食管癌相关基因4在肝细胞肝癌中的表达和功能

目的了解人食管癌相关基因4（ ECRG4）在人肝细胞肝癌组织和肝癌细胞系中的表达情况,探讨ECRG4对肝癌细胞增殖、凋亡以及迁移能力的影响。方法提取24例配对肝细胞肝癌组织和癌旁肝组织的总RNA以及正常肝细胞系QSG7701和肝癌细胞系HepG2的总RNA和总蛋白,分别利用即时荧光定量PCR（ RT-qPCR）和Western blot法检测ECRG4的表达;构建ECRG4的真核表达质粒ECRG4-pcDNA3.1,转染肝癌细胞系HepG2,进行体外的细胞增殖、凋亡以及迁移实验。结果与癌旁肝组织相比,在肝细胞肝癌组织中ECRG4 mRNA表达下调或缺失（98.5％,23／24,P＜0.01）;和正常肝细胞系QSG7701相比,ECRG4 mRNA在肝癌细胞系HepG2中的表达明显下调（ P＜0.05）并且其蛋白表达水平也明显降低。转染ECRG4表达质粒后HepG2细胞的增殖和迁移能力明显低于对照组（P＜0.05）,细胞凋亡率明显高于对照组（P＜0.05）。结论 ECRG4在肝细胞肝癌中表达下调,在体外肝癌细胞系中过表达ECRG4可抑制细胞的增殖和迁移,促进细胞凋亡,ECRG4可能是肝细胞肝癌潜在的抑癌基因,有望为肝细胞肝癌分子靶向治疗提供新策略。     

细胞粘附分子CD15在肝癌组织中的表达

目的：观察细胞粘附分子ＣＤ１５在肝癌组织中的表达情况及肝脏良恶性病变的鉴别价值，方法：应用免疫组化ＳＰ法观察细胞粘附人子ＣＤ１５在７例正常肝组织，１３例肝硬变（５例伴轻－中度不典型增生）和４９例肝细胞癌组织中的表达。结果：正常肝组织和肝硬变组织中均无ＣＤ１５表达，仅肝癌组织中出现ＣＤ１５阳性表达，阳性率为３０．６％（１５／４９），ＣＤ１５表达与患者性别，年龄，肝癌肉眼形态，组织分化程度无明显关系（     

GRAMD4在肝细胞癌中的表达及临床意义

目的 检测GRAMD4在肝细胞癌中的表达情况,分析其与肝癌临床病理特征之间的相关性.方法 收集40例肝细胞癌及对应癌旁组织,运用RT-PCR、免疫组化技术检测GRAMD4在肝癌及对应癌旁组织中的表达情况,统计学分析GRAMD4mRNA表达与肝癌临床病理特征之间的相关性;应用RT-PCR技术检测人正常肝细胞LO2和肝癌细胞Hep3B、HepG2、SMMC-7721中GRAMD4 mRNA的表达.结果 GRAND4 mRNA及蛋白在肝癌组织中的表达显著高于对应的癌旁组织(P＜0.05);GRAMD4 mRNA的高表达与肿瘤体积增大、高Edmonson分级和高TNM分期呈明显正相关(P＜0.05);肝癌细胞株Hep3B、HepG2和SMMC-7721中GRAMD4 mRNA的表达较正常肝细胞LO2显著增加(P＜0.05).结论 肝癌细胞系及肝癌组织中GRAMD4表达上调,且GRAMD4的表达上调与肝癌的恶性病理特征相关.     

肝癌细胞中connexin32、connexin43的表达及其与间隙连接通讯功能的相关性

目的：研究肝细胞肝癌和正常肝细胞间隙连接蛋白connexin32（Cx32)、connexin43(Cx43）的表达，及其对间隙连接通讯功能（GJIC）的影响。方法：应用应用培养及流式细胞分析技术（FCM），研究肝癌细胞系HHCC、SMMC－7721和正常肝系QZG细胞中Cx32和Cx43的表达。结合Ｌucifer Yellow划痕标记荧光传输技术（SLDT），检测上述细胞的间隙连接通讯功能。结果：流式细胞仪分析证实，Cx32蛋白在肝癌细胞系HHCC、SMMC－7721和正常肝细胞系QZG细胞中表达的阳性率分别为1．9％、0．7％和99．0％；Cx43蛋白在HHCC、SMMC－7721和QZG细胞中表达的阳性率分别为7．3％、26．5％和99．1％。SLDT检测发现肝癌细胞HHCC，SMMC－7721的间隙连接通讯功能较正常肝细胞QZG明显减弱。结论；Cx3、Cx43蛋白在正常肝细胞中具有较高水平的表达，在肝癌细胞中表达水平显著降低，肝癌细胞的间隙连接通讯功能较正常肝细胞亦明显减弱。Cx32、Cx43表达调控异常引起的间隙连接通讯障碍可能与肝癌的发生密切相关。     

DNA错配修复基因甲基化在肝细胞癌发生发展中的作用

目的探讨DNA错配修复基因(MMR)hMLH1,hMSH2和hMSH3甲基化在肝细胞癌(HCC)发生发展中的作用。方法采用甲基化特异性聚合酶链反应(MSP)法对38例新鲜HCC组织,相应非肿瘤肝组织,2例正常的捐肝组织及6种肝癌细胞系的hMLH1,hMSH2和hMSH3基因启动子CpG岛甲基化进行检测;培养6种肝癌细胞系,MSP法检测加入5-aza-2‘-deoxycytidine前后hMSH2基因在HCC中的甲基化状态改变;逆转录．聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测加入5-aza-2’-deoxycytidine前后hMSH2在肝癌细胞株中的mRNA表达改变。结果HCC标本中13．2％(5／38)发生了hMLH1启动子甲基化,68．4％(26／38)发生了hMSH2启动子甲基化;相应的非肿瘤肝组织中hMLH1,hMSH2启动子甲基化阳性率分别为2．6％(1／38),55．3％(21／38);2例正常肝组织中未发现甲基化;6株肝癌细胞系中有5株发生了hMSH2启动子甲基化,而未发现有MLH1启动子甲基化。所有标本中均未发现有hMSH3启动子甲基化。5-aza-2‘-deoxycytidine处理细胞株后,可部分或完全逆转hMSH2启动子甲基化,各细胞株的mRNA均有不同程度的表达增加。结论hMSH3基因启动子CpG岛甲基化与HCC的发生发展关系不大。hMSH2基因甲基化与mRNA表达密切相关,是基因表达调节的一种重要方式。hMLH1和hMSH2基因启动子CpG岛的高甲基化在HCC中是一个常见的基因改变,DNA错配修复基因尤其是hMSH2基因启动子甲基化在HCC的发生中起了重要作用,是早期事件,其可能为临床诊断HCC提供新的检测指标。     

Fas Ligand转染人肝癌细胞株HepG2细胞后的生物学效应

目的：将FasL-peDNA3．1 hisB转染至人肝癌细胞株HepG2并检测其生物学效应。方法：转染采用脂质体转染方法，HepG2细胞FasL的表达采用免疫组化检测，培养液上清sFasL的检测采用EIA，细胞凋亡采用Annexin V／P1双染后双变量流式细胞仪检测及荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜观察。结果：转染后HepG2细胞FasL表达呈阳性，培养液上清检测出微量sFasL，转染后HepG2细胞与HepG2．2．15共同培养后，细胞凋亡率为36．30％，未转染FasL的对照组细胞凋亡率11．53％。结论：将FasLcDNA转染入肝癌细胞系HepG2，可使肝癌细胞发生细胞毒性T细胞（CTL）非依赖Fas-FasL介导的细胞凋亡。     

慢性肝脏疾病中CD3^-CD161^＋NK和CD3^＋CD161^＋NKT细胞亚群的变化研究

目的探讨CD3^-CD161^＋NK、CD3^＋CD161^＋NKT细胞在慢性肝炎／肝硬化及肝细胞癌患者肝脏组织及外周血中表达及意义。方法利用流式细胞仪对31例肝细胞癌患者、59例慢性肝炎／肝硬化患者肝脏组织及外周血、15例正常肝脏组织、48例正常人外周血中的CD3^-CD161^＋NK和CD3^＋CD161^＋NKT进行定量分析。结果慢性肝炎／肝硬化组CD3^-CD161^＋NK细胞[（13．4±1．3）％]和肝细胞癌癌周组CD3^-CD161^＋NK细胞[（16．7±4．8）％]及远离肝癌组的肝脏组织CD3^-CD161^＋NK细胞[（22．0±4．4）％]与正常肝脏组织CD3^＋CD161^＋NK细胞[（35．1±7．2）％]相比,肝细胞癌癌周肝脏组织内含量最低（t值分别为2．301、2．137、2．034,P〈0．05）;外周血中肝细胞癌组CD3^-CD161^＋NK细胞f（11．6±6．3％）]、CD3^＋CD161^＋NKT细胞[（14．7±6．2）％]与慢性肝炎／肝硬化组CD3^-CD161^＋NK细胞[（10．8±1．7）％]、CD3^＋CD161^＋NKT细胞[（12．5±0．8）％]、正常对照组CD3^＋CD161^＋NK细胞[（7．5±0．8）％]、CD3^-CD161^＋NKT细胞[（13．8±1．7）％]相比肝癌组CD3^-CD161^＋NKT细胞含量最高（t值分别为2．134,2．099,P〈0．05）,肝癌组CD3^＋CD161^＋NKT细胞含量最高（t值分别为2．125,2．154,P〈0．05）。结论由于NK细胞及NKT细胞数量减少或／和活性降低,使肿瘤细胞逃逸了免疫监视,可能促进了肿瘤的发生、发展及转移。     

Fbxw7在肝癌中的表达及与肝癌细胞增殖相关性研究

目的:探讨Fbxw7在肝癌中的表达及其与肝癌细胞增殖能力的相关性.方法:收集40例肝细胞癌组织及对应的癌旁组织,运用RT-PCR、免疫组化技术检测Fbxw7在肝癌及对应癌旁组织中的表达情况;real time RT-PCR技术检测正常肝细胞株LO2、肝癌细胞株Hep3B和SMMC-7721中Fbxw7mRNA的表达水平;平板克隆形成实验与裸鼠皮下成瘤实验检测不同Fbxw7 mRNA表达水平的细胞株体内外增殖能力.结果:Fbxw7 mRNA及蛋白在肝癌组织中表达水平显著低于对应癌旁组织(P＜0.05);Fbxw7蛋白低表达与高Edmonson分级和高TNM分期具有显著的相关性(P＜0.05);正常肝细胞株LO2中Fbxw7 mRNA的表达水平显著高于肝癌细胞株Hep3B和SMMC-7721 (P＜0.05);Fbxw7表达较低的细胞株形成的克隆数较多,且裸鼠皮下成瘤体积较大,结果均具有统计学差异(P＜0.05).结论:Fbxw7低表达与肝癌的恶性临床病理特征相关,并与肝癌细胞增殖能力相关.     

原发性肝细胞癌中肝干细胞标记物的检测

目的研究肝干细胞标记物在原发性肝细胞癌中的表达特征。方法45例原发性肝细胞癌手术切除标本经10％中性福尔马林固定、常规石蜡包埋,用免疫组化EliVision两步法检测AFP、GST-1T、CK19、c-kit单克隆抗体的表达。结果 c-kit、AFP、GST-π、CK19阳性率分别为13．3％（6／45）、53．3（24／45）、60．0％（27／35）、37．8％（17／45）;癌旁组织也不同程度表达肝干细胞标记;血anti-HBc阳性、癌组织AFP阳性患者癌组织CK19阳性率分别高于血anti-HBc阴性、癌组织AFP阴性患者。结论原发性肝细胞癌和癌旁组织中均有部分细胞表达肝干细胞标志,可能与肝细胞癌的发展有关。     

肝细胞癌中p504s的表达及临床意义

目的探讨p504s在肝细胞癌中的表达和意义。方法收集134例肝细胞癌、122癌旁肝组织以及44例正常肝组织,应用组织芯片仪制备600点阵的组织芯片,采用EnVision免疫组化染色法对组织芯片进行p504s标记,并分析其表达与临床病理参数间的关系。结果600个点阵的组织芯片实际有效率为98．5%（591／600）。p504s在正常肝组织、癌旁、肝细胞癌中表达的阳性率呈依次下降趋势,分别为90．2％（37／41）、80％（96／120）和48．8％（61／129）,其中肿瘤与癌旁,正常与肿瘤间比较差异有显著性（P〈0．05）。p504s表达与肿瘤大小、血管侵犯、临床病理分期、分级和是否伴肝硬化等无关。结论p504s在肝细胞癌的发生过程中具有一定作用,可能成为一种新的肝细胞癌标记物。     

转录因子EGR-3在肝细胞肝癌中的表达及意义

目的研究早期生长反应基因(EGR-3)在肝癌组织中的表达,并探讨其在肝癌发生发展中的作用。方法选取125例肝癌及癌旁组织、5例正常肝组织标本,采用免疫组织化学方法检测标本中EGR-3的表达分布,并分析其与肝癌临床病理因素的关系。另提取15例新鲜肝癌及相应癌旁组织标本和人肝癌HepG2、HepG2.2.15、SMMC7721、FHCC98细胞的总蛋白,采用蛋白质印迹法检测EGR-3的表达水平。结果①免疫组织化学检测结果显示,EGR-3在肝癌组织中的表达阳性率(30/125,24%)明显低于癌旁组织(100/125,80%)(χ2=72.5,P0.001);EGR-3主要表达于肝癌组织的细胞质中,而在癌旁组织的细胞质和细胞核均有表达;此外,EGR-3在肝癌组织中的表达强弱与患者年龄、性别以及肿瘤大小、肿瘤分化程度等均无明显相关性(P0.05);②蛋白质印迹技术检测结果也显示EGR-3在肝癌组织中的表达水平均明显低于相应癌旁组织(P0.05);EGR-3在4种肝癌细胞系中都有表达,并在HepG2.2.15细胞中表达水平最高。结论 EGR-3在肝癌组织中的表达明显低于癌旁组织,推测其与肝癌的发生密切相关,为肝癌的临床诊断提供了线索。     

LGR5在肝癌细胞及肝癌组织中的表达及意义

目的 探讨LGR5在4个肝癌细胞系、癌旁组织及肝癌组织中的表达,及在肝癌中的作用.方法 免疫印迹法及实时定量RT-PCR检测正常细胞和4种肝癌细胞中LGR5的表达;采用免疫组织化学检测36例肝癌及癌旁组织中LGR5及β-catenin的表达;利用免疫细胞化学检测HepG2细胞中LGR5的表达.结果 免疫印迹法及实时定量...     

HBx和CEACAM1在乙肝相关性肝癌中的表达及意义

目的:探讨HBx和癌胚抗原相关细胞黏附分子1(CEACAM1)在乙肝相关性肝癌中的表达及意义。方法:采用免疫组织化学方法(SP法)检测81例乙肝相关性肝癌组织中HBx及CEACAM1的表达情况,分析HBx和CEACAM1与乙肝相关性肝癌的临床病理特征。Western blot检测人正常肝细胞系QZG、肝癌细胞HepG2及稳定转染HBx的肝癌细胞HepG2(HepG2-X)中CEACAM1的表达。结果:81例乙肝相关性肝癌组织中HBx表达阳性率为74.07%(60/81),CEACAM1表达阳性率为71.60%(58/81),二者与门静脉侵袭、淋巴结转移和TNM分期存在显著相关,HBx与CEACAM1的表达呈负相关(rs=-0.310,P<0.01);在HepG2-X中,CEACAM1蛋白表达水平与肝癌细胞HepG2及人正常肝细胞系QZG相比显著降低。结论:HBx的高表达和CEACAM1的低表达与乙肝相关性肝癌的侵袭、转移密切相关,HBx有可能通过抑制CEACAM1的表达而诱导乙肝相关性肝癌的侵袭与转移。     

The role of N-acetylglucosaminyltransferases V in the malignancy of human hepatocellular carcinoma

To investigate the role of N-acetylglucosaminyltransferases V (GnT-V) in the malignancy of human hepatocellular carcinoma (HCC), the GnT-V stably suppressed cell line HepG2 GnT-V/1564 was constructed from HepG2. The proliferation, migration, invasion, metastasis of HepG2 GnT-V/1564 was investigated both in vitro and in vivo. The clinical pathological significance of GnT-V expression was also studied in 140 cases of HCC tissues. This study showed that down-regulation of GnT-V inhibited the proliferation, migration and invasion of the HepG2 cells. In addition, GnT-V expression was shown in 138 cases of 140 (98.6%) HCC samples, in 3 cases of 31 (9.7%) in liver cirrhosis cases and in 1 cases of 20 (5.0%) in normal liver tissues. Besides, a higher level of GnT-V was observed more frequently in the advanced tumors with higher T stage and histological grade. These data suggested that GnT-V expression was positively related with malignancy in HCC and GnT-V may be both a differentiation marker and a potential target for the treatment of HCC.     

非小细胞肺癌组织中MMP12、HMGB1的表达及其临床意义

目的：研究非小细胞肺癌中人巨噬细胞金属弹性蛋白酶（humanmacrophagemetalloelas-tase,HME,namelyMMP12）、高迁移率族蛋白B1（highmobilitygroupbox—B1,HMGB1）蛋白表达并探讨其与病理学分级、淋巴结转移等的关系,以及两者的相关性。方法：用免疫组化sP法分别检测53例非小细胞肺癌组织（其中肺鳞状细胞癌30例、肺腺癌23例）和20例癌旁组织中MMP12、HMGB1蛋白表达。结果：MMP12和HMGB1在非小细胞肺癌组织的阳性表达率分别为69．8％和5．4％,在癌旁组织中分别为15％和20％（P〈0．01）;肺鳞癌中MMP12阳性表达率86．6％高于腺癌组47．8％;MMP12和HMGB1表达在非小细胞肺癌中与淋巴结转移呈正相关（P〈0．05）;MMP12和HMGB1在非小细胞肺癌组织中表达成正相关（P〈0．01）。结论：MMP12和HMGB1可能在非小细胞肺癌患者的浸润、转移中起作用,联合检测有利于预后判断。     

靶向腺病毒载体介导的EGFP基因在甲胎蛋白阳性肝癌细胞的特异表达

目的：建立一种在甲胎蛋白(AFP)阳性的肝癌细胞中靶向表达目的基因的重组腺病毒载体。方法： 基于腺病毒载体Adeno-XTM Expression system,以300 bp AFP特异启动子替换穿梭质粒Pshuttle中CMV启动子，将增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因作为报告基因亚克隆至Pshuttle，HEK293细胞包装腺病毒，收集病毒后分别转染人正常肝脏LO2细胞，人肝癌HepG2细胞及HeLa细胞；通过Northern杂交检测EGFP基因在3种细胞中的转录水平，荧光显微镜下观察3种细胞中绿色荧光蛋白的表达。结果：Northern杂交显示，HepG2细胞中有大量EGFP基因的转录，而正常肝细胞LO2和HeLa细胞中仅能检测到微量基因的转录；荧光显微镜检测发现HepG2细胞内有强绿色荧光表达，而在LO2以及HeLa细胞内见极弱绿色荧光。 结论： 在AFP特异启动子作用下，腺病毒携带的目的基因在AFP阳性的肝癌细胞中得到显著转录和表达，而在非AFP阳性细胞仅微量转录，蛋白表达极弱。该腺病毒载体可作为AFP阳性的肝癌基因靶向治疗的适宜载体。     

AFP增强子驱动的HSV-TK/GCV自杀基因系统对肝癌细胞杀伤的实验研究

目的探讨人AFP增强子驱动的单纯疱疹病毒胸苷激酶/丙氧鸟苷（HSV-TK/GCV）自杀基因系统体外靶向杀伤肝癌细胞效应。方法构建人AFP增强子驱动的pAFP-CDNA3.1-TK自杀基因真核表达质粒,脂质体转染肝癌细胞,检测TK mRNA和蛋白表达,MTT法检测GCV对肝癌细胞的杀伤作用。结果成功构建pAFP-CDNA3.1-TK自杀基因真核表达质粒,在AFP阳性HepG2细胞中检测到TK mRNA和蛋白表达,添加GCV可特异性地杀伤HepG2细胞,而AFP阴性的SMMC7721细胞生长不受影响。结论 AFP增强子驱动的TK/GCV自杀基因系统可以靶向杀伤AFP阳性肝癌细胞。     

乙型肝炎病毒X蛋白对肝癌细胞生长的影响

目的探讨乙型肝炎病毒X蛋白（hepatitis Bvirus Xprotein，HBx）对肝癌细胞恶性程度的影响。方法构建携带HBV。基因真核表达载体pcDNA用Bx，以脂质体介导转染HepG2肝癌细胞，建立可稳定表达HBx的肝癌细胞系HepG2-HBx细胞，同时设空载体pcDNA，转染细胞HepG2-pcDNA，及未转染HepG2细胞为对照组。PCR法扩增Neo基因检测插入的质粒DNA片段．免疫荧光检测HBx的表达。通过生长曲线测定、平板克隆形成实验、MTr比色实验、Hoechst33342核形态学染色观察及流式细胞仪测定．了解稳定转染细胞的生物学行为变化。结果与对照组相比，转染pcDNA√IBx的HepG2-HBx细胞生长速度加快．其倍增时间缩短（28h对32．5h或34h，P〈0．05），克隆形成率增加[（10．12±0．23）％对（5．33±O．19）％或（5．19±0．28）％，P〈0．05]，细胞周期分析显示由GdG，期-S期的进程明显加快。细胞凋亡检测显示HepG2-HB。细胞可抵抗放线菌素D（ActD）诱导的凋亡作用。结论HBx可提高肝癌细胞的增殖活性，并增强肝癌细胞的抗凋亡能力．增加了肝癌细胞的恶性表型。     

HPV感染和p53异常表达与宫颈鳞癌的关系

目的研究宫颈鳞癌与p53蛋白表达和HPV感染的关系,探讨宫颈鳞癌的形成机制。方法采用RT-PCR法分别检测p53基因在39例宫颈鳞癌组织和39例正常宫颈黏膜组织中的表达情况以及PCR方法检测HPV在这些组织中的感染情况。结果 HPV在宫颈鳞癌组中阳性率为48.72%(19/39),正常组织中为14.81%(4/27),p53基因表达在宫颈鳞癌组中阳性率为53.85%(21/39),正常组织中为18.52%(5/27),宫颈癌组的HPV感染和p53表达均高于正常组(P0.05)。结论 HPV感染与p53基因的异常表达与宫颈鳞癌发生密切相关,联合检测能提高准确性。     

VEGF—C和MMP-2在直肠癌中的表达及意义

目的：研究血管内皮生成因子-C（VEGF—C）及基质金属蛋白酶-2（MMP-2）在直肠癌中的表达,探讨其与直肠癌浸润、转移的关系,以及两者的表达特征和内在联系。方法：应用免疫组织化学Elivision plus法检测96例直肠癌组织、癌旁组织及正常直肠组织中VEGF—C和MMP-2的表达情况。结果：VEGF—C和MMP-2在正常直肠组织表达率分别为2．1％和1．0％,在癌旁组织中表达为18．7％和21．8％,在直肠癌组织中表达为81．3％和79．2％。两者在直肠癌组织中表达率明显增高（P〈0．05）,且表达率的高低与淋巴结转移、分化程度、浸润程度密切相关（P〈0．05）。结论：VEGF—C和MMP-2在直肠癌中高表达且两者呈正相关,并与直肠癌侵袭和转移性有关,可作为预测直肠癌转移潜能的指标之一。