缺氧/复氧损伤对大鼠海马神经元过氧化物酶体增殖物激活受体γ表达的影响

目的：观察过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）在神经元缺氧/复氧损伤不同时间的表达,以探讨PPARγ在神经元缺血再灌注损伤过程中的作用。方法：以新生1d的SD大鼠为研究对象,采用海马神经元原代培养技术,给原代培养的神经元缺氧、缺糖15min后再恢复氧和葡萄糖供应,建立体外神经元类缺血再灌注模型,JEM-200EX透射电子显微镜观察缺氧/复氧后不同时间神经元结构变化,采用RT-PCR检测PPARγmRNA表达,Western印迹方法检测PPARγ蛋白表达。结果：神经元缺氧/复氧处理后不同时间,神经元正常结构出现损害。复氧0h,PPARγ表达与对照组相比无明显变化（P〉0.05）;复氧6h,PPARγ表达在mRNA和蛋白水平出现降低,与对照组相比差异有统计学意义（P〈0.01）,而且随着时间的延长表达逐渐降低,到48h达到最低,不同时间点之间及与对照组之间差异有统计学意义（P〈0.01）。结论：PPARγ参与神经元缺血再灌注损伤的病理过程,有望成为缺血性脑血管病治疗的干预靶点。     

大鼠神经元体外类缺血再灌注模型的建立及神经元损伤的动态监测

目的:建立类神经元缺血再灌注模型,观察单个神经元缺氧/复氧后不同时间细胞结构变化。方法:对大鼠海马神经元进行原代培养,采用神经元特异性烯醇化酶(NSE)免疫组织化学染色鉴定,通过缺氧/复氧建立体外神经元类缺血再灌注模型,透射电子显微镜观察类缺血再灌注后不同时间点神经元结构的变化。结果:海马神经元缺氧/复氧后受到了损伤,结构发生了变化,并且随着缺氧/复氧时间的延长,神经元损伤程度增加。结论:体外神经元类缺血模型的建立可以很好观察神经元缺血再灌注后的结构变化,为研究缺血性脑血管病提供很好的研究和途径。     

AQP4在新生大鼠实验性星形胶质细胞缺氧损伤模型中的表达变化及意义

目的 探讨水通道蛋白4（AQP4）在原代培养新生大鼠星形胶质细胞（AC）缺氧和缺氧后再复氧损伤模型中的表达改变及其意义。方法 原代培养成熟的AC随机分成常氧培养组（对照组）、缺氧组和复氧组。缺氧组AC在缺氧条件下分别培养3h、6h、12h和24h,复氧组AC缺氧培养12h后更换为常氧培养,分别培养3h、6h、12h和24h。各组样品采用Real Time PCR和免疫荧光染色分别测定AQP4 mRNA和蛋白表达水平。结果 随着缺氧时间延长,AQP4 mRNA和蛋白表达水平进行性降低,复氧时则先降低,后回升。结论 AQP4表达下降可能与脑水肿的发生有关,AQP4可能对脑内渗透平衡重建起重要作用。     

钙敏感受体及钙蛋白酶在大鼠脊髓神经元缺氧复氧损伤中的表达及其意义

目的: 探究大鼠脊髓神经元缺氧复氧损伤中钙敏感受体及钙蛋白酶的表达变化及其意义。方法: 将原代培养的新生SD大鼠脊髓神经元随机分成4组：正常对照组、缺氧复氧组、激活组、抑制组。后3组神经元均制备缺氧复氧损伤模型,激活组加入钙敏感受体激动剂GdCl3,抑制组加入受体抑制剂NPS2390。应用Hoechst 33258染色观察各组脊髓神经元凋亡;应用免疫荧光技术分析钙敏感受体及钙蛋白酶蛋白在脊髓神经元的表达定位;采用蛋白质印迹法检测各组钙敏感受体、钙蛋白酶以及Bax蛋白的表达水平。结果： 与对照组比较,缺氧复氧组脊髓神经元凋亡增加,并且钙敏感受体、钙蛋白酶、Bax蛋白的表达明显升高（均P<0.01）;GdCl3可明显增强上述作用,而NPS2390可明显抑制上述作用。结论： 在缺氧复氧损伤过程中,脊髓神经元凋亡增加,钙敏感受体及钙蛋白酶表达增多。     

神经元特异性烯醇化酶在神经元氧糖剥夺损伤模型复氧后的表达变化

目的 探讨神经元特异性烯醇化酶（NSE）在体外培养神经元氧糖剥夺损伤模型复氧后的水平变化。方法 体外原代培养24 h内的新生SD大鼠海马区神经元,应用免疫荧光染色及电子显微镜鉴定神经元,应用体外氧糖剥夺建立大鼠海马区神经元缺血低氧损伤模型,分别对复氧1、6、12、24、48、72 h神经元提取蛋白质,Western blotting法检测不同时间点神经元损伤模型中NSE表达水平。结果 培养第4天的细胞免疫荧光染色显示神经元细胞核染色清晰,形态典型,突起走形如网状,阳性率为（93.6±1.6）%。各组NSE蛋白表达比较,差异有统计学意义（F=500.75,P＜0.01）。实验组损伤后各时间点NSE蛋白表达高于对照组,细胞培养24、48 h NSE蛋白表达均高于其他时间点（P＜0.05）。结论 NSE可作为自发性蛛网膜下腔出血（SAH）后早期脑损伤（EBI）标志物,能够反映脑组织的损伤程度。     

缺氧复氧诱导大鼠心肌细胞内质网应激反应

目的:观察大鼠心肌细胞缺氧复氧时内质网应激蛋白表达的改变及其意义,以探讨心肌缺血再灌注损伤与内质网应激的关系.方法:原代培养乳鼠心肌细胞,缺氧5.5 h后复氧2～24 h制备缺氧复氧损伤模型,用Western blot和RT-PCR方法测定内质网应激蛋白GRP78表达水平.2-脱氧葡萄糖作为本实验的阳性对照,2-脱氧葡萄糖孵育心肌细胞10 h,用Western blot和RT-PCR检测GRP78表达水平.结果:缺氧复氧处理的心肌细胞活力减低,胞内乳酸脱氢酶漏出.与对照组比较,缺氧复氧组心肌细胞内质网应激蛋白GRP78在蛋白及mRNA水平表达均于复氧后2 h开始增加,4 h达峰值,蛋白水平为对照组的142%,mRNA水平为对照组的200%,表达的增加可持续到复氧24 h.结论:缺氧复氧可以诱导心肌细胞内质网应激.     

Urocortin抑制心肌缺血再灌注诱导的自噬

目的 研究uroeortin (UCN)对缺血再灌注诱导的心肌细胞自噬的影响,探讨UCN的心肌保护机制.方法 构建大鼠在体心脏缺血再灌注损伤和离体新生大鼠心肌细胞的缺氧复氧模型,进行缺血/缺氧1h再灌注/复氧2h的损伤,在缺血/缺氧前1h给予UCN预处理;在再灌注/复氧2h后观察UCN对缺血再灌注/缺氧复氧诱导的心肌损伤、细胞自噬和自噬相关基因表达的影响.结果 UCN预处理可以显著降低缺血再灌注损伤导致的心肌损害,使梗死面积降低,血清肌酸激酶(CK)、乳酸脱氢酶(LDH)降低;增加缺氧复氧离体心肌细胞活力、减少培养上清的LDH水平.与上述心肌保护作用相伴随的是UCN预处理还能抑制缺氧复氧导致的心肌细胞自噬,使LC3BⅡ/LC3BI的比值显著降低,并且抑制自噬相关基因Beclin1、Bni p3的mRNA表达.结论 UCN可以抑制缺血再灌注诱导的心肌细胞自噬,可能在抗缺血再灌注损伤中起重要作用.     

盐酸椒苯酮胺对耳蜗缺血再灌注后白介素-1β、肿瘤坏死因子-α mRNA及Fas 蛋白表达的影响

目的探讨豚鼠耳蜗白介素-1β（IL-1β）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）mRNA、Fas蛋白表达与耳蜗缺血再灌注损伤关系及盐酸
椒苯酮胺（PPTA）对豚鼠耳蜗缺血再灌注损伤保护机制。方法豚鼠64只随机分为4组,每组16只,分别为正常组、空白对照组、
缺血再灌注对照组和缺血再灌注PPTA组,每组随机选6只用于RT-PCR检测,剩余10只用于免疫组化。微血管夹夹闭双侧椎
动脉及右侧颈总动脉1 h松开动脉夹以制造耳蜗缺血模型,缺血再灌注PPTA组于缺血1 h再灌注后立即经股静脉注射PPTA
（10 mg/kg）,缺血再灌注对照组注射等量生理盐水,24 h后取标本。用RT-PCR法检测IL-1β和TNF-α的mRNA的表达。结果
缺血再灌注对照组耳蜗组织IL-1β、TNF-α mRNA表达量显著高于正常组和空白对照组（P<0.001）;缺血再灌注PPTA组耳蜗组
织IL-1β mRNA、TNF-α mRNA表达量显著低于缺血再灌注对照组（P<0.001）;缺血再灌注组Corti器、螺旋神经节和血管纹Fas
表达阳性,积分光密度值（IOD）值较其它三组明显增高（P<0.05）,缺血再灌注PPTA干预组IOD值与正常组及空白对照组差异
无统计学意义（P>0.05）。结论PPTA可抑制缺血再灌注耳蜗各部位IL-1β、TNF-α mRNA、Fas蛋白表达;PPTA可能通过抑制炎
性反应及抑制细胞凋亡实现对耳蜗缺血再灌注损伤的拮抗作用。
     

异丙酚对缺氧复氧损伤人血管内皮细胞caspase-3和Bcl-2蛋白表达的影响

目的探讨异丙酚对缺氧复氧损伤所致人血管内皮细胞凋亡及caspase-3、Bcl-2蛋白表达的影响。方法建立人脐静脉内皮细胞缺氧复氧损伤模型。将细胞缺氧培养30min再复氧,或加入不同浓度异丙酚孵育30min后再进行缺氧复氧处理,在复氧不同时相点（2、6、24和48h）以流式细胞仪计数凋亡细胞数量,并采用免疫细胞化学方法检测caspase-3和Bcl-2蛋白表达的变化。结果缺氧复氧后内皮细胞呈现典型的凋亡形态,复氧2h凋亡细胞数量开始增加,复氧6h时升高显著,至24h达峰值;异丙酚明显抑制复氧后细胞凋亡的发生。正常体外培养人血管内皮细胞Bcl-2蛋白表达较低,随复氧时间延长Bcl-2表达明显下调;25μmol/L异丙酚预处理可使复氧后内皮细胞Bcl-2表达升高,与相应缺氧复氧组比较差异有显著性（P〈0.01）,50、100μmol/L异丙酚组作用相似,不同浓度异丙酚作用呈现一定的剂量效应关系。缺氧复氧损伤使caspase-3蛋白表达增强,复氧24h后达高峰;异丙酚预处理以剂量依赖方式显著下调caspase-3表达（P〈0.01）。结论异丙酚降低缺氧复氧损伤所致的内皮细胞凋亡,可能与其抑制缺氧复氧引起的caspase-3活化、上调Bcl-2蛋白表达有关。     

IPI549调控小鼠肝脏缺血再灌注损伤的作用研究

目的：研究IPI549特异性抑制PI3Kγ对小鼠肝脏缺血再灌注损伤的作用。方法：构建C57BL/6J小鼠肝脏缺血再灌注损伤模型和RAW264.7巨噬细胞缺氧复氧模型,给予IPI549（PI3Kγ抑制剂）干预,以ALT、HE染色、TUNEL判断肝脏损伤情况,Western blot检测组织和原代细胞p110γ（PI3Kγ）蛋白表达变化和RAW264.7细胞缺氧复氧过程TNF-α、JNK、p-JNK蛋白表达情况,ELISA检测细胞上清TNF-α水平。结果：相比于原代肝细胞,枯否细胞明显高表达p110γ。与Sham组比较,IR组肝组织中p110γ的蛋白水平降低;使用PI3Kγ特异性抑制剂（IPI549）干预小鼠,可加重小鼠肝脏缺血再灌注后肝组织损伤和肝脏组织细胞凋亡,而利用GdCl3预处理封闭枯否细胞,可使得IPI549引起的肝组织细胞损伤和凋亡加重得到缓解。在体外实验中,IPI549干预使RAW264.7细胞缺氧复氧过程JNK磷酸化水平升高、TNF-α蛋白表达增加,细胞上清TNF-α分泌增多。结论：PI3Kγ抑制剂IPI549干预使小鼠肝脏缺血再灌注损伤加重,其机制与IPI549抑制枯否细胞中的PI3Kγ影响JNK信号通路的活化,发挥促炎作用有关。     

Protective effect of isoflurane and sevoflurane on ischemic neurons and expression of Bcl-2 and ICE genes in rat brain

Objective To study the protective effect of volatile anesthetics, isoflurane and sevoflurane, on ischemic neurons after cerebral ischemia-reperfusion in rats and its possible molecular mechanism. Methods Rat cerebral ischemia-reperfusion model was developed by occlusion of the middle cerebral artery （MCA） and bilateral common carotid arteries （CCAs） 1 h after reperfusion. Using flow cytometry （FCM） and Northern blot hybridization, we calculated the number of apoptotic bodies and detected the expression of bcl-2 mRNA and interleukin-113 converting enzyme （ICE） mRNA. Results The apoptotic bodies in hippocampus analyzed by FCM peaked at appeared 24 h after reperfusion, and decreased about 54% and 40%, respectively, after treatment with isoflurane and sevoflurane, as compared with ischemic group. There was no significant difference in the expression of bcl-2 mRNA and ICE mRNA between the inhaled anesthetic groups and ischemic group in hippocampus 24 h after MCA/CCAs occlusion. Conclusion Isoflurane and sevoflurane partially inhibit apoptosis but have no significant effect on the expression of bcl-2 and ICE genes.     

全脑缺血再灌模型大鼠皮层神经元GluR2表达的变化

目的:采用免疫组化技术,研究全脑缺血后再灌不同时点大鼠皮层神经元AMPA受体亚单位GluR2表达的变化,探讨GluR2在缺血性神经元损伤中的作用。方法:将36只SD大鼠随机分为6组,即正常组、缺血再灌注后2h、12h、24h、48h、72h 5个时间点组。参照改良的Pulsinelli四血管闭塞法制备全脑缺血大鼠模型,缺血再灌后的大鼠分别在存活2h、12h、24h、48h及72h后采用免疫组化法测定皮层神经元GluR2的表达量。结果:模型再灌5个时点之间SD大鼠皮层神经元GluR2表达量没有统计学差异(P>0.05),但与正常组相比,各组的的表达量明显降低(P<0.05)。结论:脑缺血再灌后皮层神经元AMPA受体亚单位GluR2表达减少,介导胞外Ca2+内流,引起神经细胞死亡。     

瑞芬太尼对大鼠全脑缺血再灌注后神经元凋亡和半胱天冬酶-3表达的影响

目的 观察瑞芬太尼对大鼠全脑缺血再灌注损伤后海马神经细胞凋亡和半胱天冬酶(Caspase)-3表达的影响.方法 80只大鼠随机分为假手术(sham)、NS、REM2、REM6和REM20组,每组16只.NS、REM2、REM6和REM20组分别于缺血再灌注前静脉滴注0.9%氯化钠溶液及瑞芬太尼2、6、20μg·kg~(-1)·min~(-1).采用双侧颈总动脉阻断+低血压法建立大鼠短暂性全脑缺血模型.于全脑缺血前30 min由靶控微量注射泵经股静脉注射瑞芬太尼,并于双侧颈总动脉阻断前及开放后10 min进行动脉血血气分析.再灌注后24 h,每组各取8只大鼠,取其新鲜海马组织,采用实时逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测各组Caspase-3 mRNA的表达.再灌注后72 h,取剩余大鼠,灌注取脑,制作脑组织切片,采用苏木精伊红(H-E)染色和原位末端标记法(TUNEL法)观察各组大鼠海马退变的神经元数和凋亡细胞数,采用免疫组织化学法检测各组Caspase-3蛋白的表达.结果 ①H-E染色结果:sham组偶可见退变的锥体细胞,缺血再灌注72 h后,NS组及各瑞芬太尼预处理组海马退变的神经元数较sham组显著增加(P值均<0.05),REM6及REM20组海马退变的神经元数较NS组显著减少(P值均<0.05).②TUNEL法检测结果:sham组未见TUNEL阳性细胞,缺血再灌注72 h后,NS组及各瑞芬太尼预处理组海马CAI区的凋亡锥体细胞数较sham组显著增加(P值均<0.05),REM6和REM20组海马CAI区的凋亡锥体细胞数较NS组显著降低(P值均<0.05).③免疫组织化学法检测结果:sham组可见少量Caspase-3免疫阳性细胞,缺血再灌注72 h后,NS组及各瑞芬太尼预处理组海马区Caspase-3蛋白的免疫阳性细胞数较sham组显著增多(P值均<0.05),各瑞芬太尼预处理组Caspase-3蛋白的免疫阳性细胞数显著低于NS组(P值均<0.05),REM6和REM20组Caspase-3蛋白的免疫阳性细胞数显著低于REM2组(P值均<0.05).④实时RT-PCR结果:sham组大鼠海马组织中Caspase-3 mRNA呈低水平表达,缺血再灌注24 h后,NS组及各瑞芬太尼处理组Caspase-3 mRNA的表达水平较sham组显著升高(P值均<0.05),REM6组Caspase-3 mRNA的表达较NS组显著降低(P<0.05).结论 瑞芬太尼预处理(以6 μg·kg~(-1)·min~(-1)为佳)对全脑缺血再灌注后的神经元损伤具有一定的保护作用,其机制可能与抑制神经元凋亡及下调Caspase-3基因有关.     

高压氧对短暂前脑缺血小鼠海马半胱天冬酶-3表达的影响

旨在通过测定缺血再灌注时半胱天冬酶 3(caspase 3)的表达以及高压氧对表达的影响 ,从细胞凋亡的角度探讨高压氧治疗脑缺血的分子生物学机制。将C5 7BL/ 6N小鼠分为假手术组 (正常对照组 )、缺血再灌注组 (I/R组 )及缺血再灌注加高压氧治疗组 (HBO组 ) ,后 2组夹闭双侧颈总动脉 2 0min后再通血流 ,建立脑缺血再灌注模型 ,分别于再灌注 6h、12h、2 4h和 4 8h取海马。采用半定量反转录 PCR及蛋白免疫印迹 (WesternBlotting)方法分别检测caspase 3在转录水平(mRNA)及翻译水平的表达变化。结果 :各I/R组及HBO组海马中caspase 3mRNA及酶原表达水平与假手术组相比均有明显升高 ,且差异有统计学意义 (P <0 .0 5 ) ;各I/R组与相应时相点HBO组caspase 3mRNA及酶原表达水平相比差异均无统计学意义 (P >0 .0 5 )。提示 :脑缺血再灌注损伤诱发caspase 3转录水平增加 ,而且这是引起其酶原增加的主要原因 ;caspase 3介导的细胞凋亡参与了缺血再灌注损伤 ;本实验中所采用的HBO治疗方案对caspase 3转录及酶原水平无明显作用。     

异氟烷和七氟烷对缺血神经元c-fos和bcl-2基因表达的影响及神经保护作用

为了解吸入麻醉药异氟烷和七氟烷对缺血神经元的保护作用和对c fos、bcl 2基因表达的影响 ,将大鼠右大脑中动脉和双侧颈总动脉分别结扎 1h,造成脑缺血再灌模型 ,缺血期间分别吸入异氟烷和七氟烷。然后分别检测脑梗死体积、海马组织神经元凋亡变化和c fos、bcl 2基因表达情况。结果显示 :缺血期间吸入麻醉药组脑梗死体积、凋亡神经元细胞数和c fosmRNA表达水平显著低于缺血组 ,而bcl 2mRNA表达水平吸入麻醉药组和缺血组之间没有明显差别。表明异氟烷和七氟烷对缺血神经元有保护作用 ,能衰减c fosmRNA表达 ,但对bcl 2mRNA的表达无明显影响。     

大鼠癫持续状态后脑内PPARγ的表达

目的观察PPARγ在癫持续状态后大鼠脑内的表达。方法将雄性SD大鼠随机分为对照组和癫组(n=10),制备锂-匹罗卡品癫模型,采用免疫组化及蛋白质印迹分析方法,观察对照组和造模成功的癫大鼠脑内PPARγ的表达分布和变化情况。采用免疫组化及蛋白质印迹分析方法,观察锂-匹罗卡品模型大鼠脑内PPARγ的表达分布和变化情况。结果免疫组化显示PPARγ在正常大鼠脑内呈弱阳性表达,且主要表达在神经元上;癫持续状态后在星形胶质细胞上呈强阳性表达,神经元形态的细胞上亦有表达。蛋白质印迹分析显示癫持续状态后PPARγ的表达明显增加。结论大鼠癫持续状态后星形细胞上PPARγ表达增加,可能具有神经保护作用,这为癫的神经保护治疗提供了一个新的研究方向。     

大鼠脑缺血再灌注损伤后死亡相关蛋白激酶的表达及意义

目的 探讨大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤时死亡相关蛋白激酶(Death associated related protein kinase,DAPK)的表达变化及其与脑缺血再灌注损伤的关系。方法 线拴法建立局灶性脑缺血再灌注模型,SD大鼠随机分为正常对照组、假手术组和缺血再灌注组,缺血组于栓塞3h后分别再灌注12h、24h、3d、7d。HE染色观察组织病理变化;免疫组化法检测DAPK的表达;原位杂交法检测DAPK mRNA的表达。结果 缺血组DAPK免疫阳性反应于再灌注后24h开始增强并于3d时达高峰,随后下降;DAPK mRNA的表达于再灌注3d时达高峰,随后下降。结论 脑缺血再灌注损伤诱导DAPK表达增强;DAPK在缺血性脑损伤中起重要作用。     

针刺对脑缺血大鼠神经元凋亡的影响

目的观察针刺对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤后海马神经元内细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶4（CDK4）和神经元凋亡的影响。方法大脑中动脉线栓法建立脑缺血再灌注损伤模型,再灌后针刺大鼠,应用免疫组化、免疫印迹法和流式细胞计数法分别检测CDK4和细胞凋亡。结果缺血组再灌注48h后海马CDK4表达升高,凋亡细胞增多,针刺组CDK4表达和凋亡细胞明显减少（P〈0．01）。结论针刺对脑缺血再灌注损伤有保护作用,其机制可能与调控细胞周期因子从而抑制凋亡有关。     

HO-1对氧糖剥夺海马神经元线粒体运动调节蛋白的影响

目的 研究HO-1对氧糖剥夺海马神经元线粒体运动调节蛋白的影响.方法 将培养7 d的大鼠海马神经元随机分为4组:正常培养组(C组)、正常培养+血晶素组(C+H组)、氧糖剥夺组(D组)、氧糖剥夺+血晶素组(D+H组).C组正常培养方法 培养.C+H组在正常培养的神经元培养液中加入血晶素使其终浓度为10μmol/L后按正常培养24 h.D组神经元进行缺糖、缺氧后复糖、复氧处理.D+H组神经元用10μmol/L血晶素处理24 h后进行缺糖、缺氧后复糖、复氧处理.进行神经元纯度鉴定,细胞存活率,HO-1-mRNA表达,HO-1、Mirol、Miro2和Milton蛋白表达,神经元凋亡的检测.结果 C+H组神经元H0-1-mRNA和HO-1表达高于C组(P＜0.01),Mirol、Mirio2和Milton蛋白表达高于C组(P＜0.01),神经元存活率和神经元凋亡率变化无统计学差异(P＞0.05);D组神经元HO-1-mRNA和HO-1表达高于C组(P＜0.01),Mirol、Miro2和Milton蛋白高于C组(P＜0.01),神经元存活率低于C组(P＜0.01),神经元凋亡率高于C组(P＜0.01);D+H组神经元HO-1-mRNA和HO-1表达高于D组(P＜0.01),Mirol、Miro2和Milton蛋白高于D组(P＜0.01),神经元存活率高于D组(P＜0.01),神经元凋亡率低于D组(P＜0.01).结论 HO-1增加海马神经元线粒体运动调节蛋白Mirol、Miro2和Milton的表达,抑制神经元的凋亡.