卵巢癌抗独特型单链抗体6B11scFv/hGM-CSF融合蛋白质的表达及活性测定

目的：为提高卵巢癌抗独特型抗体的免疫原性，构建表达６Ｂ１１ｓｃＦｖ／ｈＧＭＣＳＦ融合蛋白质，并对其活性进行测定。方法：用ＤＮＡ重组技术，将以前构建的６Ｂ１１ｓｃＦｖＬｉｎｋｅｒｈＧＭＣＳＦ融合基因克隆至ｐＥＴ１６（ａ＋）表达载体，表达可溶蛋白质。用ＥＬＩＳＡ分析技术和细胞增殖试验测定融合蛋白质的抗体和细胞因子活性。结果：融合蛋白质实现可溶表达，能与ＣＯＣ１６６９单抗和小鼠抗人ＧＭＣＳＦ单抗特异结合，并能刺激ＧＭＣＳＦ依赖株增殖。结论：融合蛋白质保留了２种蛋白质的活性，为进一步研究其功能和临床应用提供基础     

卵巢癌抗独特型抗体／hGM—CSF融合蛋白质对体外免疫细胞的刺？…

目的 探讨卵巢癌抗独特型单链抗体６Ｂ１１ｓｃＦｖ／ｈＧＭ－ＣＳＦ融合蛋白（６Ｂ１１ＧＭ）作为肿瘤疫苗的可能性。方法 采用体外Ｔ细胞增殖试验,对６Ｂ１１ＧＭ刺激Ｔ细胞的能力进行测定,并用流式细胞仪对Ｔ细胞表型及ＡＰＣＭＨＣⅡ表达情况进行测定,测定了外周血单个核细胞经６Ｂ１１ＧＭ激活后对卵巢癌细胞系的非ＭＨＣ限制的杀伤活性,结果６Ｂ１１ＧＭ及６Ｂ１１均能引起特异的Ｔ细胞增殖,但６Ｂ１１ＧＭ组的增殖明显     

卵巢癌抗独特型单链抗体6B11scFv／hGM—CSF融合蛋白质 …

目的：为提高卵巢癌抗独特型抗体的免疫原性，构建表达６Ｂ１１ｓｃＦｖ／ｈＧＭ－ＣＳＦ融合蛋白质，并对其活性进行测定。方法：用ＤＮＡ重组技术，将以前构建的６Ｂ１１ｓｃＦｖ－Ｌｉｎｋｅｒ－ｈＧＭ－ＣＳＦ融合基因克隆至ｐＥＴ１６（ａ＋）表达载体，表达可溶蛋白质，用ＥＬＩＳＡ分析技术和细胞增殖试验测定融合蛋白质的抗体和细胞因子活性，结果：融合蛋白质可实溶表达，能与ＣＯＣ１６６－９单抗和小鼠抗人ＧＭ－ＣＳＦ单     

独特型瘤苗诱导免疫细胞对卵巢癌作用的体外实验研究

目的：研究卵巢癌抗独特型抗体诱导免疫效应细胞对卵巢癌的作用，探讨抗独特型抗体的免疫学特性。方法：用卵巢癌抗独特型抗体６Ｂ１１免疫杂交一代小鼠ＢＣＦ１，免疫部位为皮下多点，共免疫３次，间隔３周，对照组用正常鼠ＩｇＧ进行免疫，方法同上。于末次免疫后７天处死小鼠，取脾脏淋巴细胞作为效应细胞，与靶细胞ＳＫＯＶ３（卵巢浆乳癌细胞系）以不同比例混合，体外培养，观察效靶细胞的相互作用，用单盲法记数靶细胞活死比。结果：（１）培养１２小时后，效应细胞向靶细胞移动，２４小时后形成以靶细胞为中心的花环，４８～７２小时后形成以靶细胞为中心的细胞团，靶细胞灰暗，部分细胞内可见颗粒状物质；（２）靶细胞在培养２４、４８、７２小时的活死比明显低于对照组，效靶比为１００∶１至２５∶１时，靶细胞活死比最低。结论：６Ｂ１１免疫小鼠的脾淋巴细胞对ＳＫＯＶ３有特异性趋化和杀伤作用，作为免疫原能够诱导抗卵巢癌细胞免疫反应。     

卵巢癌抗独特型单链抗体诱导特异性体液免疫应答的动物实 …

目的：用卵巢癌抗独特型单链抗体６Ｂ１１ ｓｃＦｖ代替肿瘤抗原免疫动物，观察是否诱导动物产生特异性体液免疫反应。方法：将６Ｂ１１ｓｃＦｖ交联钥孔虫血蓝素，辅以弗氏佐剂反复免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，制备抗血清。     

卵巢癌6B11抗独特型微抗体诱导抗肿瘤免疫应答的体外实验

目的:研究6B11抗独特型微抗体在体外抗肿瘤免疫情况,探讨其作为卵巢癌疫苗的可能性.方法:分离人外周血单个核细胞,用6B11抗独特型微抗体刺激并培养.采用3HTdR参入法、51Cr细胞毒实验分别观察淋巴细胞增殖情况和细胞毒作用,ELISA方法测定用6B11微抗体刺激后培养上清液中IFN-γ水平的变化,流式细胞术检测微抗体刺激后淋巴细胞表型的改变.结果:6B11抗独特型微抗体可以刺激人外周血淋巴细胞的增殖,最佳刺激剂量为20 mg/L;并对OC166-9表达阳性的卵巢癌细胞系有细胞毒作用;用6B11微抗体刺激后培养上清液中IFN-γ水平升高;淋巴细胞的表型表现为,疫苗刺激后CD3 的细胞明显增高, CD4 的细胞也增加, CD8 的细胞增加不明显.CD4 /CD8 的比率明显增高,差异有统计学意义.结论:6B11抗独特型微抗体在体外可诱导机体产生特异体液免疫和细胞免疫反应,为抗独特型微抗体疫苗的临床应用提供了一定的实验依据.     

卵巢癌抗独特型单链抗体诱导特异性体液免疫应答的动物实验研究

目的：用卵巢癌抗独特型单链抗体６Ｂ１１ｓｃＦｖ代替肿瘤抗原免疫动物，观察是否诱导动物产生特异性体液免疫反应。方法：将６Ｂ１１ｓｃＦｖ交联钥孔虫戚虫血蓝素，辅以弗氏佐剂反复免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，制备抗血清。采用间接法ＥＬＩＳＡ，竞争抑制ＥＬＩＳＡ及免疫流式细胞法分析抗血清特性。结果：经ＥＬＩＳＡ检测显示，由６Ｂ１１ｓｃＦｖ刺激产生的抗抗独特型单链抗体（Ａｂ３）能与６Ｂ１１ｓｃＦｖ和卵巢癌组织抗原ＯＣ１６６９特异性结合。竞争抑制ＥＬＩＳＡ表明，Ａｂ３能有效抑制卵巢癌单抗ＣＯＣ１６６９（Ａｂ１）与ＯＣ１６６９的特异性结合。免疫流式分析结果可见，Ａｂ３能与表达卵巢癌抗原的人卵巢癌细胞系ＯＶ１细胞表面结合而不能与无卵巢癌抗原表达的人宫颈癌细胞系ＨｅＬａ细胞表面结合。从以上结果可以证明Ａｂ３与Ａｂ１的抗原结合特性相同。结论：６Ｂ１１ｓｃＦｖ能代替卵巢癌抗原诱导动物产生特异性体液免疫反应，具有模拟抗原的作用，为６Ｂ１１ｓｃＦｖ作为卵巢癌抗独特型单链抗体疫苗的实际应用提供依据     

重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子双体融合分子的三级结构模建

目的：验证重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｃｏｌｏｎｙｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ，ＧＭＣＳＦ） 双体融合分子（Ｇ２）较ＧＭＣＳＦ单体分子具有高活性的结构机制。方法：利用ＩｎｓｉｇｈｔＩＩ软件，采用同源性模建结合手工拼接的方法模建出Ｇ２ 融合分子的空间三级结构，并将其与ＧＭＣＳＦ单体的结构相比较。结果：模建出的Ｇ２ 融合分子前后两个结构单元在空间位置上相对独立，二者各自的三级构象及二级结构组成均与ＧＭＣＳＦ非常相似。另外，从受体结合位点的分析结果来看，Ｇ２ 分子在结构上有能力同时结合两分子的ＧＭＣＳＦ 受体。结论：Ｇ２ 融合分子中的两个ＧＭＣＳＦ结构单元在结构上基本保持了ＧＭＣＳＦ 单体分子的三级结构，其空间结构允许两分子的ＧＭＣＳＦ受体同时结合，引发受体间的交联，从而产生高活性。     

抗卵巢癌单链免疫毒素的载体构建及高效表达

目的:构建抗卵巢癌单链抗体183B2ScFv 与假单孢外毒素(peudononas exotoxin, PE38)的融合蛋白表达载体并制备抗人卵巢癌单链免疫毒素蛋白183B2ScFvPE38,为卵巢癌导向治疗打下基础.方法:采用基因工程技术,经过3次亚克隆,将编码单链抗体的基因及编码毒素的基因亚克隆至原核表达载体pET30a(+)上,并在IPTG的诱导下进行表达.采用直接ELISA及细胞杀伤对抗体及毒素部分的活性进行检查.结果:表达蛋白183B2ScFvPE38具有较好的抗体活性及毒素活性.结论:抗卵巢癌单链免疫毒素183B2ScFvPE38 具有良好的免疫学活性及生物学活性,可能有良好的应用前景.     

热休克蛋白融合蛋白对人树突状细胞分化成熟的刺激作用

目的：研究热休克蛋白融合蛋白对人树突状细胞分化成熟的刺激作用。 方法：采用GM-CSF和IL-4将人外周血单核细胞诱导成未成熟树突状细胞,然后用热休克蛋白融合蛋白刺激其分化成熟,以单核细胞条件培养液（MCM）和模拟的单核细胞条件培养液（MCM mimic）为对照。以流式细胞仪检测树突状细胞表面分子的表达情况。 结果：热休克蛋白融合蛋白可以刺激树突状细胞表面表达CD40、CD80、CD86和HLA-A2分子。结论：热休克蛋白融合蛋白可诱导人树突状细胞分化成熟。     

Humoral immune responses induced by anti-idiotypic ntibody fusion protein of 6B11scFv/hGM-CSF in BALB/c mice

Background We have previously developed and characterized a monoclonal anti-idiotype antibody, designated 6B11, which mimics an ovarian carcinoma associated antigen OC166-9 and whose corresponding monoclonal antibody is COC166-9 (Ab1). In this study, we evaluate the humoral immune responses induced by the fusion protein 6B11 single-chain variable fragment ( scFv)/ human granulocyte macrophage colony-stimulating factor (hGM-CSF ) and 6B11scFv in BALB/c mice. Methods The fusion protein 6B11scFv/hGM-CSF was constructed by fusing a recombinant single-chain variable fragment of 6B11scFv to GM-CSF. BALB/c mice were administrated by 6B11scFv/hGM-CSF and 6B11scFv, respectively. Results The fusion protein 6B11scFv/hGM-CSF retained binding to the anti-mouse F(ab) 2 ’ and was also biologically active as measured by proliferation of human GM-CSF dependent cell TF1 in vitro . After immunization with the 6B11scFv/hGM-CSF and 6B11ScFv, BALB/c mice showed significantly enhanced Ab3 antibody responses to 6B11scFv/hGM-CSF compared with the 6B11scFv alone. The level of Ab3 was the highest after the first week and maintained for five weeks after the last immunization. Another booster was given when the Ab3 titer descended, and it would reach to the high level in a week. Conclusion The fusion protein 6B11scFv/hGM-CSF can induce humoral immunity against ovarian carcinoma in vivo . We also provide the theoretical foundation for the application of the fusion protein 6B11scFv/hGM-CSF for active immunotherapy of ovarian cancer. Chin Med J 2006; 119(2): 131-139     

Humoral immune responses induced by anti-idiotypic antibody fusion protein of 6B11scFv/hGM-CSF in BALB/c mice

Background We have previously developed and characterized a monoclonal anti-idiotype antibody, designated 6B 11, which mimics an ovarian carcinoma associated antigen OC166-9 and whose corresponding monoclonal antibody is COC166-9 （Abl）. In this study, we evaluate the humoral immune responses induced by the fusion protein 6B11 single-chain variable fragment （scFv）/human granulocyte macrophage colony-stimulating factor （hGM-CSF） and 6B 1 lscFv in BALB/c mice. Methods The fusion protein 6B 11 scFv/hGM-CSF was constructed by fusing a recombinant single-chain variable fragment of 6B11scFv to GM-CSE BALB/c mice were administrated by 6B11scFv/hGM-CSF and 6B11scFv, respectively. Results The fusion protein 6B11scFv/hGM-CSF retained binding to the anti-mouse F（ab）2＇ and was also biologically active as measured by proliferation of human GM-CSF dependent cell TF1 in vitro. After immunization with the 6B11scFv/hGM-CSF and 6BllScFv, BALB/c mice showed significantly enhanced Ab3 antibody responses to 6B11 scFv/hGM-CSF compared with the 6B11 scFv alone. The level of Ab3 was the highest after the first week and maintained for five weeks after the last immunization. Another booster was given when the Ab3 titer descended, and it would reach to the high level in a week. Conclusion The fusion protein 6B11scFv/hGM-CSF can induce humoral immunity against ovarian carcinoma in vivo. We also provide the theoretical foundation for the application of the fusion protein 6B11 scFv/hGM-CSF for active immunotherapy of ovarian cancer.     

GM-CSF-tk融合基因转导人神经母细胞瘤株SH-SY5Y的抗瘤作用

目的:将单纯疱疹病毒胸苷激酶和粒细胞-单核细胞集落刺激因子融合基因(Lxpsp-hGM-CSF-Hytk)转导人恶性神经母细胞瘤株SH-SY5Y,观察外源融合基因的表达及其对肿瘤细胞的杀伤作用.方法:FuGENE6介导将含融合基因的逆转录病毒表达载体和仅含潮霉素磷酸转移酶基因的对照载体分别转染逆转录病毒包装细胞系PA317.以适量病毒上清转导SH-SY5Y,RT-PCR方法检测融合基因的存在;细胞因子依赖株TF-1的生长状况及丙氧鸟苷(GCV)杀伤实验鉴定融合基因的表达.结果:将重组病毒产生细胞PA317-GM-CSF-Hytk和PA317-Hy的病毒上清2ml分别转导SH-SY5Y,60 mg·L-1的潮霉素进行筛选,得到了稳定传代的阳性细胞集落SY5Y-GMHytk,SY5Y-Hy.RT-PCR检测阳性细胞集落中有外源的GM-CSF存在.用阳性细胞集落上清培养TF-1细胞,细胞成活.SY5Y,SY5Y-GMHytk,SY5Y-Hy 3种细胞的生长曲线无明显差别,但用不同浓度GCV分别作用于此3种细胞显示:0.03～300 mg·L-1的GCV对SY5Y-GMHytk有明显的杀伤作用(IC50=3 mg·L-1),而对另外两种细胞几乎无毒性作用(IC50＞300 mg·L-1).30 mg·L-1GCV作用96 h后可杀死80%以上的SY5Y-GMHytk细胞.结论:应用逆转录病毒介导,将融合基因GMCSF-tk成功地导入了SH-SY5Y肿瘤细胞株,并观察到外源融合基因的表达及HSV-tk/GCV体系对肿瘤细胞的杀伤作用.     

半胱氨酸对原核表达的pS2融合蛋白复性的影响

目的:分析半胱氨酸对变性pS2融合蛋白复性的影响.方法:经半胱氨酸处理与不处理的纯化pS2融合蛋白与抗 pS2多抗血清及进口pS2单抗于37 ℃孵育1 h后,再进行酶联免疫吸附试验(ELISA)和免疫组织化学试验(IHC).此二种pS2融合蛋白经15%(质量比)SDS-PAG E后进行Western blotting分析.结果:ELISA、IHC、 Western blotting 结果显示,用半胱氨酸处理pS2融合蛋白后,其抗原性明显提高,提示pS2 融合蛋白经剧烈变性复性后,pS2三叶草结构域二硫键绝大部分发生错配而导致其抗原性丧失.结论:在变性 pS2融合蛋白复性中半胱氨酸对二硫键正确配对起重要作用.