基于同源加尾系统的改良分子信标荧光PCR检测香港海鸥形菌方法的建立

]目的 针对香港海鸥形菌,利用同源加尾系统 (Homo-Tag Assisted Non-Dimer,简称HAND)建立一种基于改良分子信标的荧光PCR检测方法,并对这种方法进行条件优化和评价。方法根据香港海鸥形菌的基因保守序列16SrDNA基因设计探针和特异性引物,并在引物的5’端加上同源尾巴序列,减少或避免引物二聚体的形成,通过优化通用尾巴引物和特异性加尾引物的浓度与反应温度等PCR参数构建荧光PCR的反应体系。结果建立的基于HAND系统的改良分子信标PCR的检测体系引物二聚体明显减少,检出限达到20CFU/ml。结论建立的基于HAND系统的改良分子信标荧光PCR检测方法具有检测时间短、灵敏度高、特异性好的优点,能够应用于香港海鸥形菌的快速筛查。     

水产品中香港海型菌检验技术建立与应用研究

目的:研制水产品中香港海鸥型菌检验方法。方法:在水产品中添加香港海鸥型菌标准菌株菌液,按传统方法通过选择性增菌、选择性分离,对分离出典型菌落经纯化培养后进行生化鉴定。结果:采用本方法对20份模拟污染香港海鸥型菌水产品均检出香港海鸥形菌。结论:建立的水产品中香港海鸥型菌检验方法简单,稳定重现性好,检测限为100 cfu/g,达到水产品中香港海鸥形菌检测要求。     

香港海鸥形菌分型方法建立与病原学分布调查

目的通过对深圳市感染性腹泻患者标本与外环境水产品标本的检测,掌握深圳市香港海鸥形菌病原学特征及分子分型。方法用传统方法和荧光PCR法同时检测香港海鸥形菌,阳性菌株用K-B法做药敏试验和PFGE分子分型。结果在329份淡水鱼中共检出7份阳性标本,579份腹泻病人标本未检出。该菌对临床常用的24种抗生素耐药性检测结果显示,对氨苄西林、头孢他啶、头孢噻吩、头孢噻腭、头孢哌酮、头孢曲松耐药,头孢西丁为中介,其余均为敏感。7株香港海鸥形菌生化反应阳性的,荧光PCR结果均为阳性。PFGE分子分型表明7株菌不具有同源性。结论本文建立一套完整的对该菌的分离鉴定、基因诊断和PFGE分子分型方法;了解深圳地区主要流行菌型,预测深圳地区该菌的流行趋势,为应对食源性疾病突发事件和水产品安全问题做好技术储备。     

基质辅助激光解析电离飞行时间质谱技术快速鉴定香港海鸥形菌

目的建立香港海鸥形菌(Laribacer hongkongensis)的基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)鉴定方法,并对其实验室应用加以评价。方法用VITEK MS全自动快速微生物质谱检测系统对12株香港海鸥形菌进行鉴定和分析,用SARAMIS数据库构建参考图谱;并用新分离的香港海鸥形菌、嗜水气单胞菌、温和气单胞菌、溶血不动杆菌、琼氏不动杆菌、腐败希瓦氏菌、藤黄微球菌、类志贺邻单胞菌等表型相似的菌株对所建立的鉴定方法进行验证。结果本实验构建的香港海鸥形菌参考图谱特异性高、重复性好,是细菌鉴定数据库中未见的新图谱;新分离香港海鸥形菌菌株均能被MS成功鉴定,且图谱吻合率在98.5%以上,其他25株表型相似菌株均能被成功鉴别。结论MALDI-TOF-MS技术能快速和准确地鉴定香港海鸥形菌,此方法可用于香港海鸥形菌的临床快速诊断或食品安全性评价。     

多重实时荧光PCR检测三种致泻性大肠埃希菌和志贺菌方法的建立

目的:建立一种多重实时荧光PCR同时检测EPEC、EIEC、EHEC三种致泻性大肠埃希菌和志贺菌的方法。方法:于GenBank数据库中查找三种致泻性大肠埃希菌及志贺菌毒力基因stx1、stx2、eaeA及ipaH基因序列并使用软件进行比对后设计四套引物及探针,建立四重实时荧光PCR检测EPEC、EIEC、EHEC和志贺菌的方法,并对方法反应体系及反应条件进行优化,对方法的特异性、敏感性及重复性进行分析。结果:显示该方法具有检测灵敏度高、特异性强,结果与细菌培养结果完全一致,均为100%。结论:四重实时荧光PCR检测体系可同时检测EPEC、EIEC、EHEC和志贺菌,具有快速、特异性强、灵敏度高等特点,可广泛应用于临床检验、卫生检验、食品检验等领域,对快速有效的实施针对治疗,预防食物中毒,保障公众健康具有重大意义。     

实时荧光定量PCR检测沙门菌方法的实验研究

目的:建立沙门菌实时荧光定量PCR快速检测方法,探讨沙门菌在食源性感染快速诊断中的应用价值。方法:采用沙门菌fimY基因序列设计特异引物和探针,建立实时荧光实时定量PCR技术检测沙门菌的检测方法。通过特异性、敏感性、稳定性和重复性,以验证方法的可行性。结果:成功构建了沙门菌重组质粒标准品,为方法学建立奠定基础;通过特异性、敏感性、稳定性和重复性验证,结果表明具有较好的特异性,最低检测限为103拷贝/ml,相当于100 cfu/ml的菌细胞,并有良好的稳定性和重复性。结论:沙门菌实时荧光定量PCR检测方法的建立,不仅为食源性沙门菌污染的快速检测提供依据,而且还可直接用于临床粪便标本检测。     

实时荧光定量PCR法与常规PCR法检测沙门菌的比较

目的:比较实时荧光定量PCR法、常规PCR法检测沙门菌的灵敏度与特异性。方法:采用建立的实时荧光定量PCR、常规PCR方法,同时对沙门菌等细菌进行检测。结果:实时荧光定量PCR检测的灵敏度可达33 cfu/m l,且有很高的特异性,对金黄色葡萄球菌等10种相关细菌均无交叉反应,从细菌核酸提取至完成检测仅需3 h左右。结论:实时荧光定量PCR检测由于在密封环境中进行,避免了产物与环境间的交叉污染,且是2种方法中最为快速敏感的方法,适用于临床实验室的快速诊断。     

基于Taqman探针双重实时荧光PCR检测单增李斯特菌

目的:建立双重荧光PCR对单增李斯特菌(LMO)特异性检测同时检测其毒力基因的方法。方法:根据LMO溶血素基因hlyA和內华素基因InlA的保守序列分别设计特异性引物和Taqman探针,优化多重荧光PCR反应体系,进行特异性、敏感性试验。结果:用建立的方法检测LMO标准菌株和24株分离株均出现hlyA和InlA扩增曲线,而沙门菌等其他菌株未见扩增曲线;敏感性试验结果方法的敏感性达到2.5×102 cfu/ml。结论:本研究建立的LMO实时荧光PCR检测方法特异性好、灵敏度高,是快速检测LMO及其毒力基因的有效手段,可用于食品中LMO检测。     

实时荧光定量PCR快速检测创伤弧菌的研究

目的:建立一套在8 h内检测牡蛎中创伤弧菌的实时荧光定量PCR方法,并对其特异性、灵敏度和准确性等指标进行评价。方法:对经过或未经过3%NaCl碱性蛋白胨水5 h预增菌的样品分别采用两种DNA提取方法(QIAampDNA mini Kit和直接煮沸裂解法)提取DNA,并采用根据vvhA基因序列设计的引物和探针进行实时荧光定量PCR检测。结果:所建立的实时荧光定量PCR特异性强,仅对创伤弧菌呈阳性结果。对预增菌5 h后经QIAamp DNA mini Kit提取的DNA进行实时荧光定量PCR检测,其检测效果最佳,灵敏度达1.4 cfu/ml。结论:所建立的实时荧光定量PCR方法具有快速、特异性强、敏感高等特点,能在8h内完成在牡蛎等海产品中创伤弧菌的快速检测。     

实时荧光定量PCR联合检测诺如病毒和副溶血性弧菌的方法建立与应用

目的建立实时荧光定量PCR法联合检测诺如病毒和副溶血性弧菌的方法。方法根据GⅠ型、GⅡ型诺如病毒和副溶血性弧菌tlh基因设计特异性引物。通过调整引物浓度和优化反应条件,建立多重荧光定量PCR检测体系,对方法的灵敏度和特异性进行验证。结果多重荧光定量PCR检测方法对诺如病毒、副溶血性弧菌、轮状病毒、沙门菌、志贺菌、大肠杆菌O157等样本进行检测,未发生交叉反应。结论本研究建立的实时荧光定量PCR法同时检测诺如病毒和副溶血性弧菌灵敏度高、特异性好,能用于食品携带病原微生物和感染性腹泻暴发中诺如病毒和副溶血性弧菌的检测。     

河北省淡水鱼香港海鸥型菌分布及耐药性研究

目的了解河北省淡水鱼中香港海鸥型菌的分布现状及耐药性。方法含头孢哌酮32μg/ml的血平板进行分离,API20NE和VITEK GNI+进行生化鉴定,药敏试验采用K-B琼脂纸片扩散法。结果 429份鱼类样本中,检出8株香港海鸥型菌,总检出率为1.86%(8/429),其中草鱼的检出率为5.43%(5/92),鲤鱼为0.53%(1/189),鲫鱼为2.08%(2/96),其他淡水鱼未检出(0/52)。药敏结果显示8株香港海鸥型菌对万古霉素、头孢哌酮、克林霉素、甲硝唑耐药,对多粘菌素B、替卡西林/克拉维酸、红霉素、庆大霉素、阿米卡星、四环素、环丙沙星、磺胺、氯霉素敏感。结论河北省淡水鱼存在香港海鸥型菌的污染并显示一定程度的耐药,应加强监测和预警,防止香港海鸥型菌病在河北省的流行和传播。     

香港海鸥形菌检验技术的建立与应用

目的:建立香港海鸥形菌(Laribacter hongkongensis,LH)的社区获得性胃肠炎患者及淡水鱼类标本采样、运输、培养、分离及鉴定方法。方法:于2005年~2006年,采集社区获得性胃肠炎患者及淡水鱼类新鲜粪样,分别接种SS、XLD、CCDA、TCBS、MacConkey琼脂(MA)以及改良头孢哌酮MacConkey琼脂(CMA)等6种培养基,对典型的菌落,进行常规生化试验,凡氧化酶、触酶试验阳性以及三糖铁试验阴性的菌株,采用特异性PCR检测确诊。结果:社区获得性胃肠炎患者的LH检出率为0.53%(4/759);淡水鱼类草鱼、鲢鱼与鲈鱼的阳性率分别为9.30%、8.33%和5.88%。结论:本文建立的LH表型与基因型诊断技术适合于LH的诊断;当前LH缺乏血清学诊断,发展LH的PCR诊断方法具有现实意义。     

实时荧光定量PCR法与常规PCR法及细菌培养法检测单增李斯特菌的比较

目的：比较实时荧光定量PCR法、常规PCR法及细菌培养法检测单核细胞增生性李斯特菌的灵敏度与特异性。方法：采用建立的实时荧光定量PCR、常规PCR及传统细菌培养法3种方法,同时对单核细胞增生性李斯特菌等细菌进行检测。结果：实时荧光定量PCR检测的灵敏度可达19 cfu/ml,且有很高的特异性,对英诺克李斯特菌等10种相关细菌均无交叉反应,从细菌核酸提取至完成检测仅需3 h左右。结论：实时荧光定量PCR检测由于在密封环境中进行,避免了产物与环境间的交叉污染,且是3种方法中最为快速敏感的方法,适用于公共卫生应急疫情的实验室快速诊断。     

多重荧光定量PCR同时检测霍乱弧菌、副溶血性弧菌和创伤弧菌的方法研究

目的:利用多重荧光定量PCR技术检测霍乱弧菌、副溶血性弧菌、创伤弧菌。方法:以溶藻弧菌等17种相关试验菌株做特异性检测;并将标准菌株稀释成不同梯度,做灵敏度检测。结果:与传统的检测方法相比,该方法有很好的特异性且灵敏度高,检测时间短并可节省人力,具有快速方便等优点。结论:适用于样品中霍乱弧菌、副溶血性弧菌和创伤弧菌的快速检测。检测限分别为:霍乱弧菌为280 cfu/ml;副溶血性弧菌为:100 cfu/ml;创伤弧菌为:450 cfu/ml。     

社区获得性胃肠炎患者中分离出香港海鸥形菌的研究报告

目的了解中国内地社区获得性胃肠炎患者是否存在香港海鸥形菌感染.方法于2005年8月对杭州市第一人民医院肠道门诊就医患者采集粪样,分别接种SS、XLD、CCDA、TCBS、MacConkey琼脂（MA）以及改良头孢哌酮MacConkey琼脂（CMA）等6种平皿,对分离到的可疑细菌进行常规生理生化实验、16S rRNA基因序列测定、透射电镜（TEM）下形态观察及药敏试验.结果编号为242的标本,在CMA平皿上生长出无色、透明的微小菌落.该菌为革兰阴性,氧化酶、过氧化氢酶、尿素酶和精氨酸双脱氢酶阳性,鸟氨酸脱羧酶和赖氨酸脱羧酶阴性,不发酵葡萄糖.经16SrRNA基因序列测定,菌株242的基因序列长度为1413 bp,采用Blast软件对测序结果进行同源性分析显示,与文献报道的香港海鸥形菌同源值达100%.TEM下可见菌体两端有多根鞭毛.药敏试验结果显示,该菌对临床常用的21种抗菌药物表现出不同程度的耐药性,其中对青霉素、氨苄西林、头孢哌酮、头孢他啶表现为耐药.结论证实中国内地社区获得性胃肠炎患者粪便中存在香港海鸥形菌.有关该菌引起感染性腹泻疾病的致病地位与流行病学等特征需进一步深入研究.     

实时荧光PCR快速检测粪便中艰难梭菌方法

目的:建立实时荧光PCR快速检测艰难梭菌的方法。方法:以艰难梭菌磷酸丙糖异构酶(tpi)基因的保守序列为模板设计和合成特异性引物和荧光标记探针,建立实时荧光PCR检测体系,通过检测含有艰难梭菌标准菌株浓度为106-10 CFU/ml的细菌培养物及加标模拟样本进行敏感性分析,并对其特异性和干扰性进行评价。结果:该方法只对艰难梭菌进行特异性扩增,其他常见的病原菌均不能扩增;整个检测过程只需要2 h,对艰难梭菌菌悬液可检测至10 CFU/ml细菌,对加标粪便样本可检测至1000 CFU/ml细菌。结论:本研究建立的实时荧光PCR检测艰难梭菌方法具有快速、特异、敏感性高等优点,能实现对艰难梭菌的快速检测。     

改良分子信标-实时PCR快速检测产单核李斯特菌

目的：建立改良分子信标-实时PCR检测产单核李斯特菌（LMO）的快速方法，应用于食品中LMO的污染状况调查及食物中毒快速诊断。方法：根据GenBank公布的LMO hlyA基因的保守序列，设计引物和改良分子信标探针，建立改良分子信标-实时PCR检测体系，应用于食品中LMO检测。结果：改良分子信标-实时PCR反应体系DNA灵敏度为110fg，菌液灵敏度为99cfu／ml或4cfu／PCR反应体系，无交叉反应。以此反应体系检测28株LMO，均出现特异的荧光信号。上述方法可将检测时问由原来的至少4d缩短至1d。对228份食品进行LMO检测，8份增菌液LMO实时荧光PCR阳性，其中6份1310细菌培养阳性。结论：改良分子信标-实时PCR反应体系快速、灵敏度高，特异性强．能提高LMO的检出率和准确性，可应用于LMO食品污染状况调查及食物中毒的快速诊断。