应用等位基因特异性多重聚合酶链反应同步检测结核分枝杆菌的耐药性

目的建立可同步检测结核分枝杆菌katG和ropoB基因突变的等位基因特异性多重聚合酶链反应（MAS-PCR）的方法，以快速检测结核分枝杆菌对利福平（RFP）和异烟肼（INH）的耐药性。方法根据结核分枝杆菌katG和rpoB基因序列，分别设计特异性寡聚核苷酸引物，采用MAS-PCR技术，分别检测katG基因315位点和rpoB基因中531、526和516三个最常见的突变位点。结果19株INH敏感株中均未发现katG基因315位点的突变，耐药株中发现有79．2％（61／77）的菌株存在突变；15株RFP敏感株中未发现rpoB基因突变。MAS-PCR方法可检测出81．5％（66／81）的利福平耐药株。结论MAS-PCR方法对katG和rpoB基因的同步检测有较高的敏感性和特异性，有望用于耐药结核分枝杆菌的快速检测。     

单耐利福平结核分枝杆菌耐药分子机制研究

目的 探讨单耐利福平结核分枝杆菌中耐药相关基因突变以及药物外排泵两种不同耐药机制的功能。 方法 从国家结核病参比实验室2007-2008年全国耐药基线调查菌株库中挑选单耐利福平的菌株23株。采用直接测序法检测利福平耐药相关基因rpoB突变情况。提取rpoB无突变菌株的RNA后反转录并采用real-time PCR方法检测20个药物外排泵基因的表达量,对比菌株最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration,MIC）实验结果,筛选可能与利福平药物外排相关的基因,并选用大肠埃希菌为模式生物,构建表达载体,检测过表达目的外排泵的大肠埃希菌对利福平的耐药程度以验证。结果 在23株单耐利福平的菌株中,有16株（69.6%）检测到rpoB突变,其中包括531位点突变9株,526位点突变6株及533位点突变1株。Ser531Leu、His526Asp表现为高浓度耐药,其MIC分别为192 μg/ml和256 μg/ml;而突变类型His526Gly、His526Leu、His526Arg和Leu533Pro表现为低浓度耐药,其MIC分别为0.75 μg/ml、4 μg/ml、2 μg/ml和0.5 μg/ml。在rpoB未突变菌株中,通过real-time PCR发现Rv2936、Rv0783和Rv0933的转录水平与MIC呈正相关。在对照组和转入pEASY-E1-Rv0933的大肠埃希菌中MIC均为 8 μg/ml,而转入pEASY-E1-Rv2936和 pEASY-E1-Rv0783的大肠埃希菌的MIC均有不同程度的提高,分别为32 μg/ml和16 μg/ml。结论 不同耐药突变类型导致的耐药程度不同,Rv2936和Rv0783可能是与利福平耐药相关的的药物外排泵基因。     

RPA-LFD技术快速检测结核分枝杆菌利福平耐药性的应用

目的 基于重组酶聚合酶扩增(RPA)技术结合侧向流动试纸条(LFD),建立可快速检测结核分枝杆菌(MTB)利福平耐药的方法,并初步评价其临床应用价值.方法 采用比例法对182株结核分枝杆菌临床分离株进行利福平耐药性检测.建立RPA-LFD技术,检测182株菌株中利福平耐药决定区(RRDR)常见突变位点rpoB 531、...     

结核分枝杆菌利福平依赖株与耐药株的耐药状况比较

目的 调查结核分枝杆菌利福平依赖株和耐药株对临床常用抗结核药物的耐药性差异,并探讨其临床意义。 方法 采用匡氏双相琼脂培养基分离痰结核分枝杆菌并作耐药性和依赖性测定。 结果依赖组菌株对8种药物的耐药率均高于耐药组菌株,2组菌株对链霉素(S)、乙胺丁醇(E)、对氨基水杨酸 (PAS)、阿米卡星(Am)的耐药率差异有统计学意义(P<0.05),对左氧氟沙星(Lfx)的耐药率差异有统计学意义(P<0.01);100%依赖株和98.6%耐药株为MDR株;依赖株和耐药株中XDR菌株的比例分别为14.6%和5.8%,P=0.05。 结论 结核分枝杆菌利福平依赖株均为MDR株,对一线和二线抗结核药物耐药率高,XDR株比例高,应予高度警惕和关注。     

rpoB基因点突变与结核分枝杆菌对利福平耐药相关性的研究

目的了解浙江地区分离的结核分枝杆菌临床菌株对利福平（RFP）的耐药率及该菌rpoB基因点突变与RFP耐药性的关系。方法从浙江地区肺结核病人的痰液或咽拭子标本中分离并鉴定结核分枝杆菌72株。采用K-B纸片法和E-试验法检测上述结核分枝杆菌临床菌株对RFP的耐药性。采用PCR检测上述结核分枝杆菌临床菌株rpoB基因携带率。通过对RFP敏感或耐药各10株结核分枝杆菌临床菌株rpoB基因T-A克隆后测序，了解该基因氨基酸序列第516、526和531位点突变情况及其与RFP耐药性的关系。结果38．9％（28／72）结核分枝杆菌临床菌株对RFP耐药。所有结核分枝杆菌临床菌株均携带rpoB基因。1株RFP敏感的结核分枝杆菌临床菌株rpoB基因氨基酸序列中出现S526L点突变。5株RFP耐药的结核分枝杆菌临床菌株rpoB基因氨基酸序列中出现S526L点突变，另5株发生H531D点突变，但均未发现516位氨基酸突变或526和531位氨基酸联合突变。结论浙江地区分离的结核分枝杆菌临床菌株有较高的RFP耐药频率。上述结核分枝杆菌临床菌株对RFP耐药性与rpoB基因氨基酸序列526或531位点突变密切相关。     

984株结核分枝杆菌耐药情况分析

目的了解浙江省当前结核病对一线抗结核药物的耐药水平及耐多药情况，为今后结核病防治工作提供参考依据。方法采用WHO推荐的药敏比例法对984株临床分离结核分枝杆菌进行药物敏感性试验。结果总耐药率为30．6％，初始耐药率为26．6％，获得性耐药率为52．3％，耐多药（MDR）率为7．6％。结论浙江省耐药水平有上升趋势，应引起相关卫生部门的关注。     

MTBDR plus方法快速检测北京地区临床结核分枝杆菌分离株利福平和异烟肼耐药性效果评价

目的评估MTBDR plus试剂盒在北京地区快速检测利福平和异烟肼的耐药性的效果。方法筛选169例临床结核分枝杆菌分离株,以国际标准的比例法作为对照,探讨该试剂盒在临床上应用的敏感性和特异性以及突变分布频率。结果在北京地区使用MTBDR plus检测利福平和异烟肼的敏感性和特异性分别为96.9%、85.3%和93.2%、98.1%。rpoB基因频率最高的突变位点是S531L(55.2%),其次是D516V(8.3%)、H526Y(7.3%)和H526D(3.1%)。katG基因频率最高的突变位点是S315T1(62.9%),而inhA是C15T位点(21.6%)。结论 MTBDR plus是一个敏感、特异和快速的诊断利福平、异烟肼耐药性和MDR的有效方法。     

结核分枝杆菌及利福平耐药核酸扩增检测成本分析

目的 比较固体培养、比例法药敏和结核分枝杆菌及利福平耐药核酸扩增（Xpert Mtb/RIF）(简称“Xpert”)检测在中国基层实验室应用的检测成本。 方法 选取4个县（区）级结核病防治机构收集3次固体培养和Xpert检测成本数据,2个省参比实验室收集3次对硝基苯甲酸（PNB）菌群鉴定和比例法利福平药敏试验成本数据。采用要素法计算每种方法单位检测成本,计算每例患者不同检测方法的检测成本。在不同结核病患病率人群中,以固体培养试验为金标准,比较Xpert检测在不同检测效能下检出1例结核病患者的成本。在不同利福平耐药率的可疑人群中,以传统药敏试验为金标准,比较Xpert检测在不同检测效能下检出1例利福平耐药结核病患者的成本。调整Xpert检测设备和试剂价格后,分析Xpert检测的单位成本。 结果 固体培养、菌群鉴定、利福平药敏试验和Xpert检测的单位检测成本分别为47.87、46.73、82.86和118.62元。传统方法检测每例结核病患者所需成本（2份培养,1份传代,1份PNB鉴定试验）为172.57元。传统方法检测每例耐药结核病患者的平均成本（2份固体培养,1份传代,1份PNB鉴定及药敏试验）为208.84元。当Xpert检测结核病或利福平耐药特异度为85%时,如果检测敏感度大于70%,在结核病患病率或利福平耐药结核病患病率1%～70%的任何人群中,Xpert检出1例结核病或利福平耐药结核病患者的成本均低于传统方法。试剂价格变化对于检测成本的影响远远大于设备价格变化的影响。 结论Xpert检测是一种比传统方法更经济并快速的检测方法,适合在中国基层实验室推广。     

变性高效液相色谱法检测结核分枝杆菌利福平耐药基因突变的初步探索

目的 探讨变性高效液相色谱(DHPLC)技术在MTB的利福平耐药菌株rpoB基因突变检测中的应用价值.方法 PCR扩增MTB的rpoB基因利福平耐药决定区,扩增产物与野生型DNA链形成异源双链,在65.4℃柱温下进行DHPLC分析.对DHPLC不同峰型菌株的rpoB基因片段进行测序,评价DHPLC技术的敏感度和特异度.结果 共分析46株MTB菌株,其中42株对利福平耐药,4株对利福平敏感.经DHPLC分析,产生15种不同图谱.测序结果表明,各图谱菌株突变特征不同.除D108和D24菌株的DHPLC峰形相同而突变特征不同外,其他菌株均为DHPLC峰型与基因多态性相一致,即DHPLC峰型相同则基因多态性相同,DHPLC峰型不同则基因多态性不同.结论 DHPLC具有简便快捷、高通量和自动化的特点,敏感度和特异度高,可用于快速检测耐药MTB的基因突变.     

套式PCR及测序方法用于痰标本中结核分枝杆菌rpoB耐药基因突变检测

目的应用套式PCR—DNA测序方法直接检测痰标本中结核分枝杆菌相关的rpoB基因突变，以期建立一种直接检测分枝杆菌耐利福平的快速方法，并评价其临床应用价值。方法采用套武PCR—DNA测序方法直接检测112例活动性肺结核患者和20例非结核性肺部疾病患者痰、标本中结核分枝杆菌rpoB基因突变情况。同份痰标本同时做涂片抗酸染色，罗氏培养及菌型鉴定。结果112例活动性肺结核患者痰标本套式PCR扩增87例呈阳性，产物DNA测序31例有rpoB基因突变。其中分离出耐利福平株的32例痰中29例发生了基因突变，耐药突变率90．6％（29／32），39例菌阴（涂阴培阴）痰中有2例发生突变。分离出对利福平敏感株的37例痰中未发生突变，20例非结核性肺部疾病患者痰标本套式PCR扩增均为阴性，特异性100％。结论套式PCR—DNA测序可望为直接检测临床痰标本中结核分枝杆菌耐利福平的准确、特异、快速的方法。     

中国耐利福平结核分支杆菌rpoB基因突变特点

目的 为了阐明中国结核分支杆菌耐利福平析rpoB基因突变特点。方法 对242株结核分支杆菌临床分离包括rpoB基因核心区域81个碱基在内的588个碱基进行序列测定,其中耐利福平株193株,利福平敏感株46株,人工诱导的耐利福平株3株。结果 89．1％（172．193）的临床分离耐药株存在rpoB基因突变,而46株敏感株无突变。531位氨基酸突变率为46．1％;526位氨基酸突变率为17．1％;联合突变发生率为12．4％;还有4株细菌发生同义突变;未检测到发生缺失或插入突变的菌株。高耐药组（耐250μg/ml利福平）531位氨基酸的突变率显著高于低耐药组（耐50μg/ml利福平）,P＜0．05。结论 中国结核分支杆菌耐利福平株的rpoB基因突变的发生率约为90％,其中最常见的突变位点是531位丝氨酸和526位组氨酸,两者突变率之和约为63％;利福平高耐药组531位氨基酸发生突变的几率高于低耐药组;受度蓖株未发现搬运入或缺失突变;DNA序列分析对临床用药有指导意义。     

巢式实时荧光定量聚合酶链反应检测结核分枝杆菌DNA的临床应用

目的探讨巢式实时荧光定量PCR（QNRT-PCR）检测结核分枝杆菌（MTB）DNA的临床价值。方法应用SYBR Green I建立检测结核分枝杆菌MTP64基因的QNRT—PCR方法,分别检测24份肺结核患者痰液,27份结核性胸膜炎患者胸水,以及对照组75份痰液和胸水的MTBDNA含量。结果以培养为金标准,QNRT—PCR敏感性、特异性、阳性预测值（PPV）、阴性预测值（NPV）分别为95．83％、61．54％、69．70％和94．12％,结核性胸膜炎的阳性率为70．37％。三种PCR方法阳性率比较,差异具有统计学意义（P〈0．05）,QNRT—PCR与实时荧光定量PCR拷贝数配对检验差异没有统计学意义（P〉0．05）,QNRT—PCR与实时荧光定量PCR的Cr值配对检验差异具有统计学意义（P〈0．01）。结论QNRT—PCR方法可检测痰液和胸水MTB DNA,对含微量MTB DNA样本的高敏感性在结核病的早期诊断中有重要参考价值。     

用DNA 芯片快速检测结核分支杆菌对利福平的耐药性

目的：研制一种新型DNA芯片,用于结核分支杆菌对利福平的耐药性快速检测,方法：根据结核分支杆菌rpoB基因的序列信息设计探针并制作DNA芯片,PCR扩增并荧光标记包含结核分支杆菌rpoB基因突变热点的目的片段,与芯片杂交,同时以DNA测序法为对照,结果：17株随机抽取的耐利福平结核分支杆菌菌株有14株可用DNA芯片检测出来,效率可达83％,患者痰液中少量的DNA足够进行芯片检测,无须进行培养。结论：用DNA芯片来检测结核分支杆菌对利福平的耐药性具有较高的特异性和灵敏度,该法快速,精确,可以应用于临床耐药性检测。     

高通量测定技术检测结核分枝杆菌耐利福平的研究

目的 基于焦磷酸测序(pyrosequencing)技术，建立耐利福平结核分枝杆菌快速检测方法，并探讨其临床应用价值。方法 设计一对聚合酶链反应(PCR)引物，其中一引物经生物素化修饰，PCR扩增含耐药决定区一297bp长的rpoB基因片段，借用链亲和素包被磁珠纯化单链PCR产物。设计2个正向测序引物，运用pyrosequencing技术对耐药决定区进行序列测定。通过对一系列10倍稀释的结核分枝杆菌H37Rv标准株DNA进行分析，评价所建立方法的检测敏感性。通过对已知耐药表型的结核分枝杆菌临床分离株进行分析，评价所建立方法的检测特异性。结果：PCR扩增后，可在2h内得到耐药决定区序列。所建立方法的检测灵敏度为50fg DNA／反应。在所分析的利福平敏感株中均未检测到耐药决定区突变，而在耐利福平菌株中均检测到耐药决定区突变。结论 所建立的方法具有自动化程度高和结果准确等特点，适用于对耐利福平结核分枝杆菌进行快速高通量检测。     

应用反向斑点杂交法检测耐利福平结核分支杆菌rpoB基因突变

目的　探讨快速检测rpoB基因突变的敏感方法 ,以期建立适合我国国情的结核分支杆菌耐药株的快速检测手段。方法　根据结核分支杆菌野生株序列 ,自行设计覆盖rpoB基因核心突变区的系列寡核苷酸探针并将其固定在尼龙膜上 ,然后应用生物素标记的特异性引物扩增包含核心突变区的rpoB基因片段 ,与固定在膜上的寡核苷酸探针杂交 ,对突变位点进行快速检测 ,并与药敏试验及DNA测序结果进行比较。结果　应用反向斑点杂交法检测 36株耐药株和 2 2株敏感株rpoB基因的突变位点 ,并据此判断其对利福平的药敏特性 ,结果敏感性为 88.9% ,特异性为 86 .4 % ,药敏结果符合率为 87.9% ,与测序结果的符合率为 89.7%。结论　反向斑点杂交法可以快速、敏感地检测rpoB基因突变 ,进而早期判断结核分支杆菌对利福平的药敏特性。     

逆向点杂交方法检测耐利福平结核分支杆菌rpoB基因突变

目的 建立一种灵敏、特异、快速检测结核分支杆菌耐药相关基因突变的方法，用于临床对利福平耐药的快速诊断。方法 将14条特异性探针固定在尼龙膜上，通过在下游引物标记生物素的方法得到生物素标记的结核分支杆菌DNA PCR扩增产物，与固定在尼龙膜上的特异性探针杂交，杂交物通过链酶亲和素标记辣根过氧化物酶及底物（四甲基联苯胺）显色判定结果。将杂交结果与基因测序结果及药敏试验结果进行对比分析。结果 采用逆向点杂交法共检测23株耐利福平及11株敏感型菌株，与药敏试验结果、测序结果符合率分别为28／34和30／34。所发现突变类型依次为：第531位突变11株，第526位突变7株，第533位突变3株。未检测到第516位、第513位碱基突变。结论 该方法可用于临床结核分支杆菌对利福平耐药性的快速检测。     

噬菌体生物扩增法快速测定结核分枝杆菌利福平耐药性

目的　建立快速测定结核分枝杆菌利福平耐药性的噬菌体生物扩增法 ,并探讨其在结核分枝杆菌利福平耐药性测定中的应用价值。方法　应用噬菌体生物扩增法测定 5 2 4株结核分枝杆菌利福平耐药性 ,并与绝对浓度法结果进行比较 ,对不符合的菌株采用BactecMGIT 96 0测定其最低抑菌浓度 (MIC)。结果　噬菌体法测定 5 2 4株结核分枝杆菌临床分离株利福平敏感 30 1株、耐药 2 2 3株 ,绝对浓度法敏感 313株、耐药 2 11株 ;两法测定均为敏感 2 88株、均为耐药 198株。在 38株噬菌体法与绝对浓度法测定结果不符的菌株中 ,35株噬菌体法与MIC测定结果相符合。如以绝对浓度法药敏结果为判断标准 ,则噬菌体法测定利福平耐药性的敏感性为 93 8%、特异性为 92 0 %、阳性预测值为88 8%、阴性预测值为 95 7%、准确性为 92 7%。结论　噬菌体生物扩增法测定利福平耐药性只需 2天时间 ,操作简便 ,不需特殊仪器设备 ,可作为结核分枝杆菌利福平耐药性的快速筛选方法。     

PhaB和BacT-ALERT检测结核杆菌药物敏感性的比较研究

目的分析和评价3种结核杆菌（MTB）药物敏感性测定方法,建立适合临床应用和疾病控制的快速、简便、低成本的MTB耐药性检测方法。方法应用绝对浓度法、噬菌体生物扩增法（PhaB）和BacT-ALERT快速培养系统检测183株MTB临床分离株对异烟肼（INH）、链霉素（SM）、乙氨丁醇（EMB）和利福平（RFP）的耐药性,比较检测结果的符合率、敏感性、特异性和准确性。结果以国内公认的绝对浓度法检测结果为判断标准,PhaB法检测对4种药物耐药性结果的敏感性、特异性和准确性分别为INH：94.1%、88.6%和89.1%,SM：97.3%、97.3%和96.2%,EMB：100.0%、94.4%和96.6%,RFP：97.6%、97.9%和97.8%;BacT-ALERT快速培养系统检测4种药物耐药性结果的敏感性、特异性和准确性分别为INH：100.0%、97.0%和97.8%,SM：91.9%、94.5%和94.0%,EMB：100.0%、99.4%和99.5%,RFP：88.1%、93.6%和92.3%。结论PhaB法和BacT-ALERT快速培养系统检测MTB耐药性具有较高的敏感性、特异性和准确性,与我国常用的耐药性检测方法相比具有很高的符合率。尤其是PhaB法试验周期短、低成本、无需特殊仪器设备,可作为基层单位MTB耐药性快速测定的筛选方法。BacT-ALERT法准确、快速、操作简便,适合于专科医院批量MTB耐药性快速检测。     

耐药结核分枝杆菌快速检测方法的研究进展

传统的耐药结核分枝杆菌的诊断依赖药物敏感试验.近年来,随着技术的进步,出现了大量的先进检测手段,在敏感性、特异性、检测周期方面皆优于传统方法.基于核酸扩增的分子生物学技术为临床耐药结核分枝杆菌的快速检测打开了一个广阔的前景.在自动测序分析的帮助下,耐药结核的确诊越来越简便、准确,对结核菌基因中耐药突变位点的快速检测还能够为临床诊疗提供早期的帮助信息,甚至能识别潜在的感染.本文对目前已有的快速检测方法的研究进展进行综述.