qPCR快速检测金黄色葡萄球菌及MRSA方法的建立及评价

目的建立q PCR法快速检测金黄色葡萄球菌及其mec A基因,以期快速精准诊断金黄色葡萄球菌感染及初步判断耐药情况。方法从NCBI数据库下载金黄色葡萄球菌nuc、atl、ica B、fnb A、hla、srap基因序列用于鉴定标志筛选,mec A基因序列用于MRSA标志筛选;经DNA MAN比对后,选择各基因保守区分别设计1~2套引物、探针,建立单重及双重q PCR,用临床分离株及标准菌株筛选出检测性能最好的基因片段作为检测标志物,建立金黄色葡萄球菌鉴定和耐药双重q PCR检测方法,并进行性能评价。结果经筛选,金黄色葡萄球菌atl基因(CP009361.1:1010217~1010341)、mec A基因(KF058908.1:1715~1843)两片段检测性能最优,将其作为标志物建立双重q PCR法。该方法的检测下限均低至4 copies/反应;扩增线性范围均达2.0×102~8copies/m L。335份金黄色葡萄球菌(含94份MRSA)培养阳性的患者样本中,q PCR法分别检出SA 335份,MRSA 94份;95份金黄色葡萄球菌培养阴性的患者样本中,q PCR法分别检出SA 17份,MRSA 4份,经PCR产物测序,与标准菌株同源性均≥90%。双重q PCR法从样品处理到报告结果≤2.0 h。结论 q PCR法方法简便、快速、灵敏度高、特异性好,可望提高金黄色葡萄球菌感染的诊断能力并实现快速检测,为尽早精准治疗赢得时间。     

基于表面增强拉曼检测技术的唾液检测研究

拉曼光谱可以表征化学物质的分子结构特性,表面增强拉曼检测方法采用纳米技术使原有的光谱强度提高了(4~10)个数量级,在痕量化学物质快速检测方面显示出巨大的潜力。本文介绍了表面增强拉曼检测技术所用的设备和检测方法,并报告了将表面增强拉曼光谱检测技术应用于吸毒者的鉴别,检测了29例吸毒者的唾液,与健康人的样本进行了对比分析,发现吸毒者唾液的拉曼光谱在1030cm-1具有明显的特异性。     

PCR法直接检测鲜乳中金黄色葡萄球菌肠毒素A的研究

目的建立一种快速敏感检测鲜乳中金黄色葡萄球菌肠毒素A的方法。方法将金黄色葡萄球菌模拟污染鲜乳后,提取菌体DNA,以大肠杆菌作对照,用双重PCR法扩增金黄色葡萄球菌耐热核酸酶基因和肠毒素A基因。结果在含金黄色葡萄球菌(1×104个/ml)的模拟鲜乳样品中检出金黄色葡萄球菌耐热核酸酶基因和肠毒素A基因,而大肠杆菌对照未出现特异性片段;PCR方法灵敏度分析显示,其检测限为100 cfu/ml。结论建立的直接检测金黄色葡萄球菌耐热核酸酶基因和肠毒素A基因的双重PCR方法,具有速度快、特异性强、灵敏度高和易操作的特性,可用于金黄色葡萄球菌食源性疾病与食物中毒的实验室诊断。     

多重PCR检测食品中的金黄色葡萄球菌、志贺菌和沙门菌

目的建立一种能同时检测食品中金黄色葡萄球菌、志贺菌和沙门菌的多重PCR检测方法。方法采用7.5%NaCl肉汤对食品样品中的金黄色葡萄球菌进行增菌,同时采用GN增菌剂对食品样品中的志贺菌和沙门菌进行增菌。根据金黄色葡萄球菌的nuc基因、志贺菌的ipaH基因、沙门菌的invA基因设计引物,通过多重聚合酶链反应(PCR)反应对食品样品中上述三种病原菌的目标基因进行扩增,同时对反应体系进行优化。结果特异性实验表明本方法的特异性良好。对污染金黄色葡萄球菌、志贺菌和沙门菌的牛奶样品进行检测,检出限为1cfu/ml。结论本实验建立的多重PCR检测方法适用于食品中金黄色葡萄球菌、志贺菌和沙门菌的快速检测,具有快速、简便、灵敏的特点。     

化妆品中金黄色葡萄球菌的PCR快速检测

目的研究化妆品中金黄色葡萄球菌的快检方法。方法将金黄色葡萄球菌基因nuc作为靶基因并设计引物,使用PCR扩增技术对17株金黄色葡萄球菌及4株干扰菌进行特异性扩增。同时采用传统细菌分离培养法及PCR扩增法对9份不同性状加标化妆品进行金黄色葡萄球菌实际样品检测。结果琼脂糖凝胶电泳检测显示,17株金黄色葡萄球菌全部扩增出280 bp的目的条带,准确率为100%。同时,当9种化妆品样品内金黄色葡萄球菌添加浓度为1 CFU/g(或ml)以上时样品增菌液均能扩增出清晰的目的条带。结论菌落PCR检测技术快捷简便,其灵敏性与准确性均能满足化妆品中金黄色葡萄球菌检测需求。     

食品中金黄色葡萄球菌厌氧亚种检验技术的建立与研究

目的建立并研究密封包装食品中金黄色葡萄球菌厌氧亚种的检验方法。方法在样品中添加金黄色葡萄球菌厌氧亚种标准菌株菌液,按传统方法通过选择性增菌、选择性分离,寻找合适的生长环境,对分离出的典型菌落经纯化培养后进行生化鉴定。结果金黄色葡萄球菌厌氧亚种在p H为6.5~7.0含7.5%氯化钠葡萄糖肉浸液肉汤中生长良好,用API Staph鉴定卡结合血浆凝固酶试验能够快速鉴定,采用本项目的检验方法,在5类各20份模拟污染金黄色葡萄球菌厌氧亚种的样品中,均检出金黄色葡萄球菌厌氧亚种。结论建立的食品中金黄色葡萄球菌厌氧亚种的检验方法简单,稳定性及重现性好,检测最低限为30 cfu/g,达到常见食品中金黄色葡萄球菌厌氧亚种检测的要求。     

食品中金黄色葡萄球菌的污染状况及检测方法

金黄色葡萄球菌广泛存在于自然界中，如空气、水、灰尘及人和动物的排泄物等。在我国它是引起食物中毒的主要病原菌，易被金黄色葡萄球菌污染的食品主要有奶、肉、蛋、鱼及其制品。为了解食品中金黄色葡萄球菌在我省的污染状况，本实验室建立了金黄色葡萄球菌耐热核酸酶PCR及显色培养基分离培养的快速检测方法，为今后食源性疾病的快速诊断和排查提供可靠依据，我们随机采集了100件食品样品进行检测，现将结果报告如下。     

食物中毒样品中金黄色葡萄球菌及肠毒素检测

[目的]对3个可疑食物中毒样品进行金黄色葡萄球菌及肠毒素检测.[方法]按照GB/T4789.10-2003进行金黄色葡萄球菌检测,同时设计4对引物,分别扩增金黄色葡萄球菌的耐热核酸酶基因(nuc基因)和相关肠毒素基因(SEA、SEB、SECs),建立一种快速检测金葡菌和肠毒紊的方法.[结果]3个样品通过增菌接种,均检出有完全溶血环、G 葡萄球菌,血浆凝固酶阳性的金黄色葡萄球菌;Baird-Parker直接计数菌落结果分别为:9.6x107cfu/g、1.5x105 cfu/g、1.7x108 cfu/g;PCR检测3个样品均扩增出了金黄色葡萄球菌nuc基因(279 bp)和肠毒素A(SEA)基因(288 bp).[结论]3个样品中均检出含有葡萄球菌肠毒素A的金黄色葡萄球菌,是引起该次食物中毒的主要原因.     

食品中金黄色葡萄球菌的肠毒素检测及耐药性

目的了解食品中金黄色葡萄球菌对药物的敏感性及产肠毒素的情况,对食物中毒检测提供理论依据和指导临床用药。方法药物敏感性试验采用1997年美国NCCLS药敏试验(纸片法)方法进行,用反向被动乳胶凝集试验检测肠毒素。结果金黄色葡萄球菌除对万古霉素、替考拉宁敏感外,对其余10种存在不同程度的耐药;金黄色葡萄球菌产肠毒素总检出率为38%,其中A型为25%,C型为12.5%,其次为D型为5%,E型为2.5%,B型未检出。结论检测食物中毒及食品样品中的金黄色葡萄球菌时,应考虑肠毒素的检测;临床治疗金黄色葡萄球菌感染,应建立在体外药敏试验的基础上,有针对性地选择抗菌药物。     

PMA-实时荧光PCR快速检测蔬果中金黄色葡萄球菌活菌

目的 将叠氮溴化丙锭（PMA）与实时荧光定量PCR（real-time PCR）技术相结合,快速检测蔬果中金黄色葡萄球菌活菌。方法 通过对影响PMA作用的关键因素,包括PMA浓度、光照时间以及活、死菌比例混合等进行试验,确定PMA的作用条件。以金黄色葡萄球菌nuc基因为靶基因,建立PMA-实时荧光定量PCR方法,并构建金黄色葡萄球菌重组质粒标准品,用于检测蔬果中金黄色葡萄球菌活菌。结果 在PMA 30 μg/ml浓度下,曝光5 min,可实现PMA筛选金黄色葡萄球菌活菌的作用。由构建的质粒标准品模板建立标准曲线表现出良好线性关系,相关系数r = 0.9995,所建立的方法灵敏度可达到14 copies /μl,且特异性良好。经2 h增菌后用PMA进行筛选,再用荧光定量PCR检测,可实现快速对蔬果样品中活的金黄色葡萄球菌的检测。结论 用PMA-实时荧光定量PCR方法可快速检测蔬果中活的金黄色葡萄球菌,可为食品安全风险监测提供可靠数据。     

872株临床常见病原菌分布及其耐药性

目的:研究医院临床常见病原菌分布特点及其对常用抗生素的耐药性。方法:采集临床标本分离致病菌,用V itek-32全自动微生物分析仪及纸片扩散法对分离菌进行鉴定及药敏试验。结果:共分离到872株致病菌,以大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌为多见,其中金黄色葡萄球菌对临床多种常用抗生素耐药率超过80%,但是全部革兰阳性球菌对万古霉素敏感。革兰阴性杆菌对氨苄西林、哌拉西林、头孢唑啉和庆大霉素等耐药率较高。结论:湖州的致病细菌耐药现象严重。     

从婴儿奶粉中快速检测产肠毒素金黄色葡萄球菌的研究

[目的]建立快速鉴定金黄色葡萄球菌和金黄色葡萄球菌肠毒素检测方法。[方法]采用VITEK32微生物分析仪和miniVIDAS全自动酶联免疫分析仪联合诊断系统检测从婴儿奶粉中分离出的1株菌。[结果]从奶粉中分离的菌鉴定为金黄色葡萄球菌,产肠毒素。[结论]联合系统能够快速鉴定金黄色葡萄球菌和检测金黄色葡萄球菌肠毒素的产生情况。     

两种方法处理后布尿布中微生物含量和种类的比较研究

目的:比较使用后经医院常规消毒的布尿布和家庭热水清洗处理后的布尿布中的微生物含量和种类的差别。方法:使用后的布尿布经医院常规消毒和家庭热水清洗处理后分别检测了细菌总数、霉菌/酵母菌、大肠杆菌的含量以及铜绿假单胞菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。结果:家庭热水清洗处理后的布尿布中64份尿布均检测出细菌,细菌总数的平均值为1450348 cfu/g;对32份样品中霉菌/酵母菌进行了检测,其中30份尿布中检测为阳性,其平均值为726.6 cfu/g;7份尿布中检测出大肠杆菌,平均值为721.1 cfu/g;对铜绿假单胞菌的鉴定均为阴性;46份尿布耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌(MRSA)鉴定为阳性;经医院常规消毒后的布尿布中55份尿布中均检测出细菌,细菌总数的平均值为30.9 cfu/g;18份尿布中检测出霉菌/酵母菌,平均值为1.1 cfu/g;64份尿布中均未检出大肠杆菌;对铜绿假单胞菌的鉴定均为阴性;9份尿布耐甲氧西林金黄色葡萄球菌鉴定为阳性。采用经医院常规消毒方法的多重带菌率明显低于家庭热水清洗方法。结论:使用后经过医院常规消毒的布尿布中微生物的浓度明显低于家庭热水清洗处理后的布尿布,且霉菌/酵母菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和大肠杆菌是布尿布中的主要微生物。     

骨科患者伤口分泌物病原菌分布及耐药特点

目的分析医院骨科患者伤口分泌物病原菌分布及耐药特点,为合理使用抗菌药物提供参考。方法回顾性调查统计医院2017年1月-2018年6月临床分离397株,采用美国BD PhoenixTM100全自动微生物鉴定分析仪对细菌鉴定和药敏分析。结果从该医院临床送检标本中共分离出397株病原菌,革兰阳性菌187株,占47.1%;革兰阴性菌208株,占52.4%。病原菌感染率由高到低分别为金黄色葡萄球菌(27.5%)、铜绿假单胞菌(10.6%)、阴沟肠杆菌(9.8%)、表皮葡萄球菌(6.8%)、大肠埃希菌(5.3%)、鲍曼不动杆菌(4.8%)。耐药试验表明,革兰阳性菌对青霉素耐药率高,对万古霉素和利奈唑胺敏感性高,耐甲氧西林金黄色葡萄球菌49株(45.0%);革兰阴性菌对亚胺培南、美罗培南和阿米卡星耐药率低,大肠埃希菌的耐药性总体显著高于阴沟肠杆菌。结论骨科患者伤口感染病原菌种类繁多,临床上应及时进行病原菌鉴定和药敏试验,选用合适抗菌药物,做好耐药菌监测,预防交叉感染。     

应用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱检测细菌耐药性的初步研究

目的研究基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)用于检测鉴定细菌耐药性的可行性。方法对临床分离的耐药谱明确的8属11株细菌及相应的标准菌株,经相同条件培养后,应用MALDI-TOF-MS进行检测,并分析其耐药株和标准株质谱图的差异。另外,对临床分离的30株金黄色葡萄球菌同时进行药物敏感性实验和MALDI-TOF-MS检测。结果应用MALDI-TOF-MS检测细菌耐药性时,对葡萄球菌检测结果较好,尤其是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌,而对其它细菌耐药性检测效果较差。结论MALDI-TOF-MS检测细菌耐药性适用于部分细菌。     

一种快速鉴定金黄色葡萄球菌的方法

本文报道用溶葡萄球菌素敏感试验快速鉴定金黄色葡萄球菌的方法。在2.0μg/ml溶葡萄球菌素浓度下,216株金黄色葡萄球菌菌株中有213株被裂解,判断为阳性结果;112株表皮葡萄球菌和141株其它球菌和杆菌均呈阴性。在模拟条件下,对13份含不同质粒谱和耐药谱金黄色葡萄球菌的血液标本的鉴定均为阳性;28份含有表皮葡萄球菌和微球菌的标本中仅1例出现假阳性结果。对53份临床标本的鉴定结果表明该方法阳性率达96.2％,无假阳性出现。     

血流感染病原体的分布及耐药性分析

摘要:目的　了解我院血流感染病原体的分布及其耐药性情况,为临床合理使用抗菌药物提供科学依据。方法　采用BDBACTEC 9120全自动血培养仪对我院2010年1月至2013年12月收集的血液标本进行培养,用BD phonix-100对分离菌株进行鉴定和药敏试验,检测结果用WHONET5.6软件进行统计分析。结果　共分离出377株细菌,革兰阴性菌202株,占53.6%,其中主要是大肠埃希菌106株（28.1%）,肺炎克雷伯菌39株（10.3%）;革兰阳性菌175株,占46.4%,其中凝固酶阴性葡萄球菌103株（27.3%）,金黄色葡萄球菌33株（8.8%）;未发现对万古霉素耐药的金黄色葡萄球菌分离株,也未检出对亚胺培南和美罗培南耐药的大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌。结论　血流感染的病原体以革兰阴性菌为主,耐药性普遍,临床应根据药敏试验结果合理选择抗菌药物。     

某高校公用电梯内部按钮微生物污染状况

  目的  调查某高校公用电梯内部按钮表面的微生物污染情况,为电梯消毒卫生管理提供数据参考。  方法  连续4个季度对某高校公用电梯内部按钮进行采样(共计140台次电梯),参照《公用场所卫生检验第4部分:公共用品用具微生物》(GB/T 18204.4—2013)检测按钮表面的细菌总数、大肠菌群及金黄色葡萄球菌,参照《公共场所卫生指标及限值要求》(GB 37488—2019)中公共用品用具的卫生要求进行评价。  结果  某高校公用电梯内部按钮的携菌率高达98.57%,19.29%的按钮携菌量超过公共用品用具规定限值(300 CFU/25 cm2);细菌总数、大肠菌群、金黄色葡萄球菌总合格率分别为80.71%,99.29%,95.71%;不同季节金黄色葡萄球菌的合格率差异有统计学意义(χ2=12.11,P < 0.01),夏季金黄色葡萄球菌合格率最低(82.86%);行政楼、教学楼和综合楼电梯内部按钮的细菌总数、大肠菌群、金黄色葡萄球菌指标合格率差异均无统计学意义(χ2值分别为3.53,2.37,2.08,P值均>0.05)。  结论  某高校公用电梯内部按钮存在细菌污染,携菌率高、携菌量大且有致病菌的存在。相关部门需加强学校公用电梯内部按钮的消毒频率和效果监测,师生使用电梯后需增强手卫生意识。     

耐万古霉素金黄色葡萄球菌生物学特性改变对细菌鉴定和药敏结果的影响

目的了解耐万古霉素的金黄色葡萄球菌(金葡菌)生物学特性改变对细菌鉴定、药敏试验结果的影响。方法采用万古霉素体外诱导,将1株异质性耐万古霉素金葡菌(h-VRSA)逐步诱导为对万古霉素耐药的金葡菌(VRSA);观察金葡菌对万古霉素耐药后生物学特性变化规律;比较手工法、仪器法和聚合酶链反应(PCR)检测法等细菌鉴定结果,以及菌谱分析法、微量肉汤稀释法、纸片琼脂扩散法、E-test法和VITEK仪器法等药敏试验结果,评价细菌鉴定和药敏试验方法。结果金葡菌对万古霉素耐药后主要生物学特性为:菌落变小,溶血环和色素消失,血浆凝固酶、甘露醇、甘露糖等生化反应由阳性转为阴性。VRSA生物学特性改变可导致手工法和仪器法细菌鉴定结果错误,但对PCR检测鉴定结果没有影响;药敏试验比较显示,菌谱分析法可检测出h-VRSA和VI-SA,肉汤稀释法和E-test仅可检出VISA,纸片扩散法和仪器法不能检出金葡菌对万古霉素的耐药性。结论金葡菌对万古霉素耐药后生物学特性改变可导致细菌鉴定和药敏试验结果错误,应引起临床重视。     

西宁地区临床分离常见菌及耐药性分析

目的:了解西宁地区临床分离出的病原菌的组成及耐药状况,为临床合理用药提供依据。方法:对2011年6月-2011年12月临床采集的标本常规培养分离后,应用英国先德ARIS全自动微生物鉴定仪进行细菌鉴定和药敏检测,再以Micro.soft Excel2007进行药敏结果统计。结果:本地区的临床分离菌以大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、肠球菌为主,革兰阴性菌的敏感药物包括亚胺培南、阿米卡星、左氧氟沙星、头孢吡肟、头孢他啶,革兰阳性菌的敏感药物包括万古霉素、氯霉素、利福平、环丙沙星、四环素。结论:临床治疗感染应以本地区细菌种类和耐药监测结果为依据,合理应用抗生素。