新型bcl-2基因反义寡核苷酸F951诱导人白血病HL60细胞凋亡

目的观察新型bcl-2反义寡核苷酸F951诱导人白血病细胞凋亡的作用。方法不同浓度的F951与HL60细胞共培养后,采用流式细胞术,DNA Ladder分析,电镜观察,TdT酶介导的缺口末端标记法(TUNEL)检测凋亡细胞。结果5,10,20μmol.L-1F951分别与HL60细胞共孵育48h后,线粒体凋亡细胞:未处理组、FNS对照组分别为3.00%、13.57%,F9513个剂量分别为30.95%、38.08%、52.55%;Caspase活性细胞:未处理组、FNS对照组分别为0.08%、0.14%,F9513个剂量组分别为43.68%、60.54%、80.37%。凝胶电泳分析:F951处理组可见典型的DNALadder,且随着药物浓度的提高诱导DNA Ladder的作用更加明显;TUNEL和电镜检查:未处理组与FNS对照组中仅偶见凋亡细胞,F951各剂量组凋亡细胞常见,且随着药物浓度的提高凋亡细胞增多。结论F951具有诱导HL60细胞凋亡的作用;F951诱导肿瘤细胞凋亡的作用是通过抑制bcl-2基因,启动细胞凋亡调控通道而实现的。     

脂质体转染bcl—2反义寡核苷酸G3139在HL—60细胞中的动力？…

目的 应用阳离子脂质体介导或直接转染时,建立ＨＬ－６０细胞摄入由５′－ＦＩＴＣ标记的ｂｃｌ－２反义寡核苷酸Ｇ３１３９的动力学模式及观察Ｇ３１３９在细胞内的分布。方法 流式细胞仪测定细胞内的相对平均荧光强度,荧光显微镜观察细胞内的荧光分布。结果 ①脂质体介导转染法显著提高ＨＬ－６０细胞对Ｇ３１３９的摄入,当ＤＯＳＰＥＲ／Ｇ３１３９（ｕｇ／ｕｇ）为２．２／１时,细胞内相对平均荧光强度可达Ｇ３１３９直接     

阳离子脂质体增加bcl—2反义寡脱氧核苷酸G3139在HL—60细胞中的摄取及活性

目的:探讨阳离于脂质体DOSPER对bcl-2反义寡脱氧核苷酸G3139在HL-60细胞中的摄取和活性的影响。方法:流式细胞仪测定细胞结合的平均荧光强度和Bcl-2蛋白阳性细胞的百分数;荧光显微镜观察细胞内FTTC荧光素标记G3139的分布;RT-RCR测定bcl-2 mRNA的表达。结果:①DOSPER增加细胞对G3139的摄取,当DOSPER/G3139(μg:μg)为2:1时,细胞对G3139的摄取在2h左右达到高峰,为G3139直接作用时的20倍,细胞核和细胞浆中的G3139为明亮的点状聚集;而G3139直接作用时,G3139则弥漫分布于细胞浆中;②细胞内的G3139可向胞外转运。DOSPER介导转染G3139 4h后,细胞内的G3139符合方程C(t)=68.2e~(-0.60t) 31.8e~(-0.02t)(初值为100％),t_(1/2)约为1.1h,而G3139直接作用后,细胞内的G3139符合方程C(t)=64.8e~(-2.27t) 35.2e~(-0.04t),t_(1/2)约为18min;③在DOSPER介导转染下,G3139在浓度1μmol·L~(-1)时,特异性减少bcl-2 mRNA的表达,同时使Bcl-2蛋白阳性率从97％±4％下降到70.6％±2.1％。结论:DOSPER增加细胞对G3139的摄取和改变G3139在细胞内的分布可能是其增强G3139活性的重要机制。     

脂质体转染bcl-2反义寡核苷酸G3139在HL-60细胞中的动力学模式

目的　应用阳离子脂质体介导或直接转染时 ,建立HL 6 0细胞摄入由 5 FITC标记的bcl 2反义寡核苷酸G3139的动力学模式及观察G 3139在细胞内的分布。方法　流式细胞仪测定细胞内的相对平均荧光强度 ,荧光显微镜观察细胞内的荧光分布。结果　①脂质体介导转染法显著提高HL 6 0细胞对G 3139的摄入 ,当DOSPER/G 3139(μg/μg)为 2 2 / 1时 ,细胞内相对平均荧光强度可达G 3139直接作用时的 40倍 ,而且HL 6 0细胞对G 3139的摄入跟G3139的浓度和作用时间有关。②细胞内的G 3139可向胞外转运 ,在DOSPER介导转染后 ,胞内荧光强度衰减缓慢 ,t1/ 2 约为 4h ,而G 3139直接作用后 ,t1/ 2 约为 0 5h ;③DOSPER介导转染 6h后 ,细胞内荧光物质主要以明亮的点状聚集在细胞核和部分细胞浆的细胞器中 ,而G 3139直接作用时 ,荧光物质则弥漫分布于胞浆中。结论　DOSPER可以增加G 3139的细胞摄入并改变其胞内分布 ,可能是阳离子脂质体增加bcl 2反义寡核苷酸生物活性的重要原因。     

Bcl-2反义核酸联合化疗药对HL60细胞及原代白血病细胞的作用

目的应用Bcl-2反义硫代磷酸寡脱氧核苷酸(anti-sense phosphorothioate oligodeoxynucleotide,AS-PS-ODNs,AS-PO)靶向诱导20例原代急性白血病细胞凋亡,并与多种常用化疗药联合,观察ASPO对原代急性白血病细胞及HL60细胞系的协同效应。方法①应用MTT比色法分析ASPO与常用化疗药物配伍协同作用特点;②细胞免疫化学染色检测P26 Bcl-2蛋白表达;③台盼蓝拒染试验检测白血病细胞倍增时间;④丫啶橙(AO)染色,流式DNA Content分析细胞凋亡率,电镜及DNA电泳观察凋亡细胞形态及分子水平的变化。结果①ASPO与除DNR,NVT外的7种(HHRT,VCR、MTX、Ara-c、VP16、ACR、DEX)化疗药物均有联合增强或相加作用。②12例Bcl-2蛋白抑制率大于0.4为A组,8例小于0.4为B组。A组的凋亡率和B组的凋亡率均高于空白对照组(P<0.05),且A组的凋亡率高于B组(P<0.05)。③原代急性白血病细胞ASPO组,Ara-c组和ASPO+Ara-c组,72 h细胞生长抑制检测发现ASPO+Ara-c组的细胞抑制率高于单用ASPO与单用Ara-c的细胞抑制率之和(P<0.01);④A组的ASPO对细胞的抑制与细胞生长的倍增时间102.89±37.97呈正相关γ=0.577(P<0.05)。结论Bcl-2 ASPO能特异抑制白血病细胞(系)的Bcl-2蛋白表达;Bcl-2 ASPO对倍增时间慢、BCL-2蛋白表达高的原代白血病细胞作用效果好;Bcl-2的ASPO与多种化疗药物联合有潜在临床应用前景。     

新型bcl-2反义寡核苷酸F951对人白血病裸鼠移植瘤的治疗作用

目的研究新型反义寡核苷酸F951对急性髓性白血病(AML)裸鼠移植瘤bcl-2基因表达、肿瘤生长及荷瘤鼠生存期的影响。方法体外大量扩增高表达bcl-2基因的HL60细胞,皮下接种建立AML裸鼠移植瘤模型,采取瘤体局部注射给药,观察F951及F951联合小剂量Ara-C对肿瘤生长及荷瘤裸鼠生存期的影响;应用荧光定量RT-PCR检测瘤细胞bcl-2mRNA表达;光镜观察瘤组织形态结构变化。结果治疗14d各组荷瘤鼠瘤体积、瘤重、瘤组织bcl-2mR-NA定量分别为:NS对照组(15.17±3.40)cm3、(12.69±0.92)g、9.79×104Copies.μg-1;无义寡核苷酸(FNS)组(15.91±3.77)cm3,(12.38±1.21)g;8.31×104Copies.μg-1;Ara-C组(1.24±0.55)cm3,(2.32±0.49)g,2.59×104Copies.μg-1;F951组(2.6±1.55)cm3,(3.53±0.67)g;1.01×10Copies.μg-1;F951+Ara-C组(0.62±0.48)cm3,(1.05±0.63)g,9.5×102Copies.μg-1;上述各组数据显示F951有下调肿瘤细胞bcl-2基因表达,抑制肿瘤生长的作用,抑瘤率为72.18%,与NS及FNS对照组比差异均有极显著性(P<0.01),F951联合Ara-C后治疗效果更佳,抑瘤率达91.73%,与Ara-C组相比差异有显著性(P<0.05)。瘤组织病理学检查:F951及F951联合Ara-C治疗组瘤细胞减少,瘤细胞变性坏死,大量纤维组织增生。各组动物生存期观察:NS对照组(13.67±0.82)d、,FNS组(13.50±1.22)d,Ara-C组(28.33±1.86)d,F951组(29.33±7.44)d,F951+Ara-C组(37.83±5.85)d。F951组及F951+Ara-C组生存期延长率分别为114.56%与176.71%,明显延长了荷瘤鼠的生存期(P<0.01)。结论F951能特异性地抑制AML裸鼠移植瘤细胞bcl-2基因表达,激活凋亡调控机制,诱导瘤细胞凋亡,同时增加化疗药物的敏感性,而发挥抗肿瘤作用。     

反义寡核苷酸抑制血管平滑肌细胞bFGF基因表达

目的：探讨转染反义脱氧寡核苷酸（AODN）对血管平滑肌细胞（VSMCs）碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）基因表达的影响机制。方法：使用原位杂交和免疫组化技术检测体外培养的VSMCs中bFGF mRNA和蛋白表达；利用脂质体分别将设计合成浓度为5μmol／L反义（反义组）、正义（正义组）及随机（随机组）脱氧寡核苷酸导入体外培养的VSMCs；应用逆转录PCR和Western Blot半定量测定及计算机图像分析的方法．观测寡核苷酸对bFGF基因表达的影响。结果：体外培养的大鼠VSMCs均有bFGF mRNA和蛋白表达，反义bFGF寡核苷酸作用于VSMCs后1-5d，bFGF mRNA表达和蛋白表达均明显减弱，反义组与对照组比较。mRNA、蛋白表达在第1～5d表达差异均有统计学意义；而正义、随机组无此效应，与单纯脂质体和空白对照组相比差异无统计学意义（P〉0．05）。结论：反义bFGF寡核苷酸对血管平滑肌细胞bFGF基因表达的抑制作用具有序列特异性。     

bcl-2反义肽核酸诱导HL-60 K562细胞凋亡

目的　探讨不同结构的反义药物对HL 60、K562细胞系生物学活性的影响。方法　应用细胞计数、细胞形态观察和流式细胞术观察并比较反义肽核酸和反义寡核苷酸对白血病细胞HL 60、K562生物学活性的影响。结果　 1 0 μmol/L靶向bcl 2mRNA蛋白编码区的反义肽核酸能有效地抑制HL 60、K562细胞的生长、下调bcl 2蛋白的水平及诱导细胞凋亡。 1 0 μmol/L针对bcl 2mRNA同样靶点的反义肽核酸和寡核苷酸作用HL 60和K562细胞 72h ,反义肽核酸仍表现出较强的促细胞凋亡的作用 ,而反义寡核苷酸诱导细胞凋亡的作用则有所下降。结论　反义bcl 2肽核酸能诱导HL 60、K562细胞的凋亡 ,比反义寡核苷酸有更好的反义作用。     

CA46细胞对Bcl-2反义核酸(F951)的摄取及F951在CA46细胞内的分布

针对Bcl 2mRNA的反义寡核苷酸能特异性地抑制靶细胞中Bcl 2基因的表达 ,下调Bcl 2mRNA和蛋白质的水平[1] 。F95 1是我所自行研制的不同于现有其它序列的针对癌基因Bcl 2mRNA的反义硫代磷酸寡脱氧核苷酸 ,本研究采用同位素技术研究了CA4 6细胞在体外对F95 1的摄取及F95 1在CA4 6细胞中的分布。1　材料与方法1.1　F95 1的来源与同位素标记　F95 1是与Bcl 2mRNA起始密码AUG附近的 18个核苷酸特异性互补的单链DNA ,经硫代修饰 ,委托中国国家原子能研究院同位素研究所行氚标记、纯化 ,比活度为～ 2 9 6GBq·g-1。1.2　CA4 6细胞的…     

Bcl-2基因反义寡核苷酸对乳腺癌细胞株药物敏感性的影响

目的:探讨bcl-2基因反义寡核苷酸对人乳腺癌细胞株MCF-7的bcl-2蛋白的表达和药物敏感性的影响.方法:用人工合成bcl-2基因反义寡核苷酸预培养人乳腺癌细胞株MCF-7,以免疫组化法检测细胞bcl-2蛋白的表达水平;以MTT法检测bcl-2反义寡核苷酸、阿霉素单独及联合应用对MCF-7细胞生长的抑制情况,比较bcl-2蛋白表达与肿瘤细胞药物敏感性之间的相关性.结果:联合应用bcl-2反义寡核苷酸与阿霉素能够明显增加MCF-7细胞对阿霉素的敏感性,细胞存活率明显下降.免疫组化结果显示MCF-7细胞bcl-2表达水平与细胞药物敏感性有相关性.结论:bcl-2反义寡核苷酸能够抑制MCF-7乳腺癌细胞bcl-2基因的表达,提高MCF-7细胞对阿霉素的敏感性.     

hTERT 反义寡聚核苷酸对子宫内膜癌细胞Bcl-2蛋白含量的影响

目的：观察人端粒酶逆转录酶反义寡聚脱氧核苷酸对子宫内膜癌Ishikawa细胞株Bcl-2蛋白表达含量的影响。方法将2抖．5μmol／L、5μmol／L及10μmol／L人端粒酶逆转录酶反义寡聚脱氧核苷酸与Ishikawa细胞株共同培养,于24、48、72 h采用MTT法检测细胞增殖,于48 h使用流式细胞仪检测细胞凋亡和Bcl-2蛋白表达。结果人端粒酶逆转录酶反义寡聚脱氧核苷酸呈时间和剂量依赖性抑制Ishikawa细胞增殖,并可呈剂量依赖性诱导Ishika-wa细胞凋亡、降低Bcl-2蛋白表达量。结论人端粒酶逆转录酶反义寡聚脱氧核苷酸可以诱导Ishikawa细胞凋亡、抑制肿瘤细胞增殖,该作用与降低Bcl-2蛋白表达量有关。     

聚酯型儿茶素对HL-60细胞的诱导分化作用及其机制研究

目的　研究聚酯型儿茶素对人急性早幼粒白血病HL 6 0细胞的分化作用并探讨其作用机制。方法　应用电镜、NBT还原试验、同位素掺入试验、细胞内cAMP/cGMP浓度测定、原位杂交和免疫细胞化学等方法研究细胞分化及机制。结果　聚酯型儿茶素作用于HL 6 0细胞后 ,扫描电镜和透射电镜观察显示分化细胞的特征 ;NBT还原能力明显增强 ;[3H] TdR ,[3H] Leu掺入试验证明聚酯型儿茶素可明显抑制细胞DNA和蛋白质合成 ;聚酯型儿茶素作用后 ,细胞内cAMP浓度及cAMP/cGMP比值明显增加 ,HL 6 0细胞的c myc基因mRNA和蛋白产物的表达均明显降低 ,而c fos基因mRNA和蛋白产物的表达均明显升高。结论　聚酯型儿茶素可诱导HL 6 0细胞向成熟细胞分化 ,其分化作用可能与其升高细胞内cAMP/cGMP比值和抑制c myc基因表达、增强c fos基因表达有关。本研究为聚酯型儿茶素在肿瘤防治领域的开发应用提供了充分的理论依据     

二乙酰二脱水卫矛醇诱导人白血病HL-60细胞凋亡与Bcl-2家族的关系

目的　探讨抗肿瘤药物二乙酰二脱水卫矛醇 (di acetyldianhydrogalactitol,DADAG )诱导肿瘤细胞凋亡机制。方法　透射电镜、DNA梯形条带、流式细胞术及Westernblot法分别检测凋亡和凋亡相关基因Bcl 2家族成员表达的动态变化。结果　透射电镜可见细胞异染色质固缩、边集及凋亡小体形成 ;DNA琼脂糖凝胶电泳呈典型的“DNAlad der” ;流式细胞仪DNA直方图上出现亚二倍体峰。DADAG4 μmol·L-1处理HL 6 0细胞 6h后 ,Bcl 2蛋白水平开始下降 ,Bad蛋白水平明显上调 ,相反 ,Bcl XL 蛋白水平呈时间依赖性地下降。结论　DADAG诱导白血病HL 6 0细胞凋亡 ,与Bcl 2、Bcl XL 蛋白水平下降 ,Bad蛋白水平明显上调有关     

Inhibition of haringtonine-induced apoptosis by tetradecanoylphorbol acetate in human leukemia HL-60

目的：研究十四酰佛波乙酸酯（ＴＡ）预处理后，三尖杉酯碱（Ｈａｒ）和喜树碱（Ｃａｍ）诱导人白血病ＨＬ６０细胞凋亡的变化．方法：染色质凝集观察，流式细胞术，ＤＮＡ琼脂糖凝胶电泳和点杂交．结果：ＴＡ２００ｎｍｏｌ·Ｌ－１预处理ＨＬ６０细胞６ｈ，明显抑制Ｈａｒ０１ｍｇ·Ｌ－１作用３ｈ诱导的细胞凋亡，但只部分抑制Ｃａｍ０２ｍｇ·Ｌ－１作用３ｈ诱导的细胞凋亡．ＴＡ预处理ＨＬ６０细胞明显降低ｃｍｙｃ基因的表达．结论：ＴＡ明显抑制由Ｈａｒ和部分抑制由Ｃａｍ诱导的ＨＬ６０细胞凋亡，而且ＴＡ预处理的细胞中ｃｍｙｃ基因表达明显下降，这可能导致了对诱导细胞凋亡的抑制．     

Bcl-2硫代反义核酸(G3139)OPC纯化方法

目的 建立Bcl-2硫代反义核酸(G3139)OPC纯化方法。方法 将G3139从合成柱上解离并去保护，用OPC柱分离纯化化学合成的G3139。紫外分光光度计测OD值，20％PAGE鉴定其纯度。结果 经OPC柱纯化后G3139制备量可达mg水平，回收率为66％，电泳结果显示为一条亮带。结论 Bcl-2硫代反义核酸OPC纯化法是一种高效、快速、简便的方法。