肝细胞癌高表达新基因BC047440功能的研究

目的探讨肝细胞癌高表达新基因BC047440在肝癌形成中的作用。方法通过DOTAP^TM脂质体介导的转染技术，将BC047440基因反义真核表达载体导入HepG2肝癌细胞，经G418筛选，获得稳定表达BC047440反义基因的HepG2肝癌细胞，采用半定量RT—PCR检测反义基因对转染细胞的内源性BC047440基因抑制效果，噻唑蓝（MTT）比色法观察转染细胞生长曲线及流式细胞术比较细胞周期的变化。结果转染BC047440反义基因的肝癌细胞内源性BC047440基因受到有效抑制，细胞生长速度明显减慢，细胞周期中G1期细胞比例明显增高。结论肝细胞癌高表达基因BC047440可能是一个新的肝癌相关基因，在肝癌中的异常高表达可能对肝癌的发生发展具有一定的促进作用。     

沉默BC047440基因对HepG2细胞侵袭能力的影响

目的:观察沉默BC047440基因后对HepG2细胞侵袭能力的影响。方法:实验分为3组,即HepG2细胞转染siRNA的沉默组,HepG2细胞转染无关质粒组及未转染的HepG2细胞组。利用前期构建的BC047440基因的小干扰RNA（siRNA）沉默BC047440基因,然后用MTT法检测细胞黏附率,细胞划痕法检测细胞迁移能力,Boyden小室法检测细胞侵袭性。结果:沉默组的细胞黏附率在20 min和40 min时与HepG2细胞组和无关质粒组比较,差异无统计学意义（P＞0.05）,但在60 min时沉默组显著低于后2组(P＜0.05); 划痕实验显示划痕48h后,无关质粒组和HepG2细胞组划痕区已基本长满,而沉默组划痕依然明显; 接种16 h后无关质粒组和HepG2细胞组侵袭到Boyden小室下室面的细胞数明显多于沉默(P＜0.05)。而无关质粒组与HepG2细胞组间差异均无显著性（P＞0.05）。结论:沉默BC047440基因后可明显抑制HepG2细胞其在细胞外基质上的黏附能力、运动能力和体外侵袭能力,提示BC047440基因可增加肝癌的转移侵袭性。     

Nodal靶向RNA干扰对人肝癌细胞的影响

目的：观察RNA干扰技术对人肝癌细胞Nodal基因表达的干扰效应,探讨靶向Nodal基因在肝癌基因治疗中的可行性。方法：采用一段含针对Nodal特异shRNA序列的质粒载体,转染人肝癌细胞株SMMC-7721,观察其转染效率后,分别以实时荧光定量PCR和Western blot检测Nodal基因和蛋白的表达水平,并观察Nodal基因干扰对SMMC-7721细胞体外增殖的影响。结果：表达shRNA的质粒载体对SMMC-7721细胞有较高的转染效率,转染后可明显抑制SMMC-7721细胞Nodal基因和蛋白的表达,且对其体外增殖有明显抑制作用。结论：运用RNA干扰技术,可以有效地抑制肝癌细胞Nodal基因和蛋白的表达,并抑制细胞增殖,Nodal基因可望成为肝癌治疗的新靶点。     

血管内皮生长因子-C shRNA对肝癌HepG2细胞增殖及侵袭能力的影响

目的 检测靶向血管内皮生长因子-C(vasenlar endothelial growth factor-C,VEGF-C)shRNA质粒载体对肝癌HepG2细胞增殖及侵袭能力的影响.方法 构建VEGF-C shRNA质粒载体,脂质体转染方法转入肝癌HepG2细胞.通过倒置荧光显微镜及流式细胞仪检测细胞的转染率;RT-PCR及Western blot检测转染细胞内VEGF-C mRNA及蛋白的表达变化;MTT法检测细胞增殖抑制率;人工基底膜体外侵袭实验检测细胞侵袭能力.结果 VEGF-C shRNA稳定转染后,肝癌HepG2细胞内VEGF-C mRNA及蛋白表达水平显著下降;VEGF-C shRNA对肝癌HepG2细胞具有明显的增殖抑制作用,其抑制增殖效应呈时间依赖性;VEGF-C shRNA可有效抑制肝癌HepG2细胞的人工基底膜体外侵袭能力,抑制率为51.54%.结论 VEGF-C在肝癌增殖、侵袭转移中发挥重要作用;通过RNA干扰技术实现VEGF-C沉默,在肝癌的基因治疗中具有较好的应用前景.     

RNA干扰下调KMT2C基因表达对肝癌细胞HepG2增殖的影响及其机制

[摘 要] 目的 探讨组蛋白甲基化转移酶基因KMT2C对肝癌细胞HepG2的增殖影响及其可能的机制。方法 采用shRNA基因干扰技术抑制HepG2细胞中KMT2C基因的表达,采用细胞计数、CCK-8细胞增殖实验以及平板克隆形成实验检测细胞增殖能力,流式细胞仪检测细胞周期变化情况;Western blotting和qRT-PCR检测KMT2C基因干扰前后HepG2细胞中EGFR的表达情况。结果 甲基化转移酶KMT2C基因干扰成功后,HepG2细胞的增殖能力受到明显抑制（P<0.05）,细胞周期阻滞在S期;同时细胞内的EGFR蛋白表达量显著下降（P<0.05）。结论 干扰KMT2C基因的表达可以显著抑制肝癌细胞HepG2的增殖,其作用机制可能和EGFR信号通路有关。     

RNA干扰技术靶向SMYD3基因治疗肝癌的实验研究

目的 构建针对人SET-和MYND-结构域含有蛋白3（SMYD3）编码基因的短发夹状RNA（shRNA）干扰质粒,并研究其对肝癌细胞的作用。方法 应用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）方法检测SMYD3mRNA在肝癌细胞系HepG2、Hep3B、SMMC7721的表达。构建重组SMYD3shRNA表达质粒Pgenesil-1-s,并采用介导转染法导入HepG2细胞,蛋白免疫印迹法（Western blot）检测阻抑效应,噻唑蓝比色法（MTT）检测细胞生长增殖抑制率,流式细胞术检测细胞凋亡率。建立人肝癌细胞HepG2皮下移植瘤裸鼠模型,注射Pgenesil-1-s,动态观察肿瘤体积并于2周后处死裸鼠称取瘤重。结果肝癌细胞株HepG2、Hep3B、SMMC7721的SMYD3mRNA表达水平显著高于正常肝细胞株L-02;Pgenesil-1-s转染HepG2细胞后,SMYD3蛋白表达明显下调,而且细胞凋亡率显著增加,细胞生长明显受抑;经重组质粒治疗14d后,裸鼠皮下移植瘤生长缓慢,相较于对照组瘤体明显缩小、瘤重明显减轻（P〈0．01）。结论 肝癌细胞高表达SMYD3,shRNA干扰特异性抑制SMYD3表达,可以促进肝癌细胞凋亡并抑制裸鼠移植瘤的生长。     

新基因BC047440原核表达载体构建及其重组蛋白的表达纯化

目的 构建肝癌相关新基因BC047440原核表达载体,表达并纯化出其重组蛋白.方法 从HepG2细胞中提取总RNA,经逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增BC047440cDNA,克隆进质粒pMD19-T,转化E.coliDH5α,测序正确后,酶切目的基因片段,插入质粒pET-28a(+),转化E.coliBL21,IPTG诱导蛋白表达,Ni-NTA柱亲和层析纯化重组蛋白.结果 电泳证实RT-PCR扩增产物与预期目的基因BC047440长度一致.RT-PCR纯化产物与载体pMD19-T连接后,经蓝白斑筛选,挑出5个白色菌落做酶切鉴定,其中2个菌落被证实为阳性克隆.测定其基因序列,结果显示与Genbank公布的BC047440基因序列完全一致.将BC047440cDNA插入质粒pET-28a(+),转化E.coliBL21,培养过夜后,挑选7个白色菌落做酶切鉴定,证实均为阳性克隆.IPTG诱导其中一个克隆表达蛋白,SDS-PAGE电泳分析表明,在相对分子质量23000左右出现新的蛋白表达条带,诱导4h后表达蛋白量最多,占菌体总蛋白的22.3%.将诱导3h的菌体超声破碎后,Ni柱亲和层析,50和125mmol/L咪唑洗脱液SDS-PAGE电泳显示出清晰的单一条带.结论 成功构建BC047440基因原核表达载体,表达并纯化出重组蛋白,为深入研究其临床应用打下基础.     

慢病毒介导MAT2A及2B双重小干扰RNA对肝癌的抑制作用

目的 观察慢病毒载体携带的针对MAT2A和MAT2B基因双重小干扰RNA(dual siRNA)对肝癌的抑制作用.方法 分别构建靶向MAT2A、MAT2B基因的siRNA质粒,酶切、连接,构建同时针对MAT2A和MAT2B基因的慢病毒载体siMAT2A/2B,感染肝癌HepG2细胞,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)测定MAT2A和MAT2B mRNA水平,细胞计数;流式细胞仪测定细胞凋亡,测定作用前后肝癌细胞内S-腺苷甲硫氨酸(SAMe)的水平.结果 成功构建慢病毒载体携带的针对MAT2A和MAT2B基因双重小干扰RNA,LV-siMAT2A/2B同时抑制肝癌MAT2A和MAT2B基因表达分别达到89.5%和97.8%,肝癌HepG2细胞生长抑制率大于50%,促进细胞凋亡,提高肝癌细胞内SAMe的水平上升了2倍.结论 同时抑制肝癌内MAT2A、MAT2B基因的表达可以抑制肝癌的生长.     

shRNA-CXCR4对人胃癌BGC823细胞增殖迁移的影响

目的 构建针对人CXCR4基因的shRNA干扰表达载体,观察CXCR4基因表达对人胃癌细胞株BGC823细胞增殖和迁移能力的影响.方法 根据人CXCR4序列设计并构建CXCR4基因的shRNA真核表达载体,以脂质体转染的方法将CXCR4干扰质粒转染至人胃癌细胞株BGC823,经G418筛选出稳定转染的阳性细胞,应用流式细胞仪技术检测其细胞周期变化,噻唑蓝(MTT)比色法检测CXCR4干扰对胃癌细胞增殖的影响,采用Trans-well小室法检测细胞体外迁移能力.结果 经测序证明CXCR4的shRNA基因已成功插入Psilencer4.1质粒中,构建的干扰质粒能够显著抑制CXCR4的表达,CXCR4 mRNA被抑制了(2.7±0.2)倍(P＜0.01).CXCR4基因的表达下调将胃癌细胞阻滞在G1期(由84.2％升至94.1％),MTT法检测CXCR4-shRNA干扰细胞增殖(P＜0.05),且穿过Trans -well小室膜的细胞数显著下降(P＜0.05).结论 干扰CXCR4的表达可显著抑制胃癌细胞的增殖和迁移能力.     

BC047440基因调控HepG2的NF-κB活性机制的实验研究

目的 应用基因芯片进行高通量分析沉默基因BC047440后相关基因表达谱的变化,以了解BC047440通过NF-κB信号途径上游的何种分子调控NF-κB活性.方法 应用博奥公司提供的人全基因组基因芯片检测沉默BC047440基因后相关基因表达谱的改变,利用其数据库和MAS分析系统进行分析筛选,寻找NF-κB发生表达改变的上游分子并进行RT-PCR验证.结果 沉默BC047440基因后有189个基因表达改变,其中130个基因上调表达2倍以上,59个基因下调表达超过50%,其中NF-κB信号途径上游分子中仅TRAF6下降为对照组的23.06%.RT-PCR验证TRAF6的mRNA的表达下降为对照组的29.5%,与基因芯片结果类似.结论 应用基因芯片可以高通量高效率地分析沉默BC047440基因后的基因表达谱,BC047440基因可通过调控上游分子TRAF6作用于NF-κB信号途径来调控肝癌增殖.     

靶向人SIRT1基因的shRNA真核表达质粒的构建及鉴定

目的构建针对人SIRT1基因的shRNA真核表达质粒,并筛选出对胰腺癌细胞系PANC-1基因沉默效果最明显的shRNA质粒表达载体。方法针对SIRT1基因的mRNA序列设计,分别构建3个shRNA质粒表达载体和1个阴性对照质粒表达载体,经大肠杆菌扩增,酶切,PCR,测序鉴定,转染胰腺癌PANC-1细胞,实时荧光定量PCR和Western blot检测SIRT1 mRNA和蛋白的被抑制情况。结果经测序证实,成功构建SIRT1-shRNA真核表达质粒,插入的DNA片段的序列与设计序列完全一致。重组质粒转染PANC-1细胞后,SIRT1 mRNA和蛋白水平明显下调;其中以1号重组质粒效应最强。结论成功构建了携带以SIRT1为靶向的shRNA的重组质粒。其对胰腺癌PANC-1细胞SIRT1的表达具有显著抑制效应。该实验为进一步研究SIRT1的功能和肿瘤的基因治疗提供了实验基础。     

转化生长因子β1短发夹RNA对白蛋白刺激人肾近曲小管上皮细胞细胞因子表达的影响

目的 研究pcDU6载体质粒介导的转化生长因子β1（TGF-β1）短发夹RNA（shRNA）对人血清白蛋白（HSA）致人肾近曲小管上皮细胞（HK2细胞）增殖，TGF-β1、结缔组织生长因子（CTGF）和纤连蛋白（FN）表达的影响，并探讨有关机制。方法 构建TGF-β1shRNA的pcDU6载体质粒，体外培养HK2细胞株。采用脂质体转染将表达TGF-β1shRNA的pcDU6质粒载体（pcDU6-A1-A2和peDU6-B1-B2）分别导人实验组细胞。用HSA（5g／L）刺激HK2细胞12h或24h。四甲基偶氮唑盐（MTF）比色法测定细胞增殖水平。RT-PCR半定量分析HK2细胞中TGF-β1、CTGF和FNmRNA的表达水平；双抗夹心酶联免疫吸附法检测HK2细胞培养液中TGF-β1及FN蛋白质水平。结果 HK2细胞在HSA刺激下，其TGF-β1、CTGF及FNmRNA的表达明显上调，培养液中TGF-β1和FN的蛋白质含量亦明显升高（P〈0．05）。与pcDU6空载体组比较，pcDU6载体质粒介导的TGF-β1shRNA干扰组TGF-β1、CTGF及FNmRNA的表达明显下调（P〈0．05）。TGF-β1shRNA转染HK2细胞后12h或24h，细胞培养液中TGF-β1和FN蛋白质含量明显下降，HK2细胞增殖被部分抑制（P〈0．05）。在细胞增殖、TGF-β1、CTGF及FN基因表达方面，TGF-β1shRNA干扰组组间比较，以及pcDU6空载体转染组与HSA刺激组比较，差异均无统计学意义。结论 peDU6载体质粒介导的TGF-β1shRNA能够明显抑制HSA刺激下HK2细胞增殖、TGF-β1、CTGF和FN基因的表达。HSA刺激HK2细胞增殖及CTGF和FN基因的过表达可能通过TGF-β1介导。     

NG2基因小发夹结构RNA抑制高糖诱导的大鼠系膜细胞增殖

目的构建针对NG2基因的小发夹结构RNA（shRNA）真核表达载体，观察该shRNA诱导的RNA干扰（RNAi）对高糖环境下大鼠肾小球系膜细胞（RMC）增殖的影响。方法体外培养RMC，高糖（30mmol／L）刺激24h，观察NG2基因表达的变化。设计两条针对NG2mRNA不同靶序列的干扰序列，构建针对NG2基因的shRNA表达载体Pgenesil—siNG21和Pgenesil-siNG22；选择不与任何基因同源的序列NC作为阴性对照。运用脂质体将3种质粒分别转染RMC，24h后荧光倒置显微镜观察转染效率，即增强绿色荧光蛋白（EGFP）表达率，荧光定量PCR法和Western印迹法观察NG2的干扰效率。以高糖刺激转染的RMC，用四甲基偶氮唑蓝比色法（MTY）和流式细胞仪（FCM）检测RMC增殖的变化。结果与低糖和甘露醇对照组比较，高糖刺激RMC后NG2表达水平明显升高，分别增高（65±32）％和（63±28）％，差异有统计学意义（P〈0．01）。质粒转染RMC24h后，EGFP的表达率为（50±10）％。高糖刺激后，干扰质粒转染组RMC增殖缓慢，与对照组比较差异有统计学意义（P〈0．01）。结论针对NG2基因的shRNA对高糖诱导的RMC增殖有明显的抑制作用。     

携带SKP2基因的shRNA表达质粒的构建与鉴定

目的:构建含人SKP2基因不同位点的一系列shRNA真核表达质粒，并进行酶切鉴定、测序。方法:设计合成3对SKP2基因干扰寡核苷酸序列，形成双链后将其依次连入带有U6启动子的pSIREN-RetroQ载体，构建成能产生SKP2短发卡RNA的质粒。结果:构建的核苷酸序列经鉴定构建成功，能成功的克隆入带有pSIKEN RetroQ的载体中。结论:成功构建并鉴定了针对人SKP2基因3个不同位点的shRNA的真核表达质粒，为SKP2为靶点的肿瘤基因治疗研究奠定了基础。