MDR1基因修饰的自体骨髓移植后体内表达及时限的研究

目的 研究多药耐药基因1(multidrug resistanle gene 1, MDR1)转染的骨髓单个核细胞自体移植后,外源性MDR1基因在骨髓中的功能性表达及时限.方法 体外浓缩病毒上清转染法将MDR1基因导入兔骨髓单个核细胞;经大剂量环磷酰胺化疗预处理后,将转染的骨髓单个核细胞行自体骨髓移植;采用PCR法、免疫组织化学法和柔红霉素(daunorubicin, DNR)排出试验检测MDR1基因在受体骨髓中的整合及功能性表达.结果 自体骨髓移植后1～4个月,PCR法检测到外源性MDR1基因在骨髓细胞基因组中的整合;免疫组化法测得骨髓单个核细胞中P-gp阳性率分别为9.5%、8.5%、6.0%、3.5%;柔红霉素排除试验检测到定植的MDR1基因能功能性的表达.结论 转染MDR1基因的骨髓单个核细胞自体移植后,MDR1基因能定植于骨髓中并功能性的表达4个月.     

微泡造影剂结合超声介导一氧化氮合成酶基因转染血管平滑肌细胞

目的 探讨微泡造影剂及超声辐照介导内皮型一氧化氮合成酶(eNOS)基因转染体外培养大鼠血管平滑肌细胞(VSMCs)的可行性.方法 实验分为A、B、C、D、E5组,分别为空白对照组、单纯质粒浸泡组、质粒+微泡造影剂组、质粒+超声辐照组、质粒+超声辐照+造影剂组.用重组真核表达载体pcDNA3.1- eNOS经微泡造影剂及超声辐照介导转染体外培养的大鼠VSMCs,辐照条件为超声探头频率为10 MHz,机械指数为1.9,辐照时间为10 min,重组真核细胞表达载体pcDNA3.1-eNOS 5μg/mL.辐照48 h后,采用RT-PCR、Western blot及免疫组化检测VSMCs内eNOSmRNA和蛋白的表达.结果 RT -PCR检测E组eNOS mRNA的表达最显著,积分吸光度(IA)比值为(91.11±3.41)％,B、C、D组也有少量表达,IA比值分别为(26.10±1.32)％、(31.42±2.43)％、(35.05±2.25)％,与E组相比均P＜0.05.蛋白印迹分析eNOS蛋白表达,A组有极少量表达,B、C、D组也有少量表达,IA比值分别为(22.12±1.33)％、(25.42±2.41)％、(33.11±3.11)％,而E组表达最明显,IA比值为(84.22±9.22)％,与各组相比均P＜0.05.结论 超声辐照结合微泡造影剂能显著提高eNOS基因在VSMCs的转染效率,提高细胞内一氧化氮合成酶的表达.     

超声联合微泡造影剂携p53基因转染宫颈癌HeLa细胞的实验研究

目的 探讨超声联合微泡造影剂介导野生型p53(wtp53)基因转染宫颈癌HeLa细胞的可行性、效率性及作用效果.方法 以前期实验所筛选的超声辐照参数(300 kHz,0.5 W/cm~2,30 s)为实验条件,将HeLa细胞分为质粒组(A组)、质粒+超卢组(B组)、质粒+超声+微泡组(C组)、质粒+脂质体组(D组)、空白对照组(E组),分别进行处理.转染24～48 h后,收集各组细胞,荧光显微镜观察细胞基因转染效率、RT-PCR检测p53 mRNA表达,流式细胞仪检测细胞周期,M1Tr检测细胞增殖抑制情况.结果 荧光显微镜下见C、D组均有较多绿色荧光蛋白表达的细胞(转染率分别为14.15%和10.86%),B组仅有极少的荧光细胞(0.81%);A组和E组无荧光表达;RT-PCR结果 显示,C组和D组均可见特异性p53电泳条带,C组的电泳条带的光密度比值高于D组(P<0.05);流式细胞仪测细胞周期展示,转染野生型p53基因能使细胞周期出现明显的G_1期阻滞,C、D组与E组相比差异有显著性(P<0.05);MTT测定结果 显示c组细胞生长明显受抑,且随时间的延长,抑制程度逐渐增强.结论 适当浓度的微泡和优化的超声辐照条件可增强基因转染效率,野生型p53基阒能使HeLa细胞产生G_1期阻滞,抑制宫颈癌细胞生长.     

超声微泡造影剂介导pEGFP-N_1质粒转染HGFs的实验研究

目的 探讨超声破坏微泡介导pEGFP-N_1质粒转染人牙龈成纤维细胞的可行性、优化转染的条件及转染效率.方法 体外原代培养HGFs.以pEGFP-N_1质粒为报告基因,微泡造影剂为载体,用超声辐照介导质粒pEGFP-N_1转染HGFs.实验组分为质粒组、微泡+质粒组、超声+质粒组、超声+微泡+质粒组,超声+微泡+质粒组按不同的转染条件分成亚组.转染48 h后倒置荧光显微镜下观察GFP的表达,MTT检测HGFs活性.结果 超声微泡介导pEGFP-N_1质粒对HGFs的转染效率明显高于其他实验组(P<0.05).优化转染条件后,频率300 KHz,声强1.5 W/cm~2,连续波,辐照时间60 s,微泡浓度10%,质粒浓度6.67 μg/ml时,转染率较高.结论 在一定条件下,超声微泡造影剂能够促进外源基因对HGFs的转染.     

携自杀基因微泡转染卵巢癌细胞株SKOV_3的超声参数及转染效率

目的:探究超声介导携Ⅰ型单纯疱疹病毒胸苷激酶(hsv1tk)自杀基因微泡转染SKOV3细胞的超声参数及转染效率.方法:超声在不同微泡浓度与辐照时间(8,15,30,60s间隔1s)组合下辐照SKOV3细胞,MTT法筛选最适辐照时间和微泡浓度.将实验分成6组分别进行以下处理:超声辐照组,脂质体+超声辐照组,脂质体+微泡+超声辐照组,微泡+超声辐照组,裸质粒组(阴性对照),脂质体组(阳性对照).用裸质粒及脂质体处理后分别转染pcDNA3.1-EGFP/hsv1tk质粒;采用荧光显微镜、流式细胞技术分别定性和定量检测各组转染效率;采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测hsv1tk基因的表达.结果:MTT检测在超声强度0.5W/cm2,频率1MHz,微泡浓度0.56×1011个/L,辐照时间8s间隔1s条件下,超声辐照微泡转染对细胞活性无明显抑制.经此条件转染后荧光显微镜下可观察到脂质体+微泡+超声辐照组的绿色荧光强度最强;流式细胞技术检测表明,微泡+超声辐照组转染效率为(11.74±0.19)%,比超声辐照组(2.19±0.22)%高,而脂质体+微泡+超声辐照组(25.62±0.08)%均高于其他各组(P<...     

超声辐照维拉帕米微泡体外对神经母细胞瘤多药耐药的逆转作用

目的 探讨超声辐照维拉帕米(verpamil,VER)微泡逆转肿瘤多药耐药的作用及机制.方法 制备包裹维拉帕米的乳酸-羟基乙酸共聚物(VER-PLGA)超声微泡造影剂;通过长春新碱(VCR)多次小剂量递增诱导法建立神经母细胞瘤耐药株(SK-N-SH/VCR),并检测其耐药性;根据处理因素不同分为6组:A:空白对照组(SK-N-SH/VCR培养组),B:sK-N-SH/VCR+VER(50μg/ml)组,C:SK-N-SH/VCR+VER(250 μg/ml)组,D:SK-N-SH/VCR+超声辐照组,E:SK-N-SH/VCR+PLGA微泡+超声辐照组,F:SK-N-SH/VCR+VER-PLGA微泡(VER 50μg/ml)+超声辐照组.48 h后,利用RT-PCR和免疫组织化学染色法(ICC)检测各组细胞中MDR1基因及P-gP的表达水平,评估VER在不同处理组中逆转肿瘤细胞耐药的效果.结果 ①成功制备包裹维拉帕米的VER-PLGA微泡造影剂,包封率为32%;②成功建立神经母细胞瘤耐药株SK-N-SH/VCR,MTT法证实其对不同化疗药物的耐药倍数是野生株的2.3～5.4倍;③ICC证实耐药株高表达MDRI基因;④RT-PCR及免疫组化法检测发现MDR1基因在F组中的光密度值及P-gP表达水平较其他组明显降低(P<0.05).结论 超声辐照包裹小剂量维拉帕米的微泡可有效逆转肿瘤多药耐药.     

Inhibitory effect of ultrasound microbubbles carrying HSV1-TK gene combined with ganciclovir on prostate cancer cells

目的 观察超声微泡造影剂携单纯疱疹病毒Ⅰ型胸昔激酶(HSV1-TK)基因体外转染及联合前药更昔洛韦(GCV)对前列腺癌细胞株PC-3的抑制效应.方法 超声辐照PC-3细胞,MTT筛选出最适辐照时间;将含有HSV1 -TK基因的质粒通过静电吸附在脂质微泡表面,采用最适超声辐照转染,并用荧光显微镜及Western blot观察TK基因的转入及表达;MTT法观察使用不同浓度的前药更昔洛韦(GCV)后细胞增殖抑制率;流式细胞仪检测最适浓度的前药GCV对转染后的前列腺癌细胞PC-3的周期的影响;MTT法观察HSV1-TK/GCV自杀基因系统对前列腺癌PC-3细胞杀伤效应.结果 MTT检测显示超声强度为1.0 W/cm2,频率为1 MHz,辐照时间30 s时超声辐照对细胞无明显的抑制作用;通过超声辐照后HSV1-TK基因可以顺利转入PC-3细胞中并有稳定的表达.与对照组相比,当前药GCV浓度在100μg/ml时,超声+微泡+TK组细胞杀伤率明显高于其他各组,细胞存活率约32％,低于其他各组(P＜0.05);流式细胞术检测显示大多数细胞被阻断在S期,细胞生长受到明显抑制.结论 以超声辐照微泡造影剂为载体转染自杀基因联合前约GCV,对人前列腺癌细胞有明显杀伤作用.     

携HSV1-TK自杀基因超声微泡造影剂联合前药更昔洛韦对前列腺癌细胞的抑制

目的观察超声微泡造影剂携单纯疱疹病毒Ⅰ型胸昔激酶(HSV1-TK)基因体外转染及联合前药更昔洛韦(GCV)对前列腺癌细胞株PC-3的抑制效应。方法超声辐照PC-3细胞,MTT筛选出最适辐照时间;将含有HSV1-TK基因的质粒通过静电吸附在脂质微泡表面,采用最适超声辐照转染,并用荧光显微镜及Western blot观察TK基因的转入及表达;MTT法观察使用不同浓度的前药更昔洛韦(GCV)后细胞增殖抑制率;流式细胞仪检测最适浓度的前药GCV对转染后的前列腺癌细胞PC-3的周期的影响;MTT法观察HSV1-TK/GCV自杀基因系统对前列腺癌PC-3细胞杀伤效应。结果 MTT检测显示超声强度为1.0 W/cm2,频率为1 MHz,辐照时间30 s时超声辐照对细胞无明显的抑制作用;通过超声辐照后HSV1-TK基因可以顺利转入PC-3细胞中并有稳定的表达。与对照组相比,当前药GCV浓度在100μg/ml时,超声+微泡+TK组细胞杀伤率明显高于其他各组,细胞存活率约32%,低于其他各组(P<0.05);流式细胞术检测显示大多数细胞被阻断在S期,细胞生长受到明显抑制。结论以超声辐照微泡造影剂为载体转染自杀基因联合前药GCV,对人前列腺癌细胞有明显杀伤作用。     

超声联合微泡介导缺氧诱导因子-1α基因转染293T细胞的实验研究

目的:探讨超声联合微泡造影剂介导缺氧诱导因子(HIF)-1α基因转染人胚肾293T细胞的转染效率。方法:将6孔板中的293T细胞悬液分为3组,A组:质粒+超声辐照组,加入质粒,终浓度为15μg/孔;B组:载基因微泡+超声辐照组,加入载基因质粒微泡混合液,质粒的终浓度为15μg/孔,微泡的终浓度为200μl/孔;C组:对照组,每孔中仅加入单纯质粒DNA,终浓度15μg/孔。A组和B组均接受超声辐照,超声照射条件为连续波,声强1.5 W/cm2,辐照时间30s。超声辐照转染48h后,用荧光显微镜和流式细胞仪分别定性定量观察各组细胞基因的转染效率。结果:转染48h后,荧光显微镜观察到转染成功的细胞内发出绿色荧光,流式细胞仪检测A组、B组、C组的基因转染效率分别为(5.6±0.5)%、(30.5±1.0)%、(0.1±0.1)%。结论:超声辐照联合微泡能够介导治疗性基因的体外细胞转染,为冠心病心肌缺血的HIF-1α基因治疗奠定基础。     

超声微泡造影剂介导LMP-1基因转染树突状细胞的实验研究

目的 探讨超声微泡造影剂介导LMP-1基因转染外周血来源的树突状细胞的有效性及最佳的超声辐照参数.方法 体外培养树突状细胞,在不同的超声波强度、机械指数、照射时间及不同的超声微泡造影剂浓度作用下,观察LMP-1基因与绿色荧光蛋白共表达的融合重组质粒pEGFP-C3-LMP1在树突状细胞的定向转染.在荧光显微镜下观察荧光蛋白质粒在树突状细胞中的表达,流式细胞仪评价重组质粒的转染效率,台盼蓝染色检测细胞活性.结果 超声辐照机械指数1.0、照射时间60 s、微泡造影剂浓度为20%,达到最佳的基因转染效率(14.37±2.12)%,且细胞生存率>90%.结论 微泡造影剂在超声辐射下可以有效地介导基因转染树突状细胞.     

沙眼衣原体ompA基因克隆及其在真核细胞中的表达

目的克隆D型沙眼衣原体(Ct)ompA基因,构建真核表达重组质粒,转染真核细胞,为核酸疫苗的研制作准备.方法用PCR技术从D型Ct基因组DNA中扩增ompA基因片段,重组入pUCm-T克隆载体.将pUCm-T/ompA中的ompA外源基因片段经酶切、连接等反应,亚克隆入pcDNA3.1真核表达载体,进行序列分析和酶切鉴定后,运用脂质体将重组体pcDNA3.1/ompA转染HeLa细胞,免疫组化法观察目的的基因的表达.结果从D型Ct基因组DNA中扩增出特异的ompA基因片段;序列测定证实与GenBank登陆的D型Ct一致;重组质粒pcDNA3.1/ompA在HeLa中获得表达.结论Ct ompA基因能够在体外真核细胞表达,为进一步研究Ct致病机制及DNA疫苗的研究提供理论依据.     

Ｌｉｍｓ Ｅ：一个新的ＬＩＭ同源域基因的克隆和初步分析

目的:克隆与分析小鼠不同剪切的Lims基因.方法:应用巢式RT-PCR,以小鼠cDNA为模板,扩增Lims基因不同剪切子,构入PinPointTM Xa-1T质粒,测序鉴定.结果:测序表明克隆了新的Lims基因变异剪切体Lims E,该变异剪切体编码区为1 164 bp.编码387个氨基酸.结论:比较基因组学分析显示,成功地克隆了一新的小鼠Liras基因剪切子Lims E,为进一步研究Lims基因在细胞发育中的功能打下了基础.     

哺乳动物性别决定基因的研究进展

目的了解哺乳动物性别决定基因的作用与功能。方法查阅本领域国内外文献并进行综述。结果SRY、SOX9、WT1、SF1、AMH及DAX1等基因都参与哺乳动物性别决定。结论性别决定基因的研究对性分化与发育异常等临床疾病的诊断和治疗具有十分重要的意义。     

人B7-1/Sart3融合基因的克隆和表达

目的：构建人共刺激分子CD80(B7-1)、T细胞识别的鳞状细胞癌抗原3(Sart3)融合基因真核表达载体，并分别在原核和人成纤维细胞中表达。方法：采用RT-PCR技术，从人胎盘组织抽提的总RNA中克隆Sart3基因的部分cDNA序列(第1～1281bp)．此段序列包括已报道的能诱导HLA限制性细胞毒性T淋巴细胞的抗原表位。然后将不含终止密码子的B7-1 cDNA和Sart3 cDNA共克隆入真核表达载体pEGFP-N1，测定核苷酸序列确定重组成功后，分别转染大肠杆菌和人成纤维细胞，利用流式细胞仪和Western blot检测B7和Sart3的表达。结果：构建人B7、Sart3融合基因真核表达载体B7sart3／pEGFPN。测序结果与GenBank的B7、Sart3相应序列(NM_005191、NM_014706)一致．阅读框无改变。流式细胞仪测定发现在转染的人成纤维细胞表面有明显的荧光增强．免疫印迹发现融合蛋白可以与抗B7抗体反应，融合蛋白分子量与B7-Sart3-EGFP的预测分子量相当。结论：成功构建真核表达载体B7Sart3／pEGFPN，并在人成纤维细胞中表达。为下一步研究将SART3蛋白作为肿瘤疫苗应用于骨肉瘤的生物治疗打下基础。     

穿梭质粒pZH32的构建

以pS189、pSV_2gpt、pMCi5为材料,构建了以EB病毒为基础,以酪氨酸tRNA琥珀突变校正基因SupF为靶基因,以黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因Eco gpt为选择标记基因的穿梭质粒pZH32。pZH32长9.4kb,克服了以SV40为基础的穿梭质粒自发突变率高以及宿主范围局限的缺点。SupF基因遗传背景清楚,长度126bp,便于进行序列分析。gpt基因使转化克隆的筛选更加方便。有利于建立一种化学诱变剂的分子检测系统,研究基因突变的类型和突变机制。     

GFP-pl6融合基因表达载体的构建

本文报道了以ＧＦＰ（绿色荧光蛋白）基因为报告基因，ｐｌ６基因为目的基因，将ｐｌ６基因分别插入ＧＦＰ基因的上游和下游，构建成ＧＦＰ－ｐｌ６融合基因表达载体ｐＣｐｌ６Ｇ和ｐＣＧｐ１６，并通过酶切、电泳技术对重组体进行了鉴定。该表达载体的构建成功为开展ｐｌ６转基因动物模型的建立及其特性研究奠定了基础     

Rh(-)献血者128例基因分型

目的：探讨Rh(-)献血者RhD基因分型的临床意义。方法：采用PCR－－SSP技术检测郑州市128例Rh（－）献血者的RhD基因结构，用氯仿／三氯甲烷法放散检测D^u检测，结果：RhD基因多态性存在3种基本形式，其中外显子完整存在32例（25．00％），全部为D^u型，完全缺失85例（66．41％），部分缺失11例（8．59％），其中2例为D^u型。结论：RhD基因的丰富多态性对于确保输血安全具有指导意义。     

肿瘤特异性报告基因载体的构建

目的：将构建一种能在肿瘤组织中进行肿瘤行异性表达的逆转录病毒载体，增强肿瘤基因治疗的靶向性。方法：PCR法获得HER2基因的启动子片段并将其克隆至逆转录病毒载体P^LXSN中，再将突变型绿色荧光蛋白（mtGFP)基因克隆至该启动子下游。结果：质粒P^LHSN经EcoR I和BamH I酶切后可切出510bp和5.8kb两条片段；质粒P^LHGSN经BamH I酶切可切出520bp和6.7kb两条片段。结论：成功构建了携带HER2基因启动子和mtGFP报告基因的逆转录病毒载体。     

慢性胃炎胃粘膜上皮细胞中bax、fas、p16基因的表达

目的:探讨bax、fas和p16在胃粘膜病变发生发展过程中的作用及意义.方法:应用免疫组织化学方法,检测慢性浅表性胃炎(CSG)和轻、中、重度慢性萎缩性胃炎(CAG)患者胃粘膜上皮细胞中bax、fas(促凋亡基因)和p16(增殖负调控基因)基因蛋白的表达情况.结果:CSG和轻、中、重度CAG胃粘膜中bax的表达率分别为41.75%、72.41%和78.26%,fas的表达率分别为39.81%、65.52%和78.26%,p16的表达率分别为9.71%、24.14%和30.43%.轻、中、重度CAG与CSG比较,bax、fas、p16的表达差异有显著性意义P<0.05～0.01.轻、中、重度CAG间比较,差异无显著性意义.结论:bax、fas和p16的高表达,使得细胞增殖/凋亡的比例失衡,在胃粘膜病变的发生发展中可能有重要意义.     

应用RNA干扰抑制目的基因在小鼠体内表达

目的研究RNA干扰(RNAi)对体外和体内基因表达的沉默作用。方法以PCR方法从基因组DNA中克隆出依赖于RNA聚合酶Ⅲ的H1启动子,并用于驱动RNAi片段的合成;构建特异性针对目的基因(绿色荧光蛋白,GFP)的RNAi载体(Pi)。将RNAi干扰载体和GFP载体转染NIH3T3细胞,应用荧光显微镜观察、RT-PCR、流式细胞技术(FACS)分析上述细胞中RNAi对目的基因GFP表达的抑制效果,进一步在个体水平将RNAi载体注入小鼠体内,研究RNAi对GFP表达的抑制情况。结果RNAi能有效地使NIH3T3细胞中GFP表达量降低约60%以上,并能有效地抑制GFP在转基因小鼠体内的表达。结论RNAi技术能抑制目的基因在体内外的表达,是一种有效的基因治疗工具。