胰岛素生长因子1在颅缝闭合中调节作用的实验研究

目的：研究胰岛素生长因子1对大鼠颅缝细胞的骨诱导作用和体外调节小鼠矢状缝闭合的作用。方法：获取新出生的SD大鼠的矢状缝细胞进行培养和出生8d的CD1小鼠矢状缝进行体外无血清器官培养基培养，加入胰岛素生长因子1（insulin lilce growth factor 1 IGF1），浓度分别为10ng/ml和40ng/ml，并设立不加IGF1者为对照组，应用RT－PCR检测颅缝细胞的成骨细胞表型碱性磷酸酶、骨钙素和骨桥蛋白mRNA表达，ELISA法检测培养液I型胶原的分泌，光镜观察小鼠矢状缝闭合的情况。结果：加入IGF1的矢状缝细胞的成骨细胞表型碱性磷酸酶、骨钙素和骨桥蛋白mRNA表达以及培养液I型胶原分泌量较对照组明显增高。有IGF1干预的矢状缝移植体培养8d时，颅缝内侧面骨板开始接近，培养20d时，颅缝小部分闭合，培养30d时颅缝大部分闭合，无IGF1干预的对照组培养30d，颅缝未发生闭合。结论：胰岛素生长因子1通过增强颅缝细胞的骨诱导促进颅缝的闭合。     

大鼠颅骨矢状缝牵引成骨的体外研究

目的：探讨建立幼年SD大鼠颅骨器官体外培养的方法，研究外源性张力对颅骨矢状缝成骨活动的影响。方法：取19日龄的ND大鼠颅顶骨矢状缝组织块，试验组加0．4g力，对照组不加力。经器官培养后进行组织学观察和免疫组织化学检查，并检查胰岛素样生长因子-1（insulin-1ike growth factor-1，IGF-1）等mRNA的变化情况。结果：试验组骨缝内成骨细胞活跃，IGF-1阳性染色位于颅缝内成骨细胞，实验组IGF-1 mRNA表达量高于对照组。结论：大鼠颅骨骨缝器官可在体外培养中成功存活并生长。外源机械张力可以扩宽骨缝，刺激成骨活动，可显著增加IGF-1的合成。     

碱性成纤维生长因子对颅缝细胞成骨分化的影响

目的 探讨碱性成纤维生长因子（FGF-2）对颅缝细胞成骨方向分化的影响.方法 ①获取新生SD大鼠颅骨矢状缝及冠状缝处颅缝细胞.②添加不同浓度FGF-2,观察颅缝细胞ALP染色、ALP活性及成骨标志物（osteocalcin,OC）表达量,了解不同浓度FGF-2对颅缝细胞向成骨分化的影响.结果①各浓度FGF-2作用于颅缝细胞后,ALP染色、活性均较对照组减弱（P ＜0.05）.其中10ng/ml FGF-2诱导的细胞ALP受到的抑制最弱.②各浓度FGF-2作用于颅缝细胞后,OC表达量均较对照组增加（P ＜0.05）.其中10ng/mlFGF-2诱导的细胞其OC表达量最高.结论 ①FGF-2抑制颅缝细胞早期成骨标志物ALP的表达,而增强晚期成骨标志物OC的表达.②较低浓度的FGF-2（10ng/ml）对ALP抑制作用最弱,对OC促进作用最强,最利于促进颅缝细胞向成骨方向分化.     

颅面多骨缝固定对颅颌形态影响的实验研究

目的通过固定幼兔颅骨缝，模拟颅骨多骨缝早闭，观察固定后颅颌面生长方式的变化及相互影响的关系。方法采用牙科釉质粘合剂固定２周龄幼兔冠状缝、矢状缝和额间缝，模拟颅骨多骨缝早闭。术后不同时期测量颅穹窿长度、高度、面中部高度、上颌骨长度、面角、腭角和颅底角。结果多骨缝早闭后，颅穹窿高度和长度明显减少，使颅骨变短且扁平。面中部高度和上颌骨长度增大，整个面中骨结构有整体向上移动趋势。面、腭和颅底角增大，这与颅穹窿变浅，面中部高度增大相对应。结论兔出生后１０周前是颅骨缝扩张性生长高峰期，在此期间，某些原因影响颅骨正常生长，必然导致颅面畸形。实验结果与临床颅骨骨缝早闭后表现类似，和主张早期手术矫正畸形观点一致     

SD大鼠颅缝细胞不同时期GPC3基因表达变化的研究

目的 探索GPC3基因在颅缝组织和细胞中不同时期的表达情况,为后续的疾病模型研究提供参照。方法研究并观察1 d、3 d、7 d的SD大鼠颅缝细胞组织,应用组织切片免疫荧光染色、RT-q PCR、Western Blot等方法,检测其在不同年龄SD大鼠中的表达水平,判断其与颅骨成骨及颅缝闭合的关系。结果 免疫荧光显示,GPC3在大鼠未闭合颅缝组织不同阶段胞内、细胞表面及胞外均有表达;RT-q PCR、Western Blotting结果显示,GPC3基因表达随着大鼠年龄增长呈现下降趋势。结论 SD大鼠中,GPC3与颅缝闭合密切相关。     

FGF-2与BMP-2在颅缝细胞成骨分化中的相互作用

目的探讨碱性成纤维生长因子2(FGF-2)与骨形成蛋白2(BMP-2)在颅缝细胞成骨分化中的相互作用及其机制。方法获取新生SD大鼠颅骨矢状缝及冠状缝处颅缝细胞,在培养体系中添加FGF-2,观察BMP-2表达情况。同时在培养体系中添加FGF-2及BMP-2,ALP染色、矿化染色、qPCR检测成骨标志物,观察颅缝细胞成骨分化情况。添加BMP-2抑制剂Noggin后,观察颅缝细胞成骨分化的转归。结果FGF-2可促进BMP-2在颅缝细胞中的表达,呈浓度依赖性及时间依赖性;两者同时作用颅缝细胞可促进其晚期成骨分化,抑制其早期成骨分化。Noggin阻断BMP-2信号通道后,FGF-2及FGF-2+BMP-2促进颅缝细胞晚期成骨分化作用均减弱。结论BMP-2是FGF-2调控颅缝细胞晚期成骨分化不可或缺的下游因子。     

大鼠颅骨体外培养矢状缝牵引成骨模型的建立

目的探讨建直幼年SD大鼠顿骨器官体外培养矢状缝牵引成骨模型。方法取19日龄的SD大鼠颅顶骨矢状缝组织块．随机分为对照组和实验组进行体外器官培养。实验组加力约3．92×10^3N（0．4g）力Hr照组不加力。培养24h结束时,进行大体观察及倒置显微镜下观察;并经苏木精-伊红染色后进行组织学观察。结果大体观察／受倒置显微镜下观察发现,实验组骨缝逐渐明显加宽。至加力24h,所有标本欠状缝未见断裂。组织学观察发现,缝两侧区域为成骨活跃部位,两侧骨化前沿交错排列。缝内可见纤维结缔纠织、成骨细胞、成纤维细胞及毛细血管,缝内组织与硬脑膜相连。对照组骨缝保持正常发育,未见明显变化,以成骨细胞为主。结论大鼠颅骨骨缝器官可以在体外培养中成功存活并继续生长。     

骨缝牵引成骨动物模型的建立及应用

目的建立兔颅骨矢状缝牵引成骨的动物实验模型,评价该模型的可行性,并探讨局部应用rhBMP-2对牵引成骨的作用。方法以微型牵引种植钉(Miniscrew implants,MSI)作支抗,镍钛弹簧为牵引力源,建立MSI兔颅骨矢状缝弹力牵引成骨模型。应用该牵引系统对11周龄的新西兰白兔作矢状缝牵引成骨。将动物随机分为实验组(牵引+rh BMP-2,n=7),对照组(单纯牵引,n=7)。牵引29天,于0、5、11、17、23及29 d,应用X线及Micro-CT评价骨缝牵开情况;第7、27天注射四环素,第17天注射钙黄绿素,作为术后荧光组织切片观察标记。观察动物对该牵引成骨系统的耐受性,比较各组骨缝牵开的距离,并观察矢状缝组织形态学变化,验证兔颅骨矢状缝牵引成骨模型的可行性。结果MSI弹力牵引系统成功率为86%,牵引成骨实验可顺利完成。对照组矢状缝牵开的距离大于实验组(D29),两组矢状缝牵开的距离随着牵引持续时间的增加而递增,但骨缝牵开呈现先快后慢的趋势。骨组织形态学显示,两组骨缝间均有新生骨组织形成,说明该牵引成骨模型既能有效牵开骨缝,也能诱导骨缝间成骨。而实验组骨缝间新生骨组织形成速度大于对照组。结论本实验采用自行研制的微型种植钉MSI弹力牵引系统,成功建立了兔矢状缝弹力牵引成骨模型。骨缝牵引过程中,局部应用rhBMP-2可促进骨缝成骨,但导致了骨缝融合。     

颅盖成形术治疗先天性颅缝早闭症

目的探讨治疗先天性颅缝早闭症的多种颅盖手术方法。方法采用下述方法治疗37例先天性颅缝早闭症：①眶额前移额骨瓣交叉旋转顶骨支撑术治疗短头、尖头及塔头畸形;采用梅花形颅骨瓣治疗矢状缝早闭。②额眶成形术治疗三角头。③双侧额骨瓣旋转,额眶带前移、患侧额骨瓣前倾术治疗单侧冠状缝早闭引起的前斜头畸形。④双侧顶枕骨瓣旋转交错,梅花形骨瓣成形术治疗单侧人字缝早闭引起的后斜头畸形;⑤额面前移术治疗双侧冠状缝早闭及颅底缝早闭形成的短头畸形,及合并Apert或Crouzon综合征的颅面畸形。结果37例先天性颅缝早闭症均痊愈出院,术后随访2～3年无明显并发症,头颅外形均得到了改善。结论在治疗先天性颅缝早闭症时,采用大骨瓣的颅盖成形术仍不失为治疗颅面畸形的好方法。     

新致病基因在颅缝早闭Crouzon综合征中的初步机制研究

目的研究Rbp4(Retinol binding protein 4)、Gpc3(Glypican family of growth factor binding protein 3)、C1qtnf3(Collagenous repeat-containing sequence of 26 KDa protein)等新致病基因在颅缝早闭症中的发病机制,为疾病非手术治疗奠定理论基础。方法以Crouzon综合征Fgfr2cC342Y/+小鼠为实验模型,应用MicroCT和组织学染色,研究小鼠颅缝闭合模式;以Fgfr2cC342Y/+模型,RT-qPCR研究Rbp4、Gpc3、C1qtnf3等新致病基因的表达差异,初步探讨其在颅缝闭合过程中的调控作用;以体外培养的Fgfr2cC342Y/+小鼠颅缝细胞为模型,研究基因突变动物细胞增殖与代谢改变。结果获得Fgfr2cC342Y/+小鼠后额缝、冠状缝、人字缝、矢状缝等颅缝闭合模式,随颅骨发育、颅缝闭合,OC(Osteocalcin)、ALP(Alkalinephosphatase)表达增加,目的基因Rbp4、Gpc3、C1qtnf3表达下降,Msx2(Muscle segment homeobox gene 2)表达增加,杂合子与野生型小鼠之间均存在显著统计学差异,与前期人颅缝组织Microarray研究结果一致。Gpc1(Glypican family ofgrowth factor binding protein 1)、FliI(Flightless I)在颅缝闭合中的表达较恒定,野生型与杂合子之间未见明显统计学差异。体外培养Fgfr2cC342Y/+小鼠颅缝细胞,CellTiter96 MTS和Quant-iT Picogreen dsDNA细胞增殖与代谢分析结果显示,Fgfr2功能获得性突变可促进冠状缝细胞的增殖,从而导致成骨增加,颅缝早闭。结论 Fgfr2cC342Y/+模型新致病基因表达趋势与前期人颅缝组织Microarray研究结果一致,Rbp4、Gpc3、C1qtnf3可能在颅缝早闭中具重要调控作用。     

肾衰泻浊丸对单侧输尿管梗阻大鼠肾组织核转录因子κB与肝细胞生长因子及骨桥蛋白mRNA表达的影响

目的：通过研究中药复方——肾衰泻浊丸对单侧输尿管梗阻（UUO）大鼠肾间质核转录因子κB（NF-κB）、骨桥蛋白（OPN）、肝细胞生长因子（HGF）表达的影响,探讨其抗肾间质纤维化的机制。方法：建立UUO大鼠模型,72只成年雄性Wistar大鼠随机分为假手术组、模型组、贝那普利组及肾衰泻浊丸低、中、高剂量组。在不同的时间点（14、21、28d）检测每组4只实验大鼠治疗后的血清尿素氮（BUN）、肌酐（Scr）变化。观察梗阻侧肾脏病理变化;采用免疫组化法检测肾组织中的NF-κB、HGF及OPN的表达;RT-PCR法检测肾组织中OPNmRNA的表达水平。结果：与假手术组相比,模型组大鼠血清BUN、Scr水平、NF-κB、OPN表达显著升高,HGF表达减少差异有统计学意义（P〈0.01,P〈0.05）;与模型组相比,各治疗组血BUN、Scr水平、NF-κB、OPN表达均显著降低,HGF表达均有所增多差异有统计学意义（P〈0.01,P〈0.05）。肾衰泻浊丸能够明显降低UUO大鼠血BUN、Scr水平,减轻肾间质损伤,明显下调肾组织中NF-κB和OPN的表达、上调HGF的表达,与贝那普利组比较差异有统计学意义（P〈0.01,P〈0.05）。结论：肾衰泻浊丸可能通过改善肾功能、抑制NF-κB、OPN的表达、诱导HGF的高表达,从而改善肾间质纤维化。     

Evidence for the formation of a complex between osteopontin and osteocalcin.

We hypothesize that the mechanisms governing bone formation and remodeling involve the assembly of some of the components of the extracellular matrix into supramolecular complexes. We have examined the associations of osteopontin (OPN) with other proteins isolated from demineralized rat long bones. Three ligand binding techniques were used to demonstrate the formation of complexes between osteopontin and osteocalcin (OCN). Using gel overlay assays, the binding between soluble 125I-OPN and OCN immobilized in acrylamide gels was visualized. Competition for 125I-OPN-OCN complexes was demonstrated when unlabeled OCN-enriched bone extract was included in gel overlay solutions. Also, gel overlay assays showed 125I-OCN binding to OPN. Saturable binding was shown in solid-phase filter binding assays, which yielded an equilibrium binding constant of moderately high affinity (approximately 10(-8) M). Specificity of OPN-OCN complex formation was confirmed by measuring binding in the presence of unlabeled OPN and OCN versus a bone-localized serum protein, alpha 2HS-glycoprotein. Finally, the formation of soluble complexes were demonstrated in a modified Hummel-Dreyer gel filtration assay. These results indicate that OPN and OCN form complexes in vitro. The possible functions of OPN-OCN complexes in osteoclast recruitment and attachment are discussed.     

An analysis of the growth of the cranial vault in rabbits by vital staining with lead acetate

The mode and the rate of formation of individual bones in the cranium were studied by vital staining with lead acetate in 13 New Zealand white rabbits beginning at 35 days of age. These evaluations were compared with⁴⁵Ca uptake at bilaterally comparable sites.The growth patterns differed from one suture to another. Elongation of the cranial vault in the anterior direction in the snout area was rapid. In the sagittal suture complex, active growth was observed on the intrasutural surfaces of the internasal and metopic sutures, while much less growth was taking place in the sagittal suture. Active growth also was taking place at the intrasutural surface of the nasal bone at the naso-premaxillary suture while resorption was found on the surface of the parietal bone in the squamosal suture.Increase in thickness of the cranial vault appeared to be the result of accretion on the ectocranial and to a lesser extent on the endocranial surfaces of the frontal and parietal bones.Good correlations between the linear measurement with the lead lines and⁴⁵Ca uptake were observed in the bones of the cranial vault, especially when⁴⁵Ca was administered 3 or 6 days before sacrifice.Fellowship F05-TW-1029.     

宫腔镜探讨剖宫产与有症状子宫内膜息肉发生的关系

目的宫腔镜探讨剖宫产与有症状子宫内膜息肉发生的关系。方法将2007年1月～2010年12月因产后2年内出现异常子宫出血而在珠海市香洲区人民医院妇产科进行宫腔镜诊治术的35岁以下的患者分为有剖宫产史（实验组）和无剖宫产史（对照组）两组,对比两组患者子宫内膜息肉的发生率和产后阴道流血时间;同时对比同期住院的剖宫产产妇与顺产产妇的子宫复旧情况。结果去除其他造成异常子宫出血的因素后,实验组的157例妇女中有15例（9.55%）发生子宫内膜息肉,而对照组143例妇女中有1例单发息肉（0.70%）,差异具有统计学意义（P〈0.05）;实验组产后阴道流血时间平均为（35.3±14.5）d,对照组平均为（14.6±9.3）d,差异具有统计学意义（P〈0.05）。同期住院的剖宫产产妇术后4d和14d宫底分别平均为脐下（2.7±1.0）cm和耻骨联合上（2.3±1.8）cm,顺产产妇产后4d和14d的宫底分别为脐下（6.7±1.3）cm和0（已位于盆腔内无法经腹部触及）;剖宫产组产后阴道流血时间为（32.1±12.1）d,也明显长于顺产组的（14.2±7.8）d,差异具有统计学意义（P〈0.05）。结论剖宫产使子宫内膜息肉尤其是有症状子宫内膜息肉的发生率升高,也是子宫内膜息肉形成的独立危险因素之一。子宫内膜息肉是剖宫产术后异常子宫出血的重要原因之一,其发生与术后子宫复旧不良、阴道流血时间过长有一定的关系。为减少异常子宫出血的发生率,应尽量减少剖宫产率。     

蝙蝠蛾拟青霉Cs-4对阿霉素肾病大鼠致纤维化因子表达的影响

目的探讨蝙蝠蛾拟青霉Cs-4对阿霉素肾病大鼠肾脏的保护作用。方法选择雄性Wistar大鼠24只,采用单侧肾脏切除加尾静脉重复注射阿霉素的方法建立阿霉素肾病模型,随机分为正常对照组（N组）、模型组（M组）、蝙蝠蛾拟青霉素Cs-4治疗组（P组）和贝那普利治疗组（B组）,每组6只。于用药后第8周观察各组大鼠24h尿蛋白定量、尿素氮（BUN）、血肌酐（SCr）的水平,应用半定量逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）方法测定肾脏组织骨调素（OPN）mRNA、金属蛋白酶组织抑制物1（TIMP-1）mRNA、转化生长因子β1（TGF-β1）mRNA的表达。结果M组OPN、TIMP1、TGF较N组表达明显升高（P〈0．01）,P组及B组较M组明显降低（P〈0．01）。结论蝙蝠蛾拟青霉Cs-4可下调阿霉素肾病大鼠肾组织中TIMP-1、OPN、TGF-β1的表达,调节细胞外基质的生成与降解,从而减轻肾脏纤维化,发挥其。肾脏保护作用。     

生长因子FGF在颅缝细胞培养中作用的研究

目的:研究生长因子FGF在颅缝闭合中的调控作用.方法:以颅缝早闭动物模型(SD鼠)的颅缝为研究模型,采用细胞生物学技术、组织化学技术,研究颅缝闭合期间,生长因子bFGF作用下,细胞胶原及骨钙素分泌情况;观察生长因子bFGF,对分离培养的颅缝细胞增殖与代谢影响.结果:在大鼠颅缝分离培养细胞中,bFGF促进颅缝分离培养细胞分泌胶原、骨钙素,加快细胞增殖生长曲线平台期出现,并有效促进大鼠颅缝分离培养细胞S期增殖(p＜0.05).结论:在体外器官培养中,bFGF能促进大鼠分离培养颅缝细胞的活性(p＜0.05).