siArid2重组腺病毒载体的构建及其对肝癌细胞增殖的影响

目的:通过RNA干扰技术沉默内源性抑癌基因Arid2(siArid2)的表达,观察其对肝癌细胞生长及细胞周期的影响。方法:设计3对特异性沉默Arid2基因的shRNA序列,分别克隆到腺病毒骨架载体上形成重组腺病毒质粒。将质粒转染到HEK293细胞中,包装和扩增形成完整高滴度的重组腺病毒AdsiArid2-1~3。用构建好的腺病毒感染人肝癌SMMC-7721细胞,Westernblotting方法检测Arid2蛋白的表达,筛选干扰效果最佳的重组腺病毒。MTS技术和流式细胞术观察干扰Arid2基因后肝癌细胞增殖和细胞周期的变化。结果:成功构建了高滴度的重组腺病毒AdsiArid2-1~3。经Westernblotting鉴定,AdsiArid2-3为抑制效果最佳的重组腺病毒。MTS结果显示,AdsiArid2组细胞在72h、96h的吸光度值与空细胞组和Adsicontrol组相比增高,细胞增殖速率明显加快。流式细胞术检测结果显示,AdsiArid2组处于G1期、S期的细胞百分比与空细胞组和Adsicontrol组相比,G1期细胞百分比明显减少,S期细胞百分比明显增多。结论:成功构建干扰Arid2的重组质粒及重组腺病毒。沉默Arid2可以促进肝癌细胞的增殖,促进其由G1期向S期的转换。     

Th17 differentiation is the default program for DPP2-deficient T-cell differentiation

Dipeptidyl peptidase 2 (DPP2) is an N‐terminal dipeptidase, required for maintaining lymphocytes in a resting state. Mutant mice with T‐cell‐specific knock‐down (kd) of DPP2 (lck‐DPP2 kd) were generated and analyzed for their phenotype. Normal thymocyte development and a modest increase in the proportions of peripheral T cells were observed in these mice compared with littermate controls. Interestingly, the peripheral T cells were hyperactive upon TCR stimulation in vitro, although they did not express any activation markers. Furthermore, CD3‐crosslinking in the naïve CD4⁺ and CD8⁺ T cells of lck‐DPP2 kd mice resulted mainly in IL‐17 production. Similarly, the mutant T cells secreted primarily IL‐17 after in vivo priming and in vitro antigen‐specific restimulation. These data suggest that IL‐17 production is the default program for T‐cell differentiation in the absence of DPP2. Thus, DPP2 seems to impose a threshold for quiescent T cells, preventing them from drifting into cell cycle.     

RNA干扰同源盒A10表达对K562细胞增殖及凋亡的影响

目的 通过构建靶向同源盒A10(HOXA10)的真核表达载体,探讨利用RNA干扰沉默HOXA10基因对人慢性髓系白血病细胞株K562增殖和凋亡的影响.方法 根据筛选的针对HOXA10的特异性有效小干扰RNA(siRNA)序列设计合成短发夹RNA(shRNA)寡核苷酸链,构建pGPHI-GFP-Neo-HOXA10真核表达载体并测序,应用阳离子脂质体转染K562细胞.实验分为细胞对照组(仅加等量细胞及培养基),阴性对照组(脂质体转染阴性对照质粒)、实验组(脂质体转染pGPHI-GFP-Neo-HOXA10).转染载体24 h后利用RT-PCR检测各组HOXA10 mRNA表达;转染载体24、48、72 h后应用MTT法检测各组细胞增殖并计算细胞抑制率;转染载体48 h后应用流式细胞术检测各组细胞凋亡.结果 成功构建pGPHI-GFP-Neo-HOXA10载体并转染K562细胞.与细胞对照组和阴性对照组比较,实验组转染载体能有效降低HOXA10 mRNA的表达水平[(38.86±4.49)％比(88.52±9.24)％、(86.75±7.38)％,P＜0.05],而阴性对照组与细胞对照组比较差异则无统计学意义(P＞0.05).与阴性对照组比较,实验组载体作用于K562细胞24、48、72 h后,细胞增殖能力均明显下降,细胞抑制率明显升高[(39.92±0.74)％比(7.98±5.52)％;(55.62±1.18)％比(8.27±3.45)％;(66.30±1.26)％比(8.63±3.58)％;均P＜0.05].实验组细胞凋亡率较细胞对照组、阴性对照组也显著升高[(22.29±1.67)％比(9.82±0.69)％、(10.14±0.96)％,P＜0.05],而阴性对照组与细胞对照组比较差异则没有统计学意义(P＞0.05).结论 构建的真核表达载体pGPHI-GFP-Neo-HOXA10可有效沉默K562细胞中HOXA10基因的表达,能明显抑制K562细胞增殖并诱导其凋亡.     

野生型PTEN基因对卵巢癌细胞株的影响

目的：观察转入野生型PTEN基因的卵巢癌细胞生物学行为变化,探索该基因对卵巢癌细胞周期的影响和抑制肿瘤侵袭的机制。方法：将野生型PTEN基因的pcDNA3.1Hygro(-)真核质粒载体转染SKOV3细胞系,潮霉素筛选稳定表达细胞株并扩增培养;采用流式细胞术检测肿瘤细胞周期变化;用MTT法检测细胞抑制率。分别用RT-PCR检测转染前后PTENmRNA表达水平变化;采用重组基底膜侵袭模型,观察转染前后细胞侵袭力的变化。结果：成功转染SKOV3并稳定表达PTEN,转染PTEN可以明显改变SKOV3细胞周期,使其阻滞于S期;明显抑制肿瘤细胞的侵袭力。结论：提示转染外源野生型PTEN基因可使SKOV3细胞周期阻滞于S期,并且通过抑制肿瘤细胞侵袭与生长,而具有明显的抑癌作用。     

小鼠Sim2真核表达载体的构建及其对PC12细胞周期的影响

目的：构建小鼠Sim2（mSim2）真核表达载体,并观察其对PC12细胞周期的影响,以初步阐明Sim2基因在Down综合征发病机制中的作用。方法：以逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)法从新生小鼠大脑中扩增mSim2全长阅读开放框(ORF),定向克隆入真核表达载体pcDNA3中。以脂质体法瞬时转染PC12细胞;RT-PCR方法检测mSim2基因在PC12细胞的表达;流式细胞仪观察mSim2对细胞周期的影响。结果：DNA测序结果表明,mSim2成功克隆入真核表达载体pcDNA3中。RT-PCR结果显示,瞬时转染的PC12细胞中有明显的mSim2表达。流式细胞仪检测发现,转染mSim2后,处于G0/G1期的PC12细胞百分比明显升高（P<0.01）,而G2/M期百分比明显低于对照组和空载体组（P<0.01）。结论：Sim2基因可能通过抑制神经元前体细胞的增殖参与Down综合征的发生;Sim2真核表达载体的构建为进一步研究该基因的功能奠定了良好的基础。     

突变型Axin2对细胞增殖的影响及其机制的研究

目的Axin是新近发现的Wnt信号传导系统的抑癌基因，本文在体研究其羧基端缺失突变（mtAxin2）对细胞增殖的影响并探索其相关机制。方法采用pCMV-Flag—mtAxin2质粒瞬时转染293细胞，并用G418筛选稳定表达mtAxin2的细胞株；使用Dual—Luciferase报告检测系统检测Firefly和Renilla荧光酶活性，采用TrpanBlue染色方法检测细胞增值活性，用流式细胞仪检测mtAxin2对细胞周期的影响，应用Western blot方法检测mtAxin2对Wnt信号传导系统下游基因的影响，G0／1细胞同步化S期进入实验研究mtAxin2对细胞生长影响的机理。结果经G418筛选后在293细胞中获得的细胞株，westem blot检测可见明显的mtAxin2蛋白表达；Western blot和Dual—Luciferase报告检测系统显示在稳定表达mtAxin2的细胞株中β-catenin蛋白水平增加，TCF活性增高；通过Trypan Blue排除实验计数绘制细胞生长曲线，显示mtAxin2促进细胞的生长；流式细胞仪检测发现在稳定表达mtAxin2的细胞株中S期细胞的比例较高。Western blot结果显示在稳定表达mtAxin2的细胞株中β-catenin蛋白水平上升的同时，磷酸化的β-catenin蛋白水平却下降，下游基因产物CyclinDl和cdc2表达也增加；G0／G1期同步化细胞释放后12h流式细胞仪检测发现稳定表达mtAxin2的细胞株中S期细胞比例明显增加，为293细胞的2—3倍。结论Wnt信号传导系统在细胞生长中起重要作用，mtAxin2通过cyclinD1促进了细胞的增殖，发挥癌基因的作用。     

REGγ is a strong candidate for the regulation of cell cycle,proliferation and the invasion by poorly differentiated thyroid carcinoma cells

REGγ is a proteasome activator that facilitates the degradation of small peptides. Abnormally high expression of REGγ has been observed in thyroid carcinomas. The purpose of the present study was to explore the role of REGγ in poorly differentiated thyroid carcinoma (PDTC). For this purpose, small interfering RNA (siRNA) was introduced to down-regulate the level of REGγ in the PDTC cell line SW579. Down-regulation of REGγ at the mRNA and protein levels was confirmed by RT-PCR and Western blot analyses. FACS analysis revealed cell cycle arrest at the G₁/S transition, the MTT assay showed inhibition of cell proliferation, and the Transwell assay showed restricted cell invasion. Furthermore, the expression of the p21 protein was increased, the expression of proliferating cell nuclear antigen (PCNA) protein decreased, and the expression of the p27 protein was unchanged as shown by Western blot analyses. REGγ plays a critical role in the cell cycle, proliferation and invasion of SW579 cells. The alteration of p21 and PCNA proteins related to the down-regulation of REGγ suggests that p21 and PCNA participate in the process of REGγ regulation of cell cycle progression and cell proliferation. Thus, targeting REGγ has a therapeutic potential in the management of PDTC patients.     

Norrin在氧诱导的视网膜病变中的时空表达及其意义

目的：探讨视网膜新生血管疾病动物模型-氧诱导的视网膜病变（OIR）小鼠视网膜中Norrin的时空表达变化及意义。方法：荧光素灌注铺片观察OIR小鼠视网膜血管分布和形态。RT－PCR检测对照组P7、P10、P12、P17小鼠和OIRP7、P8、P12、P12.5、P13、P14、P15、P17、P19小鼠视网膜中Norrin、VEGFmRNA的表达。免疫组化法检测Norrin蛋白在视网膜中的表达和分布位置。结果：OIR小鼠P12时在视网膜后极部形成无灌注区,P17时有大量新生血管形成。NorrinmRNA在正常小鼠视网膜中表达水平低且稳定。缺氧12h后,NorrinmRNA有显著升高,缺氧1d到达高峰,然后缓慢下降,其变化趋势与VEGFmRNA一致。Norrin蛋白在正常小鼠各时点免疫组化均未能检出,在OIR模型中P15见弱表达,P17-P19表达明显增强。主要分布在视网膜外层,以内外节层、外丛状层为主。结论：Norrin在mRNA和蛋白水平都在缺氧视网膜中明显升高,主要分布在视网膜外层。Norrin很可能参与新生血管的形成,并起着重要的调控作用。     

流动剪切和不同流型对血管内皮细胞增殖的影响

动脉粥样硬化的非随机分布与局部的血流动力环境有关，而内皮细胞增殖引起的内皮层失稳与动脉粥样硬化早期发生过程有关。本文比较了不同大小的切应力对内皮细胞增殖的影响，发现切应力抑制细胞增殖并与切应力大小相关。同时构建了平行板式突然扩张流槽，探讨流型改变对细胞增殖的影响，发现扩张效应和流线偏转效应使得这种剪切抑制作用被减弱。     

体外培养人视网膜微血管内皮细胞屏障功能的研究

目的：研究原代培养的人视网膜微血管内皮细胞屏障功能。方法:对人视网膜微血管内皮细胞进行原代培养并鉴定,第4代细胞接种于Polyester(PET)膜上,不同时点对滤膜表面行显微镜观察,通过紧密连接相关蛋白occludin的表达,间接反映细胞之间紧密连接的形成,应用共聚焦免疫显微镜观察2、3、4周occludin表达的变化;跨膜电阻（TER）检测屏障的稳定性,并通过测量正常培养条件和5μg/L的血管内皮生长因子（VEGF）干预下辣根过氧化物酶(HRP)通透性的改变反映屏障特性。结果:成功培养了人视网膜微血管内皮细胞,纯度可达95.8%。细胞接种1周后融合为单层,接种后2、3、4周细胞密度无明显变化,细胞接触紧密,呈单层生长,可见occludin在细胞相邻边界规则的表达;occludin在2、3、4周,在细胞内的分布逐渐移向相邻细胞交界处;2周时视网膜微血管内皮细胞跨上皮细胞电阻达（120.62±3.97）Ω/cm2,2、3、4周差异无显著（P>0.05）;单层细胞的通透性检测结果显示,HRP从滤膜上方到达下方随时间延长呈线性增加,且在VEGF的干预下,各时点通透率明显增加（P<0.05）。结论:利用体外培养的人原代视网膜微血管内皮细胞建立单层细胞具有典型的屏障功能特性,可作为体外研究血视网膜内屏障的有用模型。     

notch1基因对人胶质瘤U251细胞增殖和周期的影响

目的：探讨notch1基因对人胶质瘤U251细胞增殖和周期的影响。方法:体外构建notch1-shRNA和pNL-NICD/EGFP慢病毒表达载体,采用RT-PCR和Westernblotting方法行notch1沉默和高表达notch1胞内段的效果检测,MTT法和PI单染流式细胞术分析notch1对细胞增殖和细胞周期的影响。结果：notch1-shRNA慢病毒表达载体能有效下调notch1表达,而pNL-NICD/EGFP慢病毒表达载体能有效增加NICD的表达。notch1基因表达下调的细胞其细胞增殖能力受到明显抑制(P<0.01),并引起细胞G1期阻滞(P<0.01),S期减少(P<0.01);在NICD表达增加的细胞其增殖能力明显增强(P<0.01),且引起细胞G1期减少(P<0.05),S期增加(P<0.01)。结论:notch1基因与人胶质瘤U251细胞的增殖能力和周期密切相关,有望成为治疗胶质瘤的靶点。     

肾上腺髓质素2对大鼠脑微血管内皮细胞增殖的影响

目的：研究肾上腺髓质素2（AM2）对大鼠脑微血管内皮细胞增殖的影响。方法：分离并培养SD大鼠脑微血管内皮细胞,经Ⅷ因子相关抗原的抗体鉴定和常规处理后,随机分为对照、AM2（10-7mol/L、10-8mol/L和10-9mol/L）、ADM、ADM+AM2、10%胎牛血清和10％胎牛血清＋AM210-7mol/L等8组,以［3H］-TdR掺入法测定MEC增殖反应。结果：10-7-10-9mol/L各浓度AM2、ADM以及AM2和ADM合用对于静止状态的脑微血管内皮细胞［3H］-TdR掺入与对照组比较均无明显差异（均P>0.05）。10%胎牛血清刺激组脑微血管内皮细胞［3H］-TdR掺入比对照组高87.5%（P<0.05）,10-7mol/LAM2抑制胎牛血清诱导的脑微血管内皮细胞［3H］-TdR掺入增加（P<0.05）。结论：AM2抑制血清诱导的脑微血管内皮细胞增殖。     

不同年龄组人视网膜微血管内皮细胞特性的研究(英文)

目的：研究2个不同年龄组供体来源的人视网膜微血管内皮细胞的特性。方法：分离培养2个不同年龄组的人视网膜微血管内皮细胞,分别为出生后30d内和40-65岁供体组。视网膜微血管内皮细胞具有特异性表达,通过免疫荧光染色CD31、vWF和乙酰化低密度脂蛋白(Dil-Ac-LDL)的摄取来定位内皮细胞的标记。通过使用matrigel基质胶培养细胞,激光共聚焦显微镜和Westernblotting分析vWF在细胞内的分布,评估2组细胞管状结构形成能力以及vWF在细胞内的不同分布。结果：从2个不同年龄组中成功地获得高纯度视网膜微血管内皮细胞。2组在种到基质胶后6h均能形成典型的二维管腔样结构,但婴幼儿组评分比成人组高（27.2％±2.2％）,且二维管腔样结构在30h仍可较好地维持,而成人组已看到部分自发降解。另外可见到vWF在婴幼儿组主要表达在细胞核内,而成人组主要表达在胞浆。结论：不同年龄来源的人视网膜血管内皮细胞具有某些自身特定的性状特征,在与年龄相关的疾病的体外研究中,供体年龄因素可能造成的影响应该得到一定的重视。     

灵芝对体外培养的微血管内皮细胞增殖和凋亡的影响

目的研究不同剂量灵芝对体外培养的大鼠肺微血管内皮细胞的增殖与凋亡的影响。方法在体外培养肺微血管内皮细胞中做细胞增殖曲线 ,用流式细胞仪分析细胞周期及细胞凋亡的变化。结果培养中加入灵芝 (2.75mg/ml)后第4d开始细胞增殖 ,第7d达高峰(与阴性对照比 )。流式细胞仪分析 ,各剂量组G2-M期细胞明显增多 (与阴性对照比 ) ,但细胞凋亡百分率无显著变化。结论灵芝能促进体外培养的肺微血管内皮细胞增殖作用 ,此作用对保护内皮损伤、加速内皮修复有重要作用     

视网膜母细胞瘤基因对人骨肉瘤细胞株OS732的影响

目的 观察外源性N端截短的视网膜母细胞瘤（Rb)基因对骨肉瘤细胞株OS732的生长和细胞间缝隙连接信息通讯能力的影响。方法 构建N端截短的长度为1.65kb Rb基因的真核表达质粒,并用DOTAP将其导入骨肉瘤细胞株OS732。应用逆转录－聚合酶链反应（RT－PCR）和Northern blot检测Rb基因的表达;用细胞计数,流式细胞仪分析和软琼脂克隆形成试验观察OS732细胞的生成状况;用半定量RT－PCR法和罗氏黄荧光传输法检测细胞间缝隙连接信息通讯的能力。结果 转染N端截短的Rb基因后,OS732细胞内可检测到内源性和外源性Rb基因的mRNA表达。OS732细胞的形态发生改变,其生长速度减慢,软琼脂形成集落能力降低,细胞周期阻滞于G0－G1期;缝隙连接蛋白基因Gonnexin43的表达和细胞信息通讯能力增强。结论 N端截短的Rb基因可抑制骨肉瘤细胞株OS732的恶性生长表型以及增强细胞间信息通讯能力。     

不同浓度纳米银对血管内皮细胞增殖作用的影响

目的:观察不同浓度纳米银对体外培养血管内皮细胞增殖的影响.方法:取3只5 d龄SD大鼠,分离心脏,在体外酶消化法分离血管内皮细胞并进行培养,第3代细胞用于实验.除空白对照组外,血管内皮细胞分别于含0.5,0.25,0.125,0.0625,0.03125 g/L纳米银的培养基中进行培养.24 h后倒置显微镜下观察细胞形态并进行细胞计数,采用甲基噻唑基四唑比色法和流式细胞术检测血管内皮细胞的增殖情况,并采用LDH法检测急性细胞毒性.结果:与空白对照组比较,不同浓度的纳米银组血管内皮细胞细胞数减少,纳米银浓度为0.25 g/L时,对血管内皮细胞的抑制作用最明显,其他浓度彼此间无统计学差异.不同浓度纳米银对血管内皮的增殖均有一定抑制作用,但并没有急性细胞毒性.结论:纳米银对体外培养的血管内皮细胞有明显的抑制增殖作用,其作用与纳米银的剂量有关.     

表达EGFP的质粒和目的基因共转染用于检测目的基因对细胞周期的影响

在基因功能研究过程中，常常使用的一种方法就是将目的基因转到靶细胞内进行瞬时表达(transient expression)，以流式细胞仪检测细胞周期的变化，观察转基因对细胞增殖的影响。由于各种转基因方法的不同，转基因的效率也不同，往往是仅有一部分细胞可以表达目的基因，没有转基因的细胞将影响检测的     

p19ARF对白血病细胞增殖与凋亡的影响

摘要目的:克隆正常人p19ARF基因,探讨其对肿瘤细胞增殖、细胞周期与凋亡的影响。方法:用流式细胞术、MTT测定及末端标记观察p19ARF基因对白血病细胞HEL和K562的作用。结果:将p19ARF导入HEL细胞后可明显抑制细胞繁殖,细胞周期被阻滞在G1期并可导致部分细胞凋亡。但是p19ARF对于p53基因突变的K562细胞的增殖和细胞周期没有明显的影响,也不能诱导其凋亡。结论:p19ARF可显著抑制人白血病细胞的增殖,其抑制作用依赖于p53基因的存在。