抗人VEGF165单链抗体的构建与表达

为降低鼠源抗体对人体的免疫原性,构建表达了ＶｍＤ１１的单链抗体。方法用ｏｖｅｒｌａｐＰＣＲ构建出单链抗体的基因,克隆入表达载体ｐＫｐＬ－３ａ,在大直菌ｏｐｏ２１３６中表达,采用抗原结合ＥＬＩＳＡ和竞争抑制ＥＬＩＳＡ测定活性。结果经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ检测,诱导后的细菌表达了２６ｋＤ的蛋白;ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ证实该蛋白为表达的单链抗体。经变性,复性后,该单链抗体可特异结合人ＶＥＧＦ１６５抗原,并与Ｖ     

抗人红细胞H抗原单链抗体基因克隆和表达

目的 克隆抗人红细胞H抗原单克隆抗体轻、重链可变区(VH、VL)基因并构建单链抗体(ScFv)基因及其表达载体,实现其在原核细胞中的表达.方法 从分泌抗人红细胞H抗原单克隆抗体的杂交瘤细胞株2FA中提取总RNA,采用RT-PCR法获得抗人红细胞H抗原单克隆抗体的VH、VL基因;利用重叠引物延伸法(splicing by overlap extension,SOE)将轻重链可变区基因连接,并引入连接肽(Linker)编码序列,构建VH-Linker-VL结构的单链抗体(ScFv)基因,将其克隆到原核表达载体pET-his中,转化BL21(DE3)plysS细胞,IPTG诱导表达;获得的目的蛋白经纯化后,用SDS-PAGE与Westem blotting对目的蛋白进行鉴定,间接EHISA、竞争ELISA和免疫荧光法检测目的蛋白的活性.结果 克隆的VH基因长度为351 bp,属于鼠抗体可变区重链基因家族I(B)亚群;VL基因长度为339 bp,属于鼠抗体可变区轻链基因家族I亚群;SOE法克隆的单链抗体基因为750 bp;构建的含原核表达载体的菌株经IPTG诱导后,SDS-PAGE及Western blotting法检测到Mr 32 000的目的蛋白(表达的ScFv);ScFv纯化后,经免疫荧光法、间接与竞争HLISA法检测到该ScFv蛋白具有生物结合活性.结论 成功地克隆了抗人红细胞H抗原单克隆抗体VH与VL基因和ScFv基因,构建ScFv基因的表达载体,实现了ScFv在大肠杆菌BL21(DE3)plysS细胞中的活性表达,为基于红细胞H抗原的免疫检测技术建立奠定了基础.     

抗人整合素αυβ3单链抗体的构建和表达

目的：利用基因工程抗体技术构建抗人整合素αυβ3单链抗体(scFv)。方法：从分泌抗人整合素αυβ3单抗(mAb)的杂交瘤细胞E10总RNA中，用RT-PCR扩增VH和VL基因，对其核苷酸序列分析后，通过PCR在VH和VL基因间插入柔性连接子(Gly4Ser)3 组装成scFv基因，并克隆至原核表达载体pTIG—TRX中。以重组子转化大肠杆菌B121(DE3)诱导目的基因表达。结果：转化菌可表达相对分子质量(Mr)为31000的scFv。Western blot证实，具有His6标签蛋白的表达。经低剂量的IPTG诱导和较低温度培养，scFv获得了可溶性形式表达。表达产物经Ni—NTA琼脂糖层析纯化后纯度达91％以上。ELISA鉴定证实，scFv具有良好的抗原结合活性。结论：成功地构建并表达抗人整合素αυβ3的scFv，为进一步临床研究奠定了基础。     

抗G7单链抗体-AP融合蛋白的构建、表达与鉴定

目的:为了便于临床检测,建立一种G17新型免标自指示剂,用原核表达系统表达抗胃泌素单链抗体融合蛋白(ScFv-AP).方法:通过构建重组质粒pET32a-scFv-AP,选择合适的感受态细胞Rosetta(DE3)及优化表达条件制得目的蛋白.利用固定化金属离子亲和层析技术得到纯品蛋白.再将其作为检测探针运用到双抗体夹心...     

抗HIV-1 gp120单链抗体和白喉毒素融合基因的构建及其在大肠杆菌中的表达

目的 构建人源抗HIV-1单链抗体和白喉毒素融合基因的原核表达质粒,并诱导其在大肠杆菌中表达重组蛋白.方法通过PCR扩增,获得目前应用较多的DAB389基因片段,将其克隆入原核表达载体pET-28a,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,经SDS-PAGE和Western blot方法分析鉴定.结果酶切及DNA序列测定鉴定正确.SDS-PAGE和Western Blot分析证实,重组质粒可表达出相对分子质量为75 200的蛋白,与DT-hs120融合基因子量一致,其表达量约占菌体总蛋白的21%,表达形式主要为包涵体.结论 成功构建了DT-hS120表达载体,并获得了高效表达.     

抗GD2/抗CD16单链双特异性抗体的构建及在大肠杆菌中的表达

利用重叠PCR(overlap-PCR)将抗GD2表面抗原GD2的单链抗体基因m-ScFv和抗CD16的单链抗体基因NM3E2融合在一起,得到新型的单链双特异性抗体基因n-m,双抗的联接肽序列为SerGly4Ser,在肽连的C端引入了6×his以利于纯化。该双特异性抗体基因的序列经测序验证后,连接表达载体pET-22b( ),转化大肠杆菌菌株BL21(DE3),诱导表达,凝胶成像系统扫描显示表达的外源融合蛋白约占菌体总蛋白的27%。表达蛋白分泌于胞质空间,经超声波破胞后收集上清,经Ni 亲和层析柱分离,纯度可达90%以上。经SDS-PAGE及Westernblotting鉴定表达蛋白的分子量为53KD,与预期的相符。     

抗血小板膜糖蛋白单克隆抗体SZ—21基因克隆及单链抗体的构建和表达

目的 将能与血小板膜糖蛋白Ⅲa特异结合的单克隆抗体SZ-21构建成单链抗体,为其临床应用奠定基础。方法 通过逆转录及多聚酶甸反应,扩增并克隆SZ-21的可变区基因VH、VL,经测序后构建SZ-21单链抗体（SZ-21AScFv),在大肠杆菌中进行表达,ELISA和Western印迹检测其与血小板的结合特性。结果 VH、VL可变区基因符合小鼠抗体可变区特征,SZ-21ScFv基因拼接正确。表达产物除少量为分泌型外,主要以包涵体形式存在,表达量占菌体蛋白的21%,经过变性和复性后,该单抗体保留了与血小板特异结合的能力。结论 成功表达了SZ-21单链抗体。该小分子抗体具有特异结合血小板的能力,有望用于抗血栓治疗。     

人源化抗肾小球基底膜抗体的单链抗体scFv3的原核表达及鉴定

目的:在原核细胞中构建并表达抗肾小球基底膜(GBM)抗体单链抗体scFv3,并鉴定其活性。方法:用PCR扩增抗GBM抗体单链抗体scFv3基因,将scFv3 DNA与pGEM-T Easy质粒连接,构建克隆载体pGEM-scFv3。用酶切后电泳鉴定构建载体的正确性;测序检测质粒重组后序列有无改变。再将scFv3亚克隆入表达载体pQE-80L,构建pQE80L-scFv3重组质粒,转化大肠杆菌Rosetta2,酶切鉴定。IPTG诱导表达蛋白后,通过SDS-PAGE和Western blot鉴定表达产物的抗体活性。结果:PCR扩增scFv3 DNA片段约为750 bp,与预期结果相同;克隆载体pGEM-scFv3酶切后显示scFv3成功的克隆入pGEM-T Easy质粒;测序验证插入片段全序列无改变;表达载体pQE80L-scFv3酶切图谱与预期相同;SDS-PAGE显示,在分子量约为27 kD处可见目的蛋白带,Western blot证实scFv3能与抗GBM抗体结合。结论:成功构建并表达了抗GBM抗体的单链抗体scFv3蛋白,为进一步研究scFv3的生物学特性和基因工程抗体的制备奠定了基础。     

抗人整合素ανβ3单链抗体的构建和表达

目的 :利用基因工程抗体技术构建抗人整合素ανβ3 单链抗体(scFv)。方法 :从分泌抗人整合素ανβ3 单抗 (mAb)的杂交瘤细胞E10总RNA中 ,用RT PCR扩增VH 和VL 基因 ,对其核苷酸序列分析后 ,通过PCR在VH 和VL 基因间插入柔性连接子(Gly4Ser) 3,组装成scFv基因 ,并克隆至原核表达载体pTIG TRX中。以重组子转化大肠杆菌BL2 1(DE3 )诱导目的基因表达。结果 :转化菌可表达相对分子质量 (Mr)为 3 10 0 0的scFv。Westernblot证实 ,具有His6标签蛋白的表达。经低剂量的IPTG诱导和较低温度培养 ,scFv获得了可溶性形式表达。表达产物经Ni NTA琼脂糖层析纯化后纯度达 91%以上。ELISA鉴定证实 ,scFv具有良好的抗原结合活性。结论 :成功地构建并表达抗人整合素ανβ3 的scFv ,为进一步临床研究奠定了基础。     

抗人CD4单链抗体的表达及其分离纯化

本研究将构建的抗人ＣＤ３单链抗体基因，克隆到融合蛋白表达载体ｐＧＥＸ－４Ｔ－１，用ＩＰＴＧ诱导表达ＧＳＴ－ＳｃＦｖ融合蛋白，并以ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析，在Ｍｒ为５２０００左右出现的一条新生蛋白带，表达量约占菌体总蛋白的４０％。经初步纯化和复性后，用ＧＳＴ亲和色谱纯化，再经凝血酶水解获得抗人ＣＤ３ＳｖＦｖ，竞争结合抑制实验证明，该表达产物具有ＣＤ３亲和活性。     

GAP-43原核表达载体的构建、表达及抗GAP-43单克隆抗体的制备

目的：原核表达神经生长相关蛋白-43(GAP-43)，并制备抗GAP-43的单克隆抗体(mAb)。方法：从含有GAP-43 cDNA的质粒中，用PCR扩增GAP-43 cDNA的全长编码序列，克隆人表达载体pGEX-4T-1中，构建GAP-43的高表达工程菌，并以IPTG诱导表达日的蛋白。通过亲和层析法纯化表达的GST-GAP-43融合蛋白，并以此为抗原制备mAb。结果：酶切鉴定证明，获得含有目的基因片段的重组质粒.表达的GST-GAP-43融合蛋白以可溶性的形式存在。ELISA检测表明，获得的抗GAP-43 mAB效价为1：10^8，其IgG的亚类为IgG2a，亚型为κ型。用Western blot检测大鼠脑匀浆蛋白，在相对分子质量(Mr)为50000处有一条特异性带。用此mAb进行荧光免疫法检测表明，在致敏豚鼠的肺切片中，有GAP-43阳性的神经纤维。结论：所获抗GAP-43mAb的特异性强、效价高，对进一步研究(GAP-43在神经系统中的作用提供了有用的试剂。     

人源化抗炭疽芽胞杆菌保护性抗原单链抗体的设计和表达

目的:应用抗体"框架区重塑"技术,对鼠单克隆抗体(mAb)框架区进行人源化,制备人源化单链抗体(scFv)并检测其活性。方法:在获得抗炭疽芽胞杆菌保护性抗原鼠mAb(5E1)可变区基因的基础上,保持鼠mAb互补决定区(CDR)不变,选择与框架区同源性最高的人源序列替换鼠mAb的框架区,保留个别关键的鼠源残基。通过融合PCR技术构建人源化的scFv,并在大肠杆菌中进行了表达。表达产物以包涵体形式存在,通过变性、镍柱亲和层析和复性,获得复性后的可溶蛋白。对纯化产物进行了SDS-PAGE、ELISA和抑制炭疽毒素中和活性的检测。结果:人源化后的序列具有与鼠源scFv一致的抗原结合活性和细胞水平的中和炭疽毒素活性。结论:获得了具有功能的人源化的抗体基因序列,为表达具有中和炭疽毒素活性的全分子人源化抗体奠定了基础。     

全人源性肝癌单链抗体的表达、纯化及功能鉴定

目的:在大肠杆菌中表达人源性肝癌单链抗体(scFv),并分析他的结合活性。方法:应用噬菌体表面呈现技术获得人源性肝癌scFv,利用重叠延伸PCR将VL和VH基因以(Gly4ser)3linker连接成单链,插入表达载体pET28a( ),诱导目的蛋白表达,对包涵体进行溶解、复性、纯化,得到可溶性目的蛋白,应用非竞争细胞ELISA检测与肝癌细胞结合的特异性及结合能力。结果:在A600为0.8时开始诱导,持续6h,目的蛋白表达量占菌体总蛋白的26%,包涵体经过复性纯化后,得到纯度达到95%的重组scFv,其亲和常数为:3.6×107mol/L。结论:实现了人源性肝癌scFv的蛋白表达,抗体蛋白与肝癌细胞具有较强的特异性结合能力,为今后进行免疫学检测和开发肿瘤靶向治疗提供了研究手段。     

Comparison of tests for antibody to hepatitis E virus

The results of serologic tests for hepatitis E virus have varied widely from laboratory to laboratory, making interpretation of seroepidemiologic studies difficult. The present study compares serologic results with different antigens and tests developed in two laboratories for their ability to diagnose hepatitis E and measure antibody prevalence in a high risk population in Saudi Arabia. The results confirm that tests based upon open reading frame (ORF) 3 of HEV are of limited value for seroepidemiologic studies, whereas ORF2-based antigens have broad utility and yield data that are reproducible in more than one laboratory. J. Med. Virol. 55:134–137, 1998. © 1998 Wiley-Liss, Inc.     

人核糖体蛋白S13的原核表达、纯化及多克隆抗体的制备

目的克隆人核糖体蛋白S13(ribosomal protein S13,RPS13)cDNA全长,构建原核表达质粒,诱导表达、纯化RPS13蛋白并制备其多克隆抗体。方法应用RT-PCR方法从胃癌多药耐药细胞SGC7901/VCR中扩增出RPS13的cDNA全长,利用DNA重组技术构建重组原核表达载体pET-28a( )-RPS13,双酶切及测序鉴定。将重组载体转化入大肠杆菌BL21中,筛选抗性克隆并经DNA测序证实。IPTG诱导融合蛋白的表达,利用镍离子亲和层析柱提纯融合蛋白,经SDS-PAGE和Western blot鉴定。用纯化的融合蛋白His-RPS13免疫BALB/c小鼠,ELISA法测定抗体效价,饱和硫酸铵沉淀法纯化抗体,Western blot检测抗体活性。结果RT-PCR扩增片段与预计目的基因片段大小一致;双酶切鉴定表明,重组表达载体pET-28a( )-RPS13构建成功,DNA测序结果显示所获基因序列与GenBank中收录完全相同。IPTG诱导3h后,经SDS-PAGE检测显示在Mr19000处出现一新生条带,与预计的融合白大小一致;利用抗His标签的抗体进行Western blot,结果证实融合蛋白表达成功。其免疫血清经Western blot证实可特异性的识别蛋白RPS13。结论成功地获得了RPS13的编码基因序列,并获得了纯化的RPS13蛋白质,为制备RPS13的单克隆抗体、进一步研究RPS13在肿瘤中的作用奠定了基础。     

溶藻弧菌抗独特型抗体单链抗体在毕赤酵母中的表达

目的构建溶藻弧菌抗独特型抗体的单链抗体(scFv)基因的毕赤酵母分泌型表达载体,并对其表达的蛋白进行免疫原性鉴定。方法从分泌溶藻弧菌抗独特型抗体的杂交瘤细胞株(2F4)中克隆该抗体的重链可变区(VH)基因和轻链可变区(VL)基因(GenBank accession No:DQ011530和DQ011531),并通过基因重组为scFv基因。然后将其克隆入毕赤酵母菌分泌型表达载体pPIC9K中,经序列测定后,电转化入毕赤酵母菌SMD1168中,将经表型筛选和G418抗性筛选的重组酵母菌株进行PCR鉴定。以甲醇进行诱导表达,表达后的重组蛋白利用动物免疫试验进行免疫原性鉴定。结果获得毕赤酵母菌分泌型表达载体pPIC9K-scFv,经G418浓度梯度筛选及PCR鉴定得到高拷贝整合的重组酵母菌株,ELISA测定和动物免疫试验显示抗独特性抗体的scFv具有与溶藻弧菌一样的免疫原性。结论构建溶藻弧菌抗独特型抗体的scFv基因的真核表达载体并成功表达,为进一步研究其生物学活性奠定了基础。     

SARS冠状病毒核衣壳蛋白的重组表达及其单克隆抗体的制备

目的: 表达SARS冠状病毒核衣壳蛋白(N蛋白),并以表达产物为免疫原制备特异性单克隆抗体 (mAb)。方法: 采用RT- PCR方法, 从灭活的病毒抗原标本中扩增编码N蛋白的基因。测序确认后, 再亚克隆至原核表达载体中。从SDS -PAGE凝胶中回收原核表达产物后免疫BALB/c小鼠, 经融合、筛选制备特异性mAb。结果: 从标本中扩增出 1 269bp的DNA, 测序结果证实为N蛋白基因。将该基因克隆至原核表达载体中后, 在大肠杆菌中获得了较好的表达。表达产物经SDS- PAGE后, 在Mr约为 43 000处可见 1条明显的诱导表达带。Westernblot的结果表明, 该电泳带与SARS患者的恢复期血清呈特异的免疫反应。从SDS- PAGE凝胶中回收表达产物并免疫BALB/c小鼠, 制备出 3株抗N蛋白的mAb。这些mAb与SDS- PAGE凝胶上Mr约为 43 000的蛋白带也呈现很强的免疫反应。结论: 所获的重组N蛋白及特异性mAb, 将为进一步建立SARS病毒感染早期诊断的方法奠定了基础。     

去唾液酸糖蛋白受体特异性单链抗体的优化表达及亲和常数的测定

目的:表达及纯化抗去唾液酸糖蛋白受体(ASG-PR)的单链抗体的可溶性,并测定其亲和常数。方法:用噬菌体C1克隆感染E.coliHB2151,挑取单个菌落接种于2×TY培养基中,于37℃震荡培养过夜。将培养物作1∶100稀释并转种后,用终浓度为0.25、0.5、1.0mmol/L的IPTG,分别在37℃、25℃和20℃下诱导表达过夜。取其培养上清,用饱和硫酸铵沉淀后,以120g/LSDS-PAGE分析。另外,将饱和硫酸铵沉淀物用30mLPBS重新溶解、透析除盐后,用Ni2 螯合柱进行纯化,再以120g/LSDS-PAGE鉴定纯化scFvC1的纯度。用非竞争酶免疫法测定scFv的亲和常数。结果:用0.5mmol/LIPTG在25℃诱导过夜,表达的scFvC1的量较多,其相对分子质量(Mr)约为28000,以可溶性的形式存在于培养基中。通过Ni2 亲和柱纯化后scFvC1的纯度在95%以上,产量约为0.8mg/L。scFv的亲和常数为(2.31±0.36)×10-7mol/L。结论:以筛选的C1噬菌体感染E.coliHB2151后可表达低亲和力的可溶性scFv,对肝癌的基因治疗具有潜在的应用价值。     

抗人卵巢癌×抗人CD3双特异单链抗体介导的效应细胞在体外对卵巢癌细胞的杀伤作用

目的　研究双特异单链抗体 (scBsAb)介导的Jurkat细胞 (CD3+ )及人外周血单个核细胞(PBMC)在体外对人卵巢癌细胞株SKOV3细胞的杀伤活性 ,从而探讨其用于卵巢癌治疗的可能性。方法以抗人卵巢癌×抗人CD3scBsAb激活效应细胞 ,以SKOV3为靶细胞 ,用MTT法测定不同实验条件下的杀伤活性。结果　 (1)以重组白细胞介素 2 (rIL 2 )、抗CD3单克隆抗体、抗CD2 8重链单域抗体 (VH)预刺激Jurkat及PBMC细胞比单纯用scBsAb激活效应细胞杀伤活性高 ;(2 )以Jurkat细胞或PBMC细胞作为杀伤细胞可得到相似的杀伤活性 ,最高杀伤率均在 75 %左右 ;(3)杀伤活性与scBsAb的浓度、作用时间及效靶比有关。对于Jurkat细胞 ,在抗体终浓度为 2 1μg ml,反应时间为 4 8h ,效靶比为 10∶1时达到最大杀伤率 74 .8% ;对于PBMC细胞 ,在抗体浓度为 2 0 μg ml,反应时间为 72h ,效靶比为 1∶1时达到最大杀伤率73.1%。 (4 )多因子联合应用能有效提高杀伤活性。结论　scBsAb在体外能够有效介导效应细胞杀伤肿瘤细胞 ,有明显的抗癌作用 ,具有潜在的应用前景。     

Detection of IgA class antibody to hepatitis E virus in serum samples from patients with hepatitis E virus infection

A newly developed assay for IgA class antibody to hepatitis E virus (IgA anti-HEV) was used to study 145 serum samples collected during an outbreak of an enterically transmitted hepatitis that occurred in 3 villages in the lower Shebeli region of Southern Somalia between January, 1988 and November, 1989. A total of 52.4% of the afflicted patients were found positive for IgA anti-HEV, and 73.1% of these were also positive for IgM. Both antibodies disappeared during the convalescence period. Similar results were also seen in serum obtained from sporadic cases of acute waterborne hepatitis in Pakistan. © 1993 Wiley-Liss, Inc.