羟基磷灰石纳米粒子增强脂质体介导的对HepG2细胞的基因转染效率及机制探讨

基因治疗的传统载体脂质体和病毒分别存在转染效率低和安全性差等缺点[1].而纳米颗粒具有小尺寸和表面黏附效应,其在基因治疗中有巨大优势[2].羟基磷灰石(HAP)作为动物与人骨骼的主要无机成分,具有良好的生物活性和相容性.我们研究了纳米尺寸下的羟基磷灰石对肝癌细胞HepG2的基因转染作用,现将结果报告如下.     

羟基磷灰石纳米粒子对人肝癌细胞增殖及细胞周期的作用研究

目的：研究羟基磷灰石(HAP)纳米粒子体外抗肝癌作用的机理。方法：采用形态学观察和MTT法检测HAP纳米粒子作用于人肝癌细胞系Bel-7402的量效和时效关系。流式细胞仪分析细胞周期的时相变化。结果：HAP纳米粒子在体外对人肝癌细胞系Bel-7402具有明显的抑制作用，并呈现良好的量效和时效关系。肝癌细胞的生长阻滞于G1期。结论：HAP纳米粒子具有体外抗肝癌作用，细胞增殖阻滞于G1期，阻断细胞周期的进展，导致癌细胞胀亡。     

NDRG2基因对结肠癌细胞SW620增殖和侵袭力的影响

目的 观察N-myc下游调节基因2(NDRG2)对结肠癌细胞SW620生长和侵袭能力的影响,并探讨其机制.方法 采用阳离子脂质体转染方法,分别将pcDNA3.1-NDRG2和siRNA-NDRG2转染入SW620细胞内,以空白组作为对照.Western blotting检测各组细胞NDRG2以及基质金属蛋白酶-2(MMP-2)的表达情况;细胞侵袭试验对各组细胞侵袭能力进行分析;四甲基偶氮唑蓝法对各组细胞生长曲线进行测定.结果 pcDNA3.1-NDRG2转染入SW620细胞后,NDRG2蛋白表达升高,而MMP-2蛋白表达降低;siRNA-NDRG2转染入SW620细胞后,NDRG2蛋白表达降低,而MMP-2蛋白表达升高.pcDNA3.1组的穿膜细胞数(56.20±7.40)及siRNA组穿膜细胞数(94.20 ±9.23)分别与对照组(75.80 ±4.82)相比,差异具有统计学意义(t=13.102,P=0.000;t=11.820,P=0.000).生长曲线显示,转染后第5天,pcDNA3.1组细胞吸光度值(0.46 ±0.01)及siRNA组细胞吸光度值(0.91 ±0.02)分别与对照组(0.67 ±0.01)相比,差异具有统计学意义(t=9.561,P=0.000;t=10.922,P=0.000).结论 NDRG2能降低结肠癌细胞SW620的侵袭和增殖能力,其机制可能与下调MMP-2的表达有关.     

羟基磷灰石纳米粒子对人肝癌细胞增殖及细胞周期的作用研究

目的研究羟基磷灰石 (HAP)纳米粒子体外抗肝癌作用的机理.方法采用形态学观察和MTT法检测HAP纳米粒子作用于人肝癌细胞系Bel-7402的量效和时效关系.流式细胞仪分析细胞周期的时相变化.结果HAP纳米粒子在体外对人肝癌细胞系Bel-7402具有明显的抑制作用,并呈现良好的量效和时效关系.肝癌细胞的生长阻滞于G1期.结论HAP纳米粒子具有体外抗肝癌作用,细胞增殖阻滞于G1期,阻断细胞周期的进展,导致癌细胞胀亡.     

AP-2α基因转染对人类结肠癌SW480细胞体外增生及侵袭能力的影响

目的 探讨AP-2α基因对人类结肠癌SW480细胞体外增生及侵袭能力的影响.方法 构建PODNA3.1(+)-AP-2α真核表达载体,利用脂质体介导pcDNA3.1(+)-AP-2α和pcDNA3.1(+)转染5W480细胞,并以正常SW480细胞作为空白对照;采用RT-PCR与Western blotting分别检测转染48 h后各组细胞中AP-2αmRNA与蛋白的表达情况;采用平板克隆、软琼脂克隆形成试验以及Transweil侵袭试验,分别检测各组细胞体外增生及侵袭能力.结果 SW480细胞内源性AP-2α蛋白表达缺失;转染AP-2α基因后,在SW480细胞中可检测到高水平的AP-2αmRNA及蛋白,细胞克隆形成率降低(P<0.05),软琼脂克隆体积小且数量少,细胞侵袭能力下降(P<0.05).结论 转染AP-2α基因可以抑制人类结肠癌SW480细胞的体外恶性增生以及侵袭能力.     

复方苦参水溶液体外对人结肠癌细胞SW480的影响

目的：探讨复方苦参水沉吟液体外对结肠癌细胞的影响。方法：应用〉ＴＴ法,生长曲线,荧光染法,流式细胞仪,透射电镜技术研究复方基参水溶液体外对ＳＷ４８０细胞的增殖抑制及诱导凋亡作用。结果：复方苦参疗溶液体外对ＳＷ４８０细胞有明显的抑制作用,而且这种抑制作用呈再浓度和时间的依赖性。３０ｍｇ／ｍｌ中药作用ＳＷ４８０细胞４８小时后,江镜及电莘下可见胞核固缩,荧光染色增强,胞核碎裂,凋亡小体形成等凋亡形态学变     

羟基磷灰石纳米粒子体外抗肝癌的实验研究

[目的]研究羟基磷灰石（HAP）纳米粒子对肝癌细胞和肝细胞的选择性作用。[方法]以细胞系Bel-7402人肝癌细胞和大鼠肝细胞为对象,倒置显微镜下观察细胞的生长状态,应用活细胞计数法绘制生长曲线。[结果]经HAP纳米粒子（1.4×10-4mol/L）作用的肝癌细胞与其对照组相比,细胞数量逐渐减少,胞质空泡样变,二者存在显著性差异（P<0.01）。而加入不同浓度HAP纳米粒子的肝细胞组,存活细胞数量明显增多,与对照组之间无明显差异。[结论]HAP纳米粒子有明显的体外抗肝癌作用,而对正常肝细胞影响轻微。     

羟基磷灰石纳米粒子对人白血病细胞K562毒性作用的研究

目的:探讨羟基磷灰石(HAP)纳米粒子体外抑制人白血病细胞K562的生长增殖作用.方法:采用MTT法检测HAP和联合应用化疗药物对K562细胞的增殖抑制及化疗增敏作用.结果:(1)HAP和抗癌药物对K562细胞增殖均有抑制作用;(2)K562细胞生长抑制率与HAP的浓度和作用时间呈明显正相关性;(3)HAP与化疗药物合用具有更良好的抑癌效果.结论:HAP纳米粒子明显抑制K562细胞生长,具有体外抗白血病作用和化疗增敏作用.     

羟基磷灰石纳米粒子对人白血病细胞K562毒性作用的研究

目的:探讨羟基磷灰石(HAP)纳米粒子体外抑制人白血病细胞K562的生长增殖作用。方法:采用MTT法检测HAP和联合应用化疗药物对K562细胞的增殖抑制及化疗增敏作用。结果:(1)HAP和抗癌药物对K562细胞增殖均有抑制作用;(2)K562细胞生长抑制率与HAP的浓度和作用时间呈明显正相关性;(3)HAP与化疗药物合用具有更良好的抑癌效果。结论:HAP纳米粒子明显抑制K562细胞生长,具有体外抗白血病作用和化疗增敏作用。     

前列腺素E2对结肠癌SW480细胞生物学行为的影响

目的 研究前列腺素E2(PGE2)对结肠癌SW480细胞黏附、迁移、侵袭能力的影响及其可能的分子机制.方法 分别使用外源性PGE2及其受体EP1的拮抗剂SC19220作用于SW480细胞后,MTr法测定肿瘤细胞黏附能力,transwell小室检测细胞迁移及侵袭能力,RT-PCR及Western blotting检测血管内皮生长因子(VEGF)mRNA和蛋白水平的改变.结果 外源性PGE2可以显著增加SW480细胞黏附、迁移及侵袭能力,PGE2作用于细胞后,黏附细胞A值由0.207±0.009增加至0.417±0.088,迁移细胞由6.33±0.33增加至43.33±0.88,侵袭细胞由3.67±0.34增加至26.33±0.89,差异均有统计学意义(P＜0.05).SC19220可抑制PGE2所诱导的SW480细胞黏附、迁移及侵袭,PGE2+SC19220组与PGE2组相比,黏附细胞A值由0.417±0.088下降至0.140±0.006,迁移细胞由43.33±0.88下降至28.00±0.58,侵袭细胞由26.33±0.89下降至5.67±0.33,差异均有统计学差异(P＜0.05).RT-PCR及Western blotting检测结果显示,PGE2作用后SW480细胞VEGFmRNA及蛋白水平表达增强,且表达量与PGE2浓度呈正相关.结论 PGE2可显著增加SW480细胞黏附、迁移及侵袭能力,其作用过程可能与VEGF表达上调相关.     

羟基磷灰石纳米粒子对HL-60细胞增殖抑制作用的研究

目的:探讨羟基磷灰石(HAP)纳米粒子对HL60细胞的生长抑制作用。方法:采用体外细胞培养和四甲基氮唑蓝(MTT)测定等方法。将不同浓度的HAP纳米粒子(0001~002)mg/mL分别加入HL60细胞培养液中,置37℃、5%CO2培养48h。结果:1)不同浓度HAP对HL60细胞增殖均可产生影响,在倒置显微镜下,可见全部测定孔细胞增殖均较对照孔低下,且呈明显量效关系。2)不同浓度HAP对HL60细胞生长抑制率呈明显正相关性,在浓度为10、50、100、150、200时,抑制率相应为1680、3920、5360、6420、7500。结论:HAP纳米粒子明显抑制HL60细胞生长,具有细胞毒和基因毒作用。HAP纳米粒子对白血病及肿瘤的治疗将具有良好的开发应用前景。     

羟基磷灰石纳米粒子对HL—60细胞增殖抑制作用的研究

目的：探讨羟基磷灰石(HAP)纳米粒子对HL-60细胞的生长抑制作用。方法：采用体外细胞培养和四甲基氮唑蓝(MTT)测定等方法。将不同浓度的HAP纳米粒子(0．001～0．02)mg／mL分别加入HL-60细胞培养液中，置37℃、5％CO2培养48h。结果：1)不同浓度HAP对HL-60细胞增殖均可产生影响，在倒置显微镜下，可见全部测定孔细胞增殖均较对照孔低下，且呈明显量效关系。2)不同浓度HAP对HL-60细胞生长抑制率呈明显正相关性，在浓度为1．0、5．0、10．0、15．0、20．0时，抑制率相应为16．80、39．20、53．60、64．20、75．00。结论：HAP纳米粒子明显抑制HL-60细胞生长，具有细胞毒和基因毒作用。HAP纳米粒子对白血病及肿瘤的治疗将具有良好的开发应用前景。     

Genistein联合5-FU对人结肠癌细胞株SW480增殖与凋亡的影响

目的:研究金雀异黄素(genistein)与5-FU对人结肠癌细胞株SW480增殖、凋亡的影响.方法:采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测不同浓度genistein和5-FU单用或联用对结肠癌细胞株SW480的抑制作用;脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(TUNEL)检测细胞凋亡情况,并在透射电镜下观察凋亡细胞超微结构的改变;流式细胞术(FCM)分析药物作用后细胞周期的改变.结果:1)genistein与5-FU单用均能抑制SW480细胞的增殖,存在浓度依赖性和时间依赖性.2)genistein与5-FU联合作用时对抑制SW480细胞增殖有协同相加效应,在两者联合作用48 h,浓度分别为80 μmol/L和30 μg/mL时协同作用最明显(CI=0.51).3)TUNEL技术观察到genistein与5-FU单用或双用均可引起SW480细胞凋亡,且以双药效果为著.4)电镜观察到凋亡细胞核电子密度增加,核碎裂,可见凋亡小体,以双药联用最为显著.5)FCM分析SW480细胞经genistein处理后细胞生长阻断于G2期,与5-FU作用机制不同.结论:genistein可通过诱导细胞凋亡协同5-FU对大肠癌细胞株SW480的杀伤作用,为提高化疗药对结肠癌的治疗疗效提供新思路.     

转染CD40L基因对结肠癌细胞增殖和侵袭的影响

目的:本研究通过将CD40L基因转染小鼠结肠癌colon26细胞,观察其对小鼠结肠癌细胞生物学特性的影响,以期探讨CD40L作为结肠癌基因治疗靶点的可行性.方法:经脂质体将CD40L基因转染小鼠结肠癌colon26细胞后,采用半定量RT-PCR法、Western印迹法和激光共聚焦显微镜检测CD40L mRNA及蛋白的表达情况,新型四氮唑盐MTS比色法检测CD40L基因转染对细胞生长的影响,FCM法检测其对细胞表面分子表达的影响,半定量RT-PCR法检测细胞中基质金属蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2,MMP-2)mRNA的表达情况,以及Transwell法检测细胞的侵袭能力变化.结果:RT-PCR检测结果显示,转染CD40L基因的小鼠结肠癌colon26细胞中CD40L mRNA的表达量为1.09±0.12,与转染空质粒细胞和未转染细胞相比,分别上调了59.21%和58.33%,差异有统计学意义(P＜0.05);而基因转染后colon26/CD40L细胞中MMP-2 mRNA水平降低.MTS法检测结果显示,colon26/CD40L细胞的生长速度与未转染细胞无明显变化.FCM法检测结果显示,colon26/CD40L细胞表面共刺激分子CD80和CD86水平升高.同时,Transwell实验结果显示,colon26/CD40L细胞侵袭能力下降(P＜0.05).结论:CD40L基因提高了结肠癌colon26细胞的免疫原性,降低了结肠癌细胞的侵袭能力,抑制了结肠癌细胞的恶性表型.     

p16基因转染对CNE-2细胞放射敏感性的研究

目的 探讨外源性p１６基因转染人鼻咽癌细胞系ＣＮＥ－２后对其放射敏感性的影响。方 法 通过体介导的基因转染方法将野生型p１６基因、空载全分别该基因突变的ＣＮＥ－２ 细胞中,同时设置不加任何质粒的ＣＮＥ－２细胞作为对照。３组细胞在相同的实验条件下,分别接受０,２,４,６,８Ｇｙ照射,经培养后计算细胞贴壁率再换算成存活率,按照多击单靶模型进行数学拟合,获存活曲线,求出Ｄo植等参数;利用流式细胞仪（ＦＣＭ）     

AnnexinI基因转染对BEP2D细胞生长的影响

研究ＡｎｎｅｘｉｎⅠ基因ｃＤＮＡ转染对生化人支气管细胞系ＢＥＰ２Ｄ生长的影响。方法：ｐＴ７Ｔ３Ｄ质粒经ＮｏｔⅠ和ＸｈｏⅠ双酶切获得 人ＡｎｎｅｘｉｎⅠ基因ｃＤＮＡ片段，亚克隆至真核表达载体ｐＣＩ－ｎｅｏ，构建人ＡｎｎｅｘｉｎⅠ基因真核表达载体ｐＣＩ－ＡＸＩ。通过采用脂质体介导转染技术，将ＡｎｎｅｘｉｎⅠ的真核表达重组质粒和空载体质粒分别导入永生化人支气管管细胞系ＢＥＰ２Ｄ；合成ＡｎｎｅｘｉⅠ反应寡     

p33ING1b基因对人结肠癌细胞SW480生物学行为的影响

目的:构建pcDNA3.1( )/p33ING1b真核表达载体及观察其对人结肠癌细胞SW480生长的影响。方法:构建人p33ING1b真核表达载体,采用脂质体转染方法,将pcDNA3.1( )/p33ING1b转染人结肠癌细胞系SW480,G418筛选,挑选阳性克隆,阳性克隆经RTPCR及Westernblot鉴定后,通过生长曲线和软琼脂克隆形成实验检测高表达p33ING1b基因的SW480细胞体外增殖情况,并用流式细胞仪分析细胞凋亡率的改变。结果:成功构建重组pcDNA3.1( )/p33ING1b基因的真核表达载体,建立高表达p33ING1b基因的SW480细胞系,p33ING1b基因在SW480细胞中高表达后,其生长速度减慢,细胞凋亡率(15.4±1.7)%较空载体组(2.0±0.6)%及未转染组(1.6±0.8)%明显升高。结论:p33ING1b基因高表达对SW480细胞系具有生长抑制和促进凋亡的作用。     

姜黄素诱导人结肠癌细胞株SW480凋亡及其bcl-2表达相关性研究

目的探讨姜黄素对人结肠癌细胞株SW480诱导凋亡的影响及其作用机制。方法5～50μM姜黄素分别处理SW480细胞6～48h后,MTT法检测细胞的生长活性,流式细胞仪检测细胞周期,TUNEL法检测细胞凋亡,免疫组化法检测细胞内bcl2蛋白表达水平。结果MTT显示姜黄素对SW480细胞具有细胞毒作用,呈时间浓度依赖性。FCM结果显示细胞周期中G0/G1期细胞比例增加,S期、G2/M期比例下降。TUNEL法显示凋亡细胞数增加,免疫组化结果显示bcl2基因表达明显减弱。结论姜黄素能抑制结肠癌SW480细胞的增殖并诱导细胞凋亡。其机制可能与干扰细胞周期及下调bcl2基因表达有关。     

胃泌素对大肠癌SW480细胞STAT3信号通路影响的研究

目的:初步探讨胃泌素是否通过STAT3信号通路调控大肠癌细胞的增殖,旨在明确胃泌素调控大肠癌细胞增殖的分子机制.方法:体外培养的SW480细胞同步化疗后加入各实验组药物培养72 h,流式细胞仪检测各组药物作用下细胞增殖指数的变化,RT-PCR方法检测各实验组细胞内STAT3 mRNA表达水平的变化.结果:5肽胃泌素组能通过上调STAT3 mRNA的表达而促进SW480的增殖,流式细胞术结果显示,胃泌素组细胞增殖指数为(37.54±5.17)%较对照组(27.72±5.00)%明显上升,P<0.05;在mRNA水平,胃泌素组SW480细胞STAT3 mRNA基因相对表达为(0.68±0.087)也显著高于对照组(0.44±0.047),P<0.05.结论:STAT3可能是胃泌素促进大肠癌增殖的一个下游靶点,胃泌素可能通过STAT3信号通路调控大肠癌的增殖.     

人突变p27基因转染对大肠癌SW480细胞黏附作用的影响

目的研究人突变p27基因p27mt对大肠癌细胞黏附作用的影响，探讨p27mt基因在大肠癌转移中的作用机制。方法用Ad—p27mt转染大肠癌细胞SW480，采用Westeill：Blot，检测p27mt在SW480中的表达。分别采用细胞计数法，MTT法检测p27mt对大肠癌细胞同质黏附作用和异质黏附作用的影响。结果转染Ad—p27mt SW480细胞转染后，同质黏附作用高于对照，异质黏附作用低于对照。结论上调p27mt基因的表达，可使大肠癌细胞间的同质黏附作用增强，异质黏附作用降低。因此，p27mt基因具有抑制大肠癌细胞转移的功能，其机制是改变了细胞基质及细胞间的黏附能力。