,经电泳分离可以检测载脂蛋白的基因变异。本方法简便、省时、快速。     

自制免疫胶体金层析条检测恶性疟原虫的初步研究

目的：建立一种简易快速，适合于基层使用的自测式免疫胶体金层析（GICA）法用于恶性疟原虫的检测。方法：采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒，标记抗恶性疟原虫乳酸脱氢酶（LDHpf)单抗2A5，并以另外4株单抗作为包被抗体，制成诊断恶性疟原虫的免疫层析条，探索最佳配对模式及估计最低检测量，以镜检和PCR法为对照，用GICA条检测门诊“四热”病人血样，评价其敏感性和特异性，并对其稳定性进行了初步研究，结果：GICA检测重组LDHpf，最低检测量为1ng，以镜检法和PCR法为标准，GICA条检测恶性疟原虫的敏感性分别为88．37％和86．67％，GICA与镜检法的符合率均为91．55％，并且当虫体密度＞200个／μl时，GICA的敏感性为100％，GICA条在4℃下可保存3个月以上。结论：GICA检测恶性疟原虫简易快速，灵敏度高，无需特殊仪器设备，有望成为一种恶性疟原虫快速免疫诊断试剂盒。     

CLIP-PCR直接检测血液中疟原虫雌性配子体特异转录产物s25 mRNA

目的建立一种疟原虫雌性配子体的分子检测法。方法根据疟原虫雌性配子体特异性mRNA靶标(待测靶序列)即动合子表面蛋白(s25)的转录产物,设计特异性的捕获探针和连接探针。血液样品经裂解释放的mRNAs,无需核酸提取,通过"三明治"杂交被捕获到96孔板表面。洗去未结合探针后,将结合在mRNA靶标上的连接探针进行连接,得到两端为特殊设计序列的单链扩增模板。再用通用引物进行染料法qPCR扩增,或在端部设计TaqMan探针序列,用通用引物和通用TaqMan探针进行探针法qPCR扩增。评价这一基于捕获和连接扩增的方法(CLIP-PCR)的灵敏度、特异性和重复性并与普通的RT-qPCR方法进行比较,将其应用于临床样品的检测。结果该CLIP-PCR具有较高的灵敏度和特异性。与普通的RT-qPCR一样,均可检测低至11拷贝数的s25 mRNA靶标;而且该CLIP-PCR操作更简便。该CLIP-PCR可准确检测到疟疾患者血液中的雌性配子体。可将96个样品的检测时间缩短至3 h。结论建立了灵敏高效的染料法和通用TaqMan探针法CLIP-PCR检测疟原虫雌性配子体,为疟疾传播的控制、配子体大规模筛查奠定了基...     

抗恶性疟HRP-Ⅱ单链抗体的制备和初步应用

目的 对制备的可溶性抗ＨＲＰ－Ⅱ单链抗体进行初步应用研究。方法 对从抗恶性疟原虫红内期噬菌体抗体库中筛选到的能分泌特异性抗ＨＲＰ－Ⅱ单链抗体克隆株进行可溶性诱导表达,采用Ｄｉｐｓｔｉｃｋ－免疫胶体金模型,检测重组ＨＲＰ－Ⅱ和疟疾患者血样。结果 以该抗体包被的Ｄｉｐｓｔｉｃｋ层析条能特异性检测重组ＨＲＰ－Ⅱ抗原,并能与恶性疟患者血样中天然ＨＲＰ－Ⅱ抗原起阳性反应,最低检测抗原量为１ｎｇ／ｍｌ,敏感度     

同步扩增和鉴定中国人群 KIR基因有无的PCR-SSP方法的建立

目的探讨建立同步扩增中国人群全部KIR基因和鉴定KIR基因有无的序列特异性引物-聚合酶链反应(PCR-SSP)方法。方法选取2015年1月至2015年11月在深圳市血液中心无偿献血的132份健康受试者的血样为研究对象。基于中国人群精细水平KIR等位基因的多态性和单核苷酸多态性(SNP)信息, 参考IPD-KIR数据库, 设计KIR基因特异性引物用于扩增16种KIR基因及2DS4-Normal、2DS4-Deleted 2种亚型;并采用KIR基因型已知样本, 对每对PCR引物的特异性进行验证。在KIR基因的PCR扩增反应中, 复合扩增人体生长激素(HGH)基因片段作为内对照, 以防止PCR扩增出现假阴性结果。随机选取132份KIR基因型已知的健康受试者DNA样本进行盲检, 验证该方法的可靠性。结果本研究设计和筛选出的KIR特异性引物, 可鉴定相应的KIR基因, 而且内对照条带和特异性扩增条带均清晰、明亮;采用本研究建立的鉴定KIR基因有无的PCR-SSP方法检测纳入研究的132份样本的盲检结果, 与已知KIR基因型完全一致。结论本实验建立的KIR PCR-SSP方法, 鉴定中国人群KIR...     

基于LAMP技术建立解脲支原体基因试纸条检测方法

目的 建立一种灵敏度高、特异性强、检测速度快的方法检测解脲支原体.方法 基于环介导恒温扩增技术(LAMP),根据解脲支原体序列特征设计3对引物进行解脲支原体DNA切口酶核酸恒温扩增,扩增过程在一对引物中标记生物素,随着扩增的进行生物素直接引入扩增片段中,扩增结束后产物在密闭装置中进行免疫试纸条显色反应,根据显色卡的颜色判定结果的阴阳性.结果 该技术检测解脲支原体较实时荧光PCR技术灵敏度要高10倍以上,其它病原体检测均阴性该方法特异性与实时荧光PCR技术相当.结论 恒温扩增联合试纸条技术检测解脲支原体具有较高的敏感性和特异性,检测速度快,适合各医院开展.