小鼠4-1BB特异性RNA干扰表达载体的构建及体外瞬时干扰效应的研究

目的 采用小片段RNA干扰(small interference RNA,siRNA)技术,通过构建系列小鼠4-1BB(m4-1BB)基因的特异性siRNA表达载体,体外观察对m4-1BB基因的瞬时沉默作用,筛选具有最佳干扰效果的siRNA表达载体.方法 设计并合成4条针对小鼠4-1BB全长特异性的siRNA寡核苷酸序列,插入真核表达载体(pENTRTM/U6 ),构建m4-1BB序列特异性siRNA 表达载体,根据靶位点分别命名为p336、394、498及763 siRNA,无关干扰质粒为pLacZ siRNA;通过体外m4-1BB真核表达质粒p4-1BB分别与各siRNA表达载体同时转染COS-7细胞,48h后通过RT-PCR和FACS(fluorescence-activated cell sorter,荧光活化细胞分选仪)观测COS-7细胞4-1BB mRNA及蛋白表达水平.结果经测序分析,各m4-1BB siRNA表达载体构建成功;其中p498 siRNA与p4-1BB双质粒转染COS-7 细胞,48h后可观察到细胞表面4-1BB分子明显下调,其胞内mRNA水平也显著降低,与无关干扰组比较,差异有统计学意义(P＜0.05).其余siRNA载体,几乎无干扰效应,与无关干扰组比较,差异无统计学意义(P＞0.05).结论我们所构建的p498 siRNA 真核表达载体,能明显干扰m4-1BB蛋白的瞬时表达,可望用于m4-1BB Lentivirus干扰表达系统的构建,进一步在小鼠原代T淋巴细胞内实现高效4-1BB表达沉默,以深入研究4-1BB对T淋巴细胞的生物学影响.     

共刺激分子4-1BB信号途径研究进展

共刺激分子4-1BB属于肿瘤坏死因子受体超家族的重要成员,主要表达在活化的CD4＋和CD8＋T细胞上。4-1BB介导的共刺激信号可增强T细胞的功能,提高T细胞对肿瘤细胞的监视和病毒感染的免疫防御作用。4-1BB信号途径还可诱导体内CD4＋T细胞介导的免疫耐受,阻止自身免疫性疾病的发生、发展。通过干预4-1BB信号途径的作用来调节淋巴细胞的免疫功能,有可能成为新的免疫治疗途径。     

共刺激分子4-1BB在强直性脊柱炎外周血淋巴细胞上的表达及其临床意义

目的 探讨强直性脊柱炎患者外周血淋巴细胞共刺激分子4-1BB的表达及其临床意义.方法 应用流式细胞术检测30例强直性脊柱炎患者及20例正常对照者淋巴细胞活化前后4-1BB蛋白的表达.结果 强直性脊柱炎患者淋巴细胞活化前后4-1BB的表达明显高于正常对照组(P<0.01),而且其表达的4-1BB水平与免疫球蛋白IgA呈正相关关系.结论 强直性脊柱炎患者淋巴细胞存在异常的4-1BB表达,这可能是导致强直性脊柱炎患者淋巴细胞活化和免疫反应发生的原因之一.     

小鼠髓系树突状细胞上4-1BB分子的功能性表达

目的 探讨小鼠髓系DC(CD8α-)中4-1BB的功能性表达。方法 采用免疫荧光标记和流式细胞仪检测DC上4-1BB分子的表达,用酶联免疫方法检测DC分泌的IL-2和IL-12。结果 小鼠髓系DC前体细胞中已有4-1BB分子表达,且随着DC的分化发育和成熟,其表达上调。激发型抗4-1BB分子的抗体2A刺激的DC分泌IL-2和IL-12能力增强,而2A抗体联合TNF-α刺激的DC分泌IL-2和IL-12的量明显高于两者单独刺激组(P<0.05)。结论 小鼠髓系DC表达的4-1BB具有功能性。     

4-1BB/4-1BBL在肿瘤免疫治疗中的作用

大量的实验研究表明,T细胞的活化需要两个信号的参与:一个是TCR接受抗原递呈细胞(antigen-presenting cells,APC)传导的MHC-抗原肽信号,另一个是细胞膜表面黏附分子提供的协同刺激信号(或称第二信号).缺乏第二信号,不仅不能使T细胞充分活化,反而会诱导T细胞无能或引发其程序性死亡[1].     

4-1BB/4-1BBL在自身免疫性心肌炎小鼠心肌中的表达及意义

目的:探讨4-1BB/4-1BBL在实验性自身免疫性心肌炎(EAM)小鼠心肌组织中的表达及意义。方法:将提纯的猪心肌肌球蛋白和完全弗氏佐剂等体积混合成乳浊液在1 d、8 d免疫具有遗传易感性的BALB/c小鼠,建立EAM模型。对照组小鼠仅用完全弗氏佐剂皮下注射。分别于初次免疫后21 d、80 d进行心肌炎症评分及血清cTnI测定,采用免疫荧光及RT-PCR技术检测4-1BB/4-1BBL在小鼠心肌组织中的表达。结果:在急性期21 d,模型组小鼠心肌组织见不同程度的急性炎性细胞浸润和心肌细胞变性坏死、cTnI水平高于对照组(P<0.05);80d模型组小鼠心肌组织炎症减弱伴有纤维化出现、cTnI较前期降低;免疫荧光见4-1BBL在模型组心肌中表达明显,在对照组小鼠心肌中少量表达(P<0.05);21 d模型组小鼠心肌组织中4-1BB/4-1BBL基因表达水平均高于对照组(P<0.01),80 d时表达仍然升高(P<0.01)。结论:4-1BB/4-1BBL在EAM小鼠心肌中的表达是上调的,4-1BB/4-1BBL通路参与了自身免疫性心肌炎的发生发展过程。     

共刺激分子4-1BB在T细胞活化效应中的作用

T细胞及其亚群的活化状态是细胞免疫检测的重要指标,也是临床评价多种免疫相关疫病的患者免疫状态的参考指标。本文拟对新近发现的一种T细胞共刺激分子的功能作一综述。     

4-1BBL/4-1BB信号对系统性红斑狼疮患者外周血淋巴细胞活化的影响

目的:探讨4-1BBL/4-1BB信号对系统性红斑狼疮(SLE)患者外周血淋巴细胞活化及共刺激分子表达的影响。方法:用CD3单抗刺激SLE患者外周血单个核细胞,并用抗4-1BBL单抗阻断4-1BBL/4-1BB共刺激信号,流式细胞术检测阻断前后T、B细胞上4-1BB、CD40L、4-1BBL、CD40以及CD69表达水平。结果:SLE患者T细胞上CD69表达明显高于正常对照组(P<0.01);SLE患者外周血T细胞上4-1BB、CD40L和B细胞上4-1BBL、CD40表达明显高于正常对照组(P<0.01),活化后T细胞上共刺激分子表达升高更加明显(P<0.01);抗4-1BBL单抗阻断后4-1BB、CD40L表达明显下降(P<0.01),B细胞上CD40表达下降,与SLE未活化组和活化组比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论:SLE患者外周血T、B细胞活化水平升高,4-1BBL/4-1BB信号对其活化状态维持可以起重要作用。     

4-1BB信号拮抗肿瘤上清诱导的树突状细胞凋亡及其机制

目的研究4-1BB信号对肿瘤上清诱导的小鼠骨髓来源树突状细胞（DCs）凋亡的拮抗作用及其机制。方法IL-4和GM-CSF诱导C57BL/6小鼠骨髓细胞,得到未成熟DCs,磁珠纯化。以抗4-1BB激发型抗体2A或CD40激发型抗体1c10刺激DCs,在不同条件下检测DCs的凋亡情况。以抗体标记NFκ-Bp65亚基,激光共聚焦显微镜检测抗4-1BB激发型抗体2A处理后DCs内NFκ-Bp65亚基向核内的转位情况。结果DCs上4-1BB信号的激发能拮抗由B-16肿瘤上清诱导的DCs凋亡,效果低于CD40信号,并能引起NFκ-Bp65亚基向核区转位。结论4-1BB信号的激发提高了DCs抵抗肿瘤上清诱导凋亡的能力,此作用通过包含NFκ-B通路的相关胞内信号传导途径实现。     

大鼠4-1BB基因shRNA表达质粒的构建、鉴定和筛选

目的为研究小干扰RNA（siRNA）在移植免疫、肿瘤防治等方面的应用,构建针对大鼠T细胞4-1BB基因编码区的短发夹RNA（shRNA）表达质粒。方法根据RNA干扰（RNAi）作用原理,设计、合成4条T细胞4-1BB基因的shRNA（shRNA441、shRNA540、shRNA621、shRNA758）DNA片段,插入质粒pGPU6,构建4个编码目的shRNA的表达质粒（p441、p540、p621、p758）,酶切及测序鉴定。设对照组,利用电穿孔法在体外将目的基因片段导入BN大鼠T细胞,48h后,逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）和流式细胞术（FCM）检测其对T细胞4-1BB基因表达的抑制作用,并筛选、确定最佳效果的干扰质粒。结果酶切及测序证实成功构建重组干扰质粒v441、p540、p621和p758,转染T细胞后,4-1BB相对表达量分别为（33．4±2．3）％、（53．0±2．3）％、（62．1±3．1）％、（40．9±1．5）％,对照组4-1BB相对表达量为（67．2±1．5）％。其中p441沉默效果最佳（P〈0．01）。结论siRNA具有抑制活化T细胞4-1BB基因表达的作用,干涉靶点具有选择性。     

人4-1BB转基因细胞的构建及体外生物学功能的研究

目的构建人共刺激分了4-1BB转基因细胞并探讨4-1BB的体外生物学功能。方法利用RT-PCR方法从人外周血淋巴细胞总RNA中克隆出人4-1BB基因，经双酶切装入逆转录病毒载体pGEZ-Term中，重组逆转录病毒载体4—1BB／pGEZ-Term与两个辅助病毒载体用脂质体法共转染包装细胞293T．用含有完整病毒颗粒的293T细胞的培养上清感染晕新铺板的293T细胞，加入Zeocin选择性培养基进行筛选。经RT-PCR、Western blot、流式细胞仪表型检测等方法鉴定转基因细胞。^3H-TdR掺入法分析转基因细胞对T细胞的作用；DCs培养过程中，加入转基因细胞与激发型CI40单抗5C11．流式细胞仪分析DCs表面分子CD80、CD83和CD86的表达。结果成功构建了能稳定表达人4-1BB蛋白的转基因细胞4-1BB／293T，该转基因细胞与T细胞共培养可抑制其体外增殖，可协同5C11促进DCs的体外成熟，上凋DCs表面分子CD80、CD83和CD86的表达。结论稳定表达4—1BB蛋白的转基因细胞株的建立为该基因功能的后续研究和单克隆抗体的研制奠定了基础。     

阻断4-BB/4-1BB配体信号通路对抑制大鼠肝脏移植免疫排斥反应的实验研究

Background Blocking the 4-1BB/4-1BB ligand （4-1BBL） signal may modulate the secretion of Th1/Th2 cytokines and prolong the survival of the grafts, which play a key role in organ transplantation tolerance. The aim of this study was to investigate the role of blockade of the 4-1BB/4-1BBL co-stimulatory pathway with 4-1BBL monoclonal antibody （mAB） in acute rejection of rat orthotopic liver transplantation. Methods The orthotopic liver transplantation model was set up, while male Lewis rats were used as liver donors and Brown-Norway rats as recipients. The recipient rats were intravenously injected with anti 4-1BBL mAB or isotype control antibody. Groups were monitored for graft survival after transplantation. Plasma chemistry, including aspartate transaminase （AST）, alanine aminotransferase （ALT）, and bilirubin （BIL）, was assayed. The concentrations of interleukin （IL）-2, IL-10 and interferon （IFN）-γ in plasma were also measured by enzyme-linked immunosorbent assay. Allograft histology images were collected under light microscope and electron microscope. Results Isotype antibody treated recipients exhibited elevated plasma levels of liver injury markers including AST, ALT and BIL, progressive portal and venous inflammation and cellular infiltration of the liver ailografts, and a mean graft survival time （MST） of 10.9 days. Administration of anti 4-1BBL mAB resulted in a decrease in plasma levels of liver injury markers and the concentrations of IL-2, IL-10 and IFN-γ. The histological grade of rejection on day 7 decreased and MST （17.3 days） increased substantially. Conclusions These results demonstrate that attenuation of acute rejection follows the blockade of the 4-1BB/4-1BBL co-stimulatory pathway with 4-1BBL monoclonal antibody and strongly suggest it is a promising strategy to prevent progression of graft rejection by suppressing T cell-mediated immunity.     

人4-1BBL胞外区蛋白的生物学活性研究

目的 研究人4-1BBL胞外区蛋白与4-1BB表达阳性细胞的结合与激活活性.方法 采用酶联免疫吸附分析人4-1BBL胞外区蛋白与A549细胞的结合活性,并进一步采用免疫组化分析人4-1BBL胞外区蛋白与4-1BB阳性细胞的结合活性,然后研究人4-1BBL胞外区蛋白对Jurkat细胞IL-2释放的影响.结果 4-1BBL胞外区蛋白能与4-1BB表达阳性的A549细胞系以及激活的Jurkat细胞特异性结合,并能维持激活的Jurkat细胞释放IL-2.结论 所获得的人4-1BBL胞外区蛋白具有结合与激活双重活性,在肿瘤及其他免疫性疾病的治疗中具有潜在的应用前景.     

激发型4-1BBL抗体促进原代急性髓细胞白血病细胞的增殖和MMP-9分泌

目的:研究共刺激分子4-1BBL分子逆向信号对原代急性髓细胞白血病细胞的促增殖作用及其生物学效应?方法:用流式细胞术(FCM)检测4-1BBL分子在26例初诊急性髓细胞白血病(AML)患者白血病细胞表面的表达,分离AML患者的白血病细胞并加入激发型4-1BBL抗体(1F1单抗)共培养,同时设置IgG1同型对照组,Alamar Blue法检测4-1BBL单抗1F1促AML原代细胞的增殖?收集培养细胞的上清液,用ELISA方法检测基质金属蛋白酶-9(MMP-9)的水平?结果:FCM测得初诊AML患者的白血病细胞上存在4-1BBL分子的表达,26例AML患者中4-1BBL分子的阳性表达率为46.15%;1F1单抗能明显促进4-1BBL+ -AML细胞的生长,4-1BBL+ -AML组刺激指数明显高于4-1BBL- -AML组(P < 0.01)?1F1与4-1BBL+ -AML细胞共培养48 h后,用ELISA法检测其上清液中MMP-9含量显著高于IgG1同型对照组[(965.06 ± 229.94) vs (596.49 ± 129.28) pg/ml,P < 0.01],而4-1BBL- -AML组的MMP-9与IgG1组无显著差异(P > 0.05)?结论:部分AML患者的白血病细胞可以表达4-1BBL分子,1F1单抗与AML细胞上4-1BBL分子交联后,可以促进AML细胞的生长,同时促进MMP-9的分泌?