7型腺病毒疫苗株87mu-97.4mu片段核苷酸序列分析

目的获得７型腺病毒（Ａｄ７）疫苗株８７ｍｕ－９７．４ｍｕ核苷酸序列，分析该区段的基因结构和功能。方法应用Ｓａｎｇｅｒ双脱氧法进行核苷酸序列分析。结果Ａｄ７疫苗株８７ｍｕ－９７．４ｍｕ全长３６９８个核苷酸，推测编码纤维蛋白（３２５个氨基酸）和Ｅ３区１５．４ｋＤ蛋白，Ｅ４区５个蛋白（ＯＲＦ１４．２，ＯＲＦ１５．７，ＯＲＦ８．１，ＯＲＦ４２．８和ＯＲＦ１０．３）。结论这一结果为阐明Ａｄ７的基因结构与功能及利用该病毒做为基因工程疫苗载体打下一定的基础     

7型腺病毒疫苗株DNA左侧17.5 mu片段克隆及4.8 mu片段核苷酸序列分析

目的获得７型腺病毒疫苗株ＤＮＡ左侧０～１７５ｍｕ片段克隆,分析０～４８ｍｕ片段（末端倒置重复序列、包装信号位点和Ｅｌａ区）核苷酸序列。方法从Ａｄ７疫苗株感染的Ａ５４９细胞提取Ａｄ７ＤＮＡ,将其０３～１７５ｍｕ片段克隆到质粒ｐＡｄ７Ｔ,并用自动和银染方法测序。结果获得了Ａｄ７疫苗株左侧１７５ｍｕ片段克隆,测定了左侧１７３７ｂｐ核苷酸序列,其中Ｅｌａ区所编码的６３００、２４０００、２８０００等３个蛋白的ＤＮＡ序列,与Ｇｏｍｅｎ株的同源性分别为９８９％、９７３％和９７５％,推导编码氨基酸的同源性分别为９６６％、９６５％和９６９％。这３个蛋白与Ｇｒｉｄｅｒ株的同源性分别为１００％、９９７％、和９９７％;推导编码氨基酸的同源性分别为１００％、９９１％和９９２％。结论Ａｄ７疫苗株左侧１７３８ｂｐ核苷酸与Ａｄ７Ｇｏｍｅｎ株和Ｇｒｉｄｅｒ株相应片段,具有高度的同源性。     

7型腺病毒疫苗株基因克隆及其右侧末端Sma ⅠH片段的核苷酸序列分析

目的获得７型腺病毒（Ａｄ７）载体构建的基本元件，为构建Ａｄ７载体及阐明其基因组一级结构打下基础。方法用改良Ｈｉｒｔｓ法提取Ａｄ７ＤＮＡ，酶切后克隆于质粒载体，克隆了ＸｈｏⅠＡ＋Ｄ片段（１７０－７６５ｍｕ）、Ｄ片段（１７０－２２９ｍｕ）、Ｅ片段（１０８－１４１ｍｕ）、Ｆ＋Ｇ片段（１４１－１７０ｍｕ）、Ｇ片段（１５８－１７０），用ＥｃｏＲⅠ＋ＸｈｏⅠ双酶切，克隆了７６５－８７ｍｕ，用ＳａｍⅠ＋ＥｃｏＲⅠ双酶切，克隆了８７０－９７４ｍｕ。用腺病毒ＤＮＡ做为模板测定了Ａｄ７疫苗株右侧末端ＳｍａⅠＨ片段（９７４－１００ｍｕ）核酸苷序列，根据所测序列设计引物，用聚合酶链反应（ＰＣＲ）获得右侧末端，并对其再次测序证实。结果建立了Ａｄ７疫苗株部分基因文库（１０８－１００ｍｕ），完成Ａｄ７疫苗株ＳｍａⅠＨ片段核苷酸序列。结论这一结果为阐明Ａｄ７基因组一级结构及构建Ａｄ７载体奠定了基础。     

7型腺病毒疫苗株DNA左侧17.5mu片段克隆及4.8mu片？…

目的 获得７型腺病毒疫苗株ＤＮＡ左侧０－１７．５ｍｕ片段克隆,分析０－４．８ｍｕ片段（末端倒置重复序列,包装信号位点和Ｅｌａ区）核苷酸序列,。方法从Ａｄ７疫苗株感染的Ａ５４９细胞提取Ａｄ７ ＤＮＡ,将其０．３－１７．５ｍｕ片段克隆到质粒ｐＡｄ７Ｔ,并用自动和银染方法测序。结果 获得了Ａｄ７疫苗株左侧１７．５ｍｕ片段克隆,测定了左侧１７３７ｂｐ核苷酸序列,其中Ｅｌａ区所编码的６３００,２４０００,２     

7型腺病毒疫苗株载体的构建及β—半乳糖苷酶基因 …

目的 构建Ｅ３区缺失的７型腺病毒疫苗株（Ａｄ７ｖ）载体并表达β－半乳糖苷酶基因。方法 从人二倍体细胞的Ｗ１３８培养的Ａｄ７ｖ中分离病毒ＤＮＡ，利用Ａｄ７ｖＤＮＡ天然的酶切位点，经过多步亚克隆，克隆的同时将Ｅ３区７８．８－８７ｍｕ片段缺失，并将多克隆酶切位点带入Ａｄ７ｖ载体。为了验证载体的功能，将带有巨细胞病毒（ＣＭＶ）早期启动子β－半乳糖苷酶基因插入缺失的Ｅ３区。将这一重组质粒和ＥｃｏＲＩ酶切Ａｄ     

7型腺病毒疫苗株载体的构建及β-半乳糖苷酶基因的表达

目的构建Ｅ３区缺失的７型腺病毒疫苗株（Ａｄ７ｖ）载体并表达β半乳糖苷酶基因。方法从人二倍体细胞Ｗ１３８培养的Ａｄ７ｖ中分离病毒ＤＮＡ，利用Ａｄ７ｖＤＮＡ天然的酶切位点，经过多步亚克隆，克隆的同时将Ｅ３区７８８８７ｍｕ片段缺失，并将多克隆酶切位点带入Ａｄ７ｖ载体。为了验证载体的功能，将带有巨细胞病毒（ＣＭＶ）早期启动子β半乳糖苷酶基因插入缺失的Ｅ３区。将这一重组质粒和ＥｃｏＲⅠ酶切Ａｄ７ｖＤＮＡ共转染２９３细胞，获得表达β半乳糖苷酶重组病毒。结果构建了缺失部分Ｅ３区Ａｄ７ｖ载体，在ＣＭＶ启动子的作用下该载体能有效地表达外源基因。结论Ａｄ７ｖ载体的构建并成功表达外源基因为开发和应用这一载体打下了重要的基础     

我国登革2型病毒43株非结构蛋白NS1基因的特征

对我国１９８７年从广西分离的登革２型病毒４３株非结构蛋白ＮＳ１基因的核苷酸序列进行了分析，结果表明登革２型病毒４３株非结构蛋白ＮＳ１基因含有１０５６核苷酸编码３５２个氨基酸，并就其核苷酸序列及其相应的氨基酸序列与我国１９８５年海南流行高峰期分离的Ｄ２－０４株、国际参考株新几内亚Ｃ株（ＮＧＣ）、牙买加株（ＪＡＭ）、候选疫苗株（Ｓ１）和马来西亚流行株Ｍ１（登革出血热）、Ｍ２（登革休克综合征）、Ｍ３（登革热）进行比较，发现核苷酸序列的同源性分别为９２．２％，９３．７％，９３．３％，９０．７％，８９．９％，８９．５％，８９．３％，氨基酸的类似性分别为８９．８％，９２．６％，９３．３％，９１．２％，９０．６％，９０．１％，８９；９％，推断的氨基酸序列含有两个糖基化位点，分别位于氨基酸残基的１３０和２０７位，一个可能的蛋白裂解位点３５０～３５２和１０个保守的半胱氨酸残基。     

汉坦病毒A9株M基因片段核苷酸序列的测定及分析

采用反转录-ＰＣＲ方法，分节段扩增汉坦病毒Ａ９株Ｍ基因片段ｃＤＮＡ，并克隆入ｐＧＥＭＴ载体中，用双脱氧末端终止法直接测定序列。结果表明，Ａ９株Ｍ片段ｃＤＮＡ由３６１８个碱基组成，编码１１３５个氨基酸，　　核苷酸序列及由其推导的氨基酸序列同７６／１１８株的同源性分别为９４．３３％和９７．８０％，说明汉坦病毒Ａ９株与７６／１１８株在糖蛋白的结构上高度保守。同７６／１１８株比较，在３'末端非编码区变异极大，变异率为２０％，且多了２个核苷酸。Ａ９株Ｍ基因片段核苷酸序列的获得，为利用该ｃＤＮＡ进行基因工程疫苗的研制创造了条件。     

鸡减蛋综合征病毒55K蛋白基因的克隆与序列分析

目的了解鸡减蛋综合征病毒（ＥＤＳＶ）的基因结构特征。方法从中国发病鸡群中分离的鸡减蛋综合征病毒弱毒株ＡＡ２，经常规法提取病毒核酸后，构建了用内切酶ＨｉｎｄⅢ水解的完整基因文库，对其中Ａ片段编码５５Ｋ蛋白基因的核苷酸序列进行测定和分析。结果该读码框共１０１１个核苷酸，编码产物由３３７氨基酸组成，分子量为３８２００。氨基酸同源性分析表明，ＥＤＳＶ５５Ｋ蛋白与人腺病毒（Ａｄ２，Ａｄ１２，Ａｄ４０）、犬腺病毒（ｃａｖ）、Ⅰ群禽腺病毒（ｃｅｌｏ）同源性在２５５％～３２４％之间，而与羊腺病毒（ｏａｖ）的同源性达到４６４％。结论ＥＤＳＶ５５Ｋ蛋白基因具有与腺病毒５５Ｋ蛋白基因相似的结构，但变异较大。     

鹅流感病毒2/96-H5N1亚型毒株RNA1-3及RNA5节段核苷酸全序测定

目的　明确广东鹅流感病毒２９６Ｈ５ Ｎ１ 亚型毒株ＲＮＡ１３ 和ＲＮＡ５ 节段核苷酸全序列及其所编码蛋白的氨基酸序列,以及这些基因节段与香港禽流感病毒１５６９７Ｈ５ Ｎ１ 亚型毒株相应节段间的关系。方法　病毒粒ＲＮＡ经逆转录合成ｃＤＮＡ,经聚合酶链反应（ＰＣＲ） 扩增,产物纯化,采用双脱氧链末端终止法进行核苷酸序列测定。结果　广东鹅流感病毒２９６Ｈ５ Ｎ１ 亚型毒株ＲＮＡ１３ 和ＲＮＡ５ 节段长度分别为２３４１,２ ３４１ ,２ ２３３ 和１５６５ 个核苷酸。它们分别编码ＰＢ２（ 含７５９ 个氨基酸）,ＰＢ１（ 含７５７个氨基酸） ,ＰＡ（ 含７１６ 个氨基酸） 和ＮＰ蛋白（ 含４９８ 个核苷酸） 。这些蛋白与香港禽流感病毒１５６９７Ｈ５ Ｎ１ 亚型毒株相应蛋白氨基酸序列的同源性分别为９６－４％ ,９７－２％ ,９７－３ ％ 和９７－０％ 。结论　本毒株ＲＮＡ１３ 和ＲＮＡ５ 节段长度分别为２ ３４１,２ ３４１,２ ２３３ 和１ ５６５ 个核苷酸,它们与香港１５６９７Ｈ５ Ｎ１ 亚型毒株间存在着差异     

7型腺病毒疫苗株序列测定及其六邻体特性分析

目的 完成7型腺病毒疫苗株(Ad7v)的全序列测定并阐明其六邻体特征。方法 克隆Ad7v基因组17．5～68．0mu片段，应用Sanger双脱氧法进行DNA序列测定，将编码六邻体蛋白的核苷酸序列输入GenBank数据库中，获得录入号为AF515814。用CLUSTAL.V软件比较Ad7v与其他亚组及同一亚组腺病毒的六邻体蛋白的同源性，分析其抗原性的差异，同时用RasMol2．71软件预测Ad7v六邻体三维结构。结果 AdTv17．5～68．0mu由17596个碱基组成。这段基因r链主要编码晚期基因L1、L2和L3，L链编码E2的一部分。六邻体编码多肽位于L3区，由934个氨基酸残基组成，与其他9个已知的六邻体蛋白序列进行多序列同源性比较，发现Ad7／疫苗株与其他亚组腺病毒的同源性为86．8％(Ad4)～78．5％(Ad5)。在同一亚组中，Ad7疫苗株与Ad3同源性最高，高达95．1％。可变序列主要集中在7个高变区(HVRs)，根据Ad2六邻体三维结构模型预测Ad7六邻体三维结构，发现可变区大部分位于六邻体顶端的I1和I2环中。结论 完成了AdTv的全序列分析，其六邻体序列与Ad5、Ad2等其他亚组病毒有很大差异，这一结果为构建新型腺病毒载体打下了基础。     

7型腺病毒疫苗株基因克隆及其右侧末端Sma I H片段 …

目的 获得７型腺病毒（Ａｄ７）载体构建的基本元件，为构建Ａｄ７载体及阐明其基因组一级结构打下基础。方法 用改良Ｈｉｒｔｓ法提取Ａｄ７ＤＮＡ，酶切后克隆于质粒载体，克隆了Ｘｈｏ Ｉ Ａ＋Ｄ片段（１７．０￣７６．５ｍｕ）、Ｄ片段（１７．０－２２．９ｍｕ）、Ｅ片段（１０．８－１４．１ｍｕ）、Ｆ＋Ｇ片段（１４．１￣１７．０ｍｕ）、Ｇ片段（１５．８￣１７．０），用ＥｃｏＲ Ｉ＋Ｘｈｏ Ｉ双酶切，克隆了７６．     

Analysis of early region 4 of porcine adenovirus type 3

The early region 4 (E4) of porcine adenovirus (PAdV)-3, located at the right-hand end of the genome is transcribed in a leftward direction and has the potential to encode seven (p1-p7) open reading frames (ORFs). To determine the role of each protein in viral replication, we constructed full-length PAdV-3 genomic clones containing deletions of individual E4 ORF or combined deletions of the neighboring ORFs. Transfection of swine testicular (ST) cells with individual E4 mutant plasmid DNAs generated PAdV-3 E4 mutant viruses except with plasmids containing a deletion of ORF p3, ORF p2+ p3 or ORF p3+ p4. Each of the mutants was further analyzed for growth kinetics, and early/late protein synthesis. Mutant viruses carrying deletions in ORF p1, ORF p2 or ORF p4 showed growth characteristics similar to that of wild-type PAdV-3. Early/late protein synthesis was also indistinguishable from that of wild-type PAdV-3. However, mutant viruses carrying deletions in ORF p5, ORF p6 or ORF p7 showed a modest effect in their ability to grow in porcine cells and express early proteins. These results suggest that the E4 ORF p3 (showing low homology with non-essential human adenovirus (HAdV)-9-E4 ORF1 encoded proteins) is essential for the replication of PAdV-3 in vitro. In contrast, the E4 ORF p7 (showing homology to essential HAdV-2 34 kDa protein) is not essential for replication of PAdV-3 in vitro. Moreover, successful deletion of 1.957 kb fragment in E4 region increased the available capacity of replication-competent PAdV-3 (E3 + E4 deleted) to approximately 4.3 kb and that of replication-defective PAdV-3 (E1 + E3 + E4 deleted) to approximately 7 kb. This is extremely useful for the construction of PAdV-3 vectors that express multiple genes and/or regulatory elements for gene therapy and vaccination.     

Characterization of the early region 3 and fiber genes of Ad7

The nucleotide sequence and the predicted amino acid sequences for open reading frames (ORFs) encoded in the Bam-Hl D fragment of Ad7 (Gomen) DNA show an organization and conservation of potential polypeptides between Ad3 and Ad7. Five ORFs encoded within early region 3 (E3) and shared with the corresponding region of Ad3 can be identified; four of these potential coding regions also share homology to ORFs found in E3 of Ad2 and Ad5. The fiber gene of late region 5 (L5) is also apparent within this region; S1 mapping experiments show that the 5' and 3' boundaries of the main exon in fiber mRNA lie at each end of the proposed fiber ORF. The predicted amino acid sequence for Ad7 fiber shares 60% amino acid homology to Ad3 fiber, but only 20% to Ad2 fiber. Surprisingly, there are three regions of partial amino acid homology near the N- and C-termini of the predicted fiber gene sequences from Ad2, Ad3, Ad5, and Ad7; these conserved regions may be important for interaction with penton base, for proper folding of the shaft of the molecule, or for recognition of the cellular receptor to which adenovirus attaches during infection.     

Sequence analysis in the E1 region of adenovirus type 4 DNA

Adenovirus type 4 (Ad4) is the sole member of adenovirus group E based on overall DNA sequence homology, restriction endonuclease cleavage patterns, and the size of capsid proteins. We cloned the BamHI-F fragment from the left end of Ad4 in pUC13-1 between the SalI and BamHI sites in order to carry out the structural analysis of the E1A region of Ad4. The complete sequence of the BamHI-F fragment (2042 bp) has been determined. From the DNA sequence, the splice sites for the putative 12 S and 13 S mRNAs, encoded by the E1A region of Ad4 were deduced. If protein synthesis initiates at the first available AUG triplet (position 575), these 12 S and 13 S mRNAs would code for polypeptides containing 226 and 257 amino acids, respectively. Comparison of Ad4- and Ad7-13 S mRNA-coded polypeptides indicates that there is 57% homology, whereas the homology is only 38% with Ad12 and 31% with Ad2-13 S mRNA-coded polypeptides. The structural analysis in the E1 region of Ad4 also includes the coding region for the E1B 19-kDa protein. Ad4 and Ad7 shows 65% homology in the coding regions for E1B 19-kDa protein. Comparison of the DNA sequence of Ad4 with those of Ad2, Ad7, and Ad12 by using a dot matrix computer program and by Southern hybridization revealed that Ad4 bears a stronger homology with Ad7 than with Ad2 and Ad12 in this region. Hydropathy plots and alignments of the putative polypeptides coded by this region in Ad4 with those from the corresponding regions of different serotypes to reveal the highly conserved domains also support the above conclusion.     

4型腺病毒疫苗株载体的构建及β—半乳糖苷酶基因的 …

目的 构建缺失Ｅ３区７８．９－８６ｍｕ的４型腺病毒疫苗株载体。方法 从４型腺病毒疫苗株感染的人胚肺二倍体细胞２ＢＳ中提取病毒ＤＮＡ,经过多卡亚克隆构建成功缺失７８．９￣８６ｍｕ的载体。将含有ＣＭＶ早期启动子的β－半乳糖苷酶基因插入缺失部位,将这一重组质粒与Ａｄ４Ｂｃｌ１大片段共转染２９３细胞,铺含有Ｘ－Ｇａｌ的营养琼脂,经蓝色斑斑纯化三代,ＯＮＰＧ法测定β－半乳糖苷酶基因的表达量。结果 所构建的载