小鼠Mu/Hb感染模型的建立

采用细菌混合胃膜素(mucin,Mu)、血红蛋白(Hemoglubin,Hb)感染小鼠,建立小鼠Mu/Hb感染模型,并在此模型中评价了内毒素核心精脂单克隆抗体(3H_42F_7、2D_6E_7)抗S.minnesota野生菌的保护效果。Mu和Hb本身对小鼠无致病作用,然而与攻击菌混合感染小鼠,能显著增强攻击菌毒力,降低攻击菌的半数致死剂量(LD_(50),在本次实验中使S.minnesoat野生茵LD_(50)降低了2000倍。在该模型中,3H_42F_7抗体表现良好抗S.minnesota野生菌感染的作用,且呈剂量依赖性;2D_6E_7抗体未显示有明显保护性(P>0.01),提示Mu/Hb感染模型适用于评价内毒素核心糖脂抗体抗革兰氏阴性菌感染作用。     

分泌抗B型肉毒毒素单克隆抗体的产生与特性鉴定

以B型肉毒类毒素免疫BALB/C小鼠,取脾细胞与NS-1骨髓瘤细胞进行细胞融合。用ELISA方法筛选有杂交细胞生长孔的上清液,其中有66.7％的孔可分泌肉毒毒素特异性抗体。用有限稀释法进行克隆化培养后,获得4株稳定的杂交瘤细胞系(3B10、3B11、3G12和4A5),在体外培养中均持续分泌抗体,培养液抗体效价达10~(-3)～10~(-5);注入BALB/C小鼠腹腔制备出富含抗体的腹水,抗体效价达10~(-6)～10~(-8)。经用A型和B型类毒素作特异性鉴定,表明抗体3G12及4A5与A型无交叉反应,为B型特异性的。抗体3B10及3B11与A型有弱交叉反应。Ig种类鉴定表明抗体3B10及3G12为IgG_1;抗体3B11及4A5为IgG_2。染色体检查证明4株细胞均为杂交瘤细胞。小白鼠体内进行中和保护力测定表明4种单克隆抗体对肉毒毒素均无保护作用。     

产毒大肠杆菌不耐热肠毒素单克隆抗体杂交瘤细胞系的建立及初步应用

用亲和层析纯化的产毒大肠杆菌(ETEC)不耐热肠毒素(LT)免疫BALB/C小鼠,将小鼠脾细胞与SP_(2/0)骨髓瘤细胞(1:8)在PEG(MW1000)作用下融合,采用ELISA筛选抗-LT抗体阳性孔,细胞融合率为50％,抗体阳性率为4.5％,经3～5次克隆后筛选出2株分泌抗-LT杂交瘤细胞株(2D_、2E_5),用ELISA测定杂交瘤细胞培养上清及腹水的效价,后者约为前者的100倍,高达90万～110万。通过平板免疫溶血试验和ELISA双抗夹心法分别对2株杂交瘤分泌的抗LT单克隆抗体(McAb)的特异性进行了试验,结果表     

登革1型病毒的单克隆抗体

我们用SP2/0-Ag14小鼠骨髓瘤细胞与用登革1型病毒免疫的BALB/C小鼠脾细胞在融合剂PEG-1000的诱导下进行融合,获得了15株产生抗登革1型病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞系。其中14株属登革病毒型特异,1株属登革病毒亚群特异,它们的荧光效价均在10,240以上。15株杂交瘤均无血凝活性,3株有补体结合活性。1D_4,1B_9的IgG亚类为IgG_1,1F_(11)为IgG_2a,轻链均为K型。1株杂交瘤(1D_4)的染色体数为87～115。用SDS-PAGE测定1D_4分子量,重链为54,000,轻链为24,000。15株杂交瘤连续传代3～6个月,冻存复苏后抗体水平未见下降。     

抗TNF-α单抗对内毒素血症家兔氧利用率影响的实验研究

目的 :观察抗TNF -α单抗对内毒素血症家兔氧利用率的影响。方法 :2 8只家兔随机分为对照组、内毒素组、抗体保护组和无关抗体组。内毒素组给予亚致死剂量内毒素重复静脉注射复制内毒素血症动物模型 ,对照组注射等量生理盐水。抗体保护组在每次内毒素注射前预先静脉注射抗TNF -α单抗 ;无关抗体组预先注射抗IL - 2单抗。使用电磁血流量计和血气分析仪测量并计算氧利用参数。结果 :内毒素组临界氧运输量 (DO2 crit)、临界氧耗量 (VO2 crit)显著高于对照组 (P <0 .0 5) ;临界氧提取率 (ERcritO2 )显著低于对照组 (P <0 .0 1 )。抗体保护组DO2 crit、VO2 crit和ERcritO2 与对照组无显著差别 ;无关抗体组上述指标变化与内毒素组相类似。结论 :抗TNF -α单抗可以明显改善内毒素血症所致的氧利用功能障碍。     

产生抗单纯疱疹病毒单克隆抗体杂交瘤细胞系的建立

用HSV-1 SM44株免疫C×S/1小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞系Sp2/O融合,经HAT选择培养,细胞融合率为100％。ELISA筛选后获得53孔产生抗HSV抗体的杂交瘤阳性孔。对1A12,2A8,1G8,1D10,2C5 5株细胞系用有限稀释法做2～5次克隆化,阳性克隆率均达到100％。杂交瘤细胞系经连续传代培养4个月,仍能稳定产生单克隆抗体,冻存的细胞系经复苏后亦能稳定产生抗体。应用ELISA及IF试验证明,5种单克隆抗体均与HSV-1和HSV-2标准株呈特异性反应。ELISA测定,杂交瘤培养上清抗体效价为10~(-2)～10~(-3),制备免疫腹水效价为10~(-4)～10~(-7)。5种单克隆抗体与EBV,CMV,JEV和HFRSV无交叉反应。     

抗T-2毒素单克隆抗体的制备及特性

目的 :建立敏感、特异和快速的针对T 2毒素的ELISA检测方法 ,形成具有我国自主知识产权的快速检测试剂盒。方法 :利用B细胞杂交瘤技术 ,建立抗T 2毒素的单克隆杂交瘤细胞株。结果 :用T 2 羊免疫球蛋白 (T 2 GIgG)偶联物免疫 8～ 10周龄雌性BALB/c小鼠后 ,取脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞系Sp2 /0融合 ,经过 3～ 4次亚克隆建立了 2个稳定分泌抗T 2毒素抗体的杂交瘤细胞株 ,分别命名为 2A7和 6E4。将上述 2株杂交瘤细胞分别注入BALB/c小鼠腹腔 ,获得含抗T 2毒素单克隆抗体的腹水 ,并将腹水用饱和硫酸铵法进行纯化 ,得到 2A7和 6E4单克隆抗体。两株单克隆抗体的Ig亚类为IgG1,腹水中抗体的滴度分别为 6 .4× 10 6和 1.1× 10 7,参考工作浓度分别为1.0× 10 6和 3.2× 10 6。纯化后 2A7抗体的IgG含量为 16 .4g/L ,亲和常数为 8× 10 -8mol/L。 2A7抗体与其他结构类似物无交叉反应 ,具有较高的特异性。结论 :制备了具有高特异性和亲和力的抗T 2毒素单克隆抗体 ,初步建立了针对T 2毒素的ELISA检测方法。     

细菌性阴道病阴道菌群失调与局部sIgA含量的关系

目的　探讨细菌性阴道病 (BV)发生阴道菌群失调的同时 ,局部粘膜表面免疫球蛋白 (s Ig A)水平和疾病预后的关系。　方法　用各种目的培养基对阴道菌群进行检测 ,同时采用 EL SA法测定 s Ig A浓度。　结果　正常对照组 s Ig A水平(2 4 0 .38± 137.0 2 ) m g/ L与文献报道的正常值一致 ,32例阴道菌群失调 BV患者治疗前 s Ig A为 (6 4 5 .35± 175 .93) mg/ L ,治疗后阴道菌群恢复正常 ,局部 s Ig A (35 2 .6 5± 182 .5 ) m g/ L与正常对照组无显著差异。　结论　本研究表明 BV患者 s Ig A水平是疾病治疗、转归的重要指标。     

森林脑炎病毒单克隆抗体的制备与鉴定

用森林脑炎病毒森张株免疫的BALB/c小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞在融合剂PEG-1000的作用下进行融合,用间接免疫荧光法筛选,获得了6株分泌抗森林脑炎病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株.通过免疫荧光交叉鉴定,6份单克隆抗体均与黄病毒属的登革4型病毒、流行性乙型脑炎病毒无属间交叉.与森林脑炎病毒COφ株、国内的森候株、森董株有交叉反应,属森林脑炎病毒种特异.6份单克隆抗体均无血凝抑制活性和补体结合活性.3株杂交瘤细胞培养上清浓缩物经抗鼠Ig免疫血清双扩鉴定为IgM.染色体数的检查为89～110条.6株杂交瘤细胞连续传代3～6个月,冻存复苏后仍能稳定地分泌特异的单克隆抗体.     

抗A型肉毒毒素鼠源性单克隆抗体的制备和鉴定

目的：制备与鉴定抗A型肉毒神经毒素重链C端（ heavy chain of botulinum neurotoxin serotype A, BoNT／AHc）特异性鼠单克隆抗体。方法通过纯化BoNT／AHc抗原、免疫BALB／c小鼠并建立杂交瘤细胞以制备鼠单抗,用ELISA、Western印迹实验和抗体分型试剂盒进行分析鉴定,并通过ELISA检测鼠单抗与BoNT／AHc突变体结合,初步鉴定其在BoNT／AHc的结合表位。结果得到纯度较高的BoNT／AHc抗原,制备了4株特异性鼠单抗1A4、3H3、3H7、5H8。间接ELISA结果显示,单抗细胞上清效价均＞3．0×103;Western印迹检测结果显示,单抗均能与BoNT／AHc特异性结合;抗体亚型鉴定结果为1A4、3H7属于IgG1（Κ）,3H3属于IgM（Κ）,而5H8属于IgG2b （Κ）;叠加ELISA实验表明,4株单抗抗原识别表位相近;用ELISA检测单抗与BoNT／AHc突变体结合实验结果初步确定了4株单抗与BoNT／AHc的结合表位。结论对抗A型肉毒毒素鼠源性抗体完成了制备和鉴定,为肉毒毒素中和抗体的开发与阐明中和抗体的表位奠定了基础。     

抗-HIV单克隆抗体的筛选与鉴定

我们用HIV抗体阳性者血浆包被聚苯乙烯条,加入纯化的HIV组织培养抗原,通过夹心ELISA法,筛选出3株能分泌抗HIV单克隆抗体杂交瘤细胞,传代稳定。培养上清经Western blot染色鉴定含有抗-HIV gag蛋白。夹心ELISA法测得杂交瘤细胞培养上清中单克隆抗体滴度达到1∶6400,接种BALB/C小鼠获腹水抗体效价为1∶2430000。实验表明,用此单克隆抗体检测HIV病人血清抗体敏感、特异、稳定、重复性好,是一种良好的试剂。     

抗人IgK和Igλ链单克隆抗体的制备及临床初步应用

用初乳和血清IgA免疫Balb/c小鼠的脾细胞与SP_2/O和NS-1瘤细胞融合,以ELISA双抗原夹心法检测获得5株杂交瘤细胞。其中3株(1D1、5C3、11A7)分泌抗人游离和结合型λ轻链;2株(4G12、14A6)分泌抗人游离和结合型K轻链。4G12与结合型K链反应比游离K链好。这些细胞株在长达1年的培养中仍能稳定分泌特异性单克隆抗体,经液氮冻存10个月后杂交瘤细胞仍保持原有的特性。用固相抗原竞争ELISA试验表明,两个抗K链McAb是针对不同的抗原位点,而3株抗λ链则针对相同的抗原位点。用于检测副蛋白和本周氏蛋白具有很好的特异性和敏感性。把McAb4G12-HRP和1D1-HRP混合,用于检测-EB病毒早期抗原(EA)和壳抗原(VCA)抗体被证明是满意的,同时试用于抗核抗体的检测也获得了初步的结果。     

抗HBsAg单克隆抗体杂交瘤的建立与临床应用

目的 制备分泌抗HBsAg单克隆抗体杂交瘤细胞株,为建立快速诊断HBsAg的方法奠定了基础。方法 通过细胞融合建立了能稳定分泌抗HBsAg单抗的杂交瘤细胞株,利用ELISA测定单抗的特异性,并用此单抗对临床标本进行初步检测。结果 细胞株分泌的单抗可与HBsAg特异性结合,与乙肝病毒E抗原和核心抗原无交叉反应,经免疫扩散试验分析为IgG1型,将此单抗用辣根过氧化物标记后可与HBsAg阳性的病人血清反应。结论 筛选出了一株适合临床应用的单抗杂交瘤细胞株。     

纤维连接蛋白降解片段（MAD2）单抗的制备及肝细胞癌患者血浆含量检测

应用杂交瘤技术制备了纤维连接蛋白（FN）降解片段MAD2的单克隆抗体（McAb)；建立了ＭＡＤ２检测的双抗体夹心ＥＬＩＳＡ法；对２２７例肝细胞癌（ＨＣＣ）、７６例肝转移癌（ＨＭＣ）、９８例消化道癌（ＡＣＣ）、１５６例慢性肝病（ＣＬＤ）患者和４８例健康人体血浆ＭＡＤ２含量进行测定。结果显示，制备的ＭＡＤ２ ＭcAb属ＩgG1，与ＦＮ无交叉反应；ＨＣＣ组血浆ＭＡＤ２含量均值与ＣＬＤ组、ＨＭＣ组、ＡＣＣ组和正常对照组比较差异有显著性意义（分别Ｐ＜0.01）,以HCC患者的最低MAD2值作临界值时，仅13.5%CLD、6.6%HMC和4.1?C超过此值，而健康人体血浆MAD2含量均低于临界值；65例血清AFP正常的HCC患者其血浆平均MAD2值仍明显高于非HCC肿瘤、CLD患者和正常对照。结合以前的结果，进一步表明，血浆MAD2检测可作为HCC诊断的新标志物，并可与AFP相互补充；ＭＡＤ２ ＭcAb的制备使MAD2的检测变得易行。     

Complementary roles of antibody affinity and specificity for in vivo diagnostic cardiovascular targeting: How specific is antimyosin for irreversible myocardial damage?

BACKGROUND: Identification of irreversible myocyte injury with antimyosin antibody imaging depends on both antibody specificity and affinity. To characterize the role of antibody affinity, we performed studies in dogs with acute coronary occlusion followed by reperfusion using 3 monoclonal antimyosin antibodies with different affinities. METHODS AND RESULTS: Dogs with experimental reperfused acute myocardial infarction were injected with 2 high-affinity radiolabeled monoclonal antimyosin Fab fragments (R11D10 and 2G42D7), 1 low-affinity antimyosin Fab (3H31E6), and a nonspecific Fab. The left lateral gamma images at 5 H were used to assess the infarct (I) to blood (B) region of interest (ROI) count density ratios by computer planimetry. All infarcts were confirmed by in vivo imaging with 201Tl for perfusion defects as well as by postmortem histochemical staining. The mean I/B ROI (+/-standard deviation [SD]) for R11D10 (1.701+/-0.376) was not significantly different from that of 2G42D7 (1.501+/-0.267, P = NS), but both were significantly greater than that of 3H31E6 Fab (0.85+/-0.12, P = .0001 and .0012, respectively). The I/B ROI of 3H31E6 Fab was similar to that of nonspecific Fab (0.75 to 0.77 range). Radiolabeled R11D10 and 2G42D7 were unequivocally positive by gamma imaging in all infarcts by 5 H. No infarcts were visualized with 3H31E6 or nonspecific Fab. CONCLUSIONS: The low-affinity antibody, despite its specificity for cardiac myosin, cannot be used to image the infarct zone. Therefore immunoscintigraphic diagnosis of irreversible myocardial injury with radiolabeled antimyosin Fab is doubly specific because in vivo visualization required both specificity and high enough affinity of the antibody.     

抗大鼠HSP70蛋白单克隆抗体的制备及特性研究

目的制备大鼠HSP70蛋白单克隆抗体并对其性质进行研究。方法利用PCR技术扩增大鼠全长hsp70,插入表达质粒pET-28a,pMAL-c2x,诱导表达,采用亲和层析纯化融合蛋白;用HIS-HSP70融合蛋白免疫BALB/c小鼠,杂交瘤技术制备大鼠HSP70单克隆抗体;采用Western印迹和免疫组化方法对抗体性质进行鉴定,ELISA方法确定抗体的表型。结果亲和层析纯化HIS-HSP70蛋白纯度在97.6%,获得6株可稳定分泌抗HSP70mAb的杂交瘤细胞系;抗体的亚类均是IgG1类κ链的。Western印迹结果显示6株单抗均能识别天然的大鼠HSP70蛋白;免疫组化结果显示3株抗体可以识别组织的HSP70蛋白。结论成功获得6株有活性HSP70单克隆抗体,可以识别HSP70蛋白不同表位,为进一步研究HSP70单克隆抗体在疾病中的作用奠定基础。     

CD9类单克隆抗体的研制

本研究用血小板作为免疫原,免疫Balb/C小鼠,并按常规方法进行细胞融合.在筛选时,用血小板、幼稚B细胞(Nalm-6)及EB病毒转化后的人B淋巴母细胞系Raji细胞同时检测杂交瘤细胞上清,仅选与血小板及Nalm-6细胞反应,不与Raji细胞反应的抗体分泌杂交瘤细胞,建立了B9-1、B9-2、B9-3杂交瘤株.根据B9系列抗体与各种血液、造血细胞的反应特点,对通过对肾小球血管内皮及远端曲管上皮反应性及对其相应抗原分子量测定表明,B9系列抗体为CD9类抗体.本系列抗体与某些白血病细胞反应结果表明,与CD10类抗体配伍,可能形成更有效的针对普通型急性淋巴细胞白血病的导向药物.对B9系列抗体在血小板及白血病免疫分型中的研究前景也作了简要讨论.     

利用DNA免疫建立分泌登革2型病毒E蛋白单抗的杂交瘤细胞系

目的:利用DNA免疫建立分泌登革2型病毒E蛋白特异单抗的杂交瘤细胞系,为研究E蛋白的结构和功能及其抗原表位提供新手段.方法:以构建的病毒全长prM-E基因的真核重组质粒DNA作为免疫原,免疫BALB/c小鼠后将其脾细胞和SP2/0瘤细胞融合,通过IFA、间接ELISA和空斑减少中和试验对杂交瘤细胞系进行筛选和鉴定.结果:获得了4株分泌登革2型病毒E蛋白单抗的杂交瘤细胞系(2B4,6B4,4C10和2D5),它们结合的抗原表位均位于E蛋白Ⅲ区,其中4C10对登革2型病毒具有中和活性.这些单抗与登革1、3和4型病毒有强的交叉反应,但与黄病毒其他成员反应较弱.结论:DNA免疫法可用于分泌登革2型病毒E蛋白特异单抗的杂交瘤细胞系的建立,该结果有利于登革病毒E蛋白特异抗原表位的研究及新的登革病毒诊断试剂的研制.