DAPT对人牙髓细胞Notch信号通路和细胞增殖的影响

目的：探讨γ-分泌酶抑制剂3,5-二氟苯乙酰-L-丙氨酰-S-苯基甘氨酸t-丁酯｛N-［N-(3,5-difluorophena-cetyl-L-alanyl)］-S-phenylglycine t-butyl ester, DAPT｝对人牙髓细胞Notch信号通路是否有抑制作用,及对牙髓细胞增殖能力的影响。方法：收集临床上完整拔除的健康前磨牙或第三磨牙,采用酶消化法进行人牙髓细胞的原代培养和传代培养。从第4代开始在正常培养基中加入终浓度为5 μmol/L的γ-分泌酶抑制剂DAPT,选择第4、8、10代细胞为检测细胞,采用实时荧光定量RT- PCR方法和基因芯片检测Notch信号通路相关基因的表达变化,用四甲基偶氮唑盐（methyl thiazolyl tetrazolium, MTT）法测定细胞活性,绘制牙髓细胞增殖曲线,评价牙髓细胞的增殖状况。结果：加入DAPT后,实验组牙髓细胞Notch信号通路的下游基因Hes1、Hey1、NR4A2表达下降,同时,第8、10代牙髓细胞的增殖减慢,与对照组相比,差异有统计学意义。结论：γ-分泌酶抑制剂DAPT能有效抑制体外培养人牙髓细胞的Notch信号通路,使人牙髓细胞增殖减慢,影响细胞的正常生命周期。     

体外人牙髓细胞的连续培养

目的 探讨体外连续培养过程中人恒牙牙髓细胞向成牙本质样细胞分化的可行性。方法 采用细胞连续培养、酶动力学法、透射电镜观察、免疫组化等方法，对体外人牙髓细胞在连续培养过程中的生物学特性进行研究。结果 部分人牙髓细胞在体外可以出现复层生长，形成细胞结节，并可进一步钙化；与成牙本质细胞相似，它们具有高碱性磷酸酶活性，可合成Ⅰ型胶原，其超微结构有许多与成牙本质细胞相似的特征，胞间基质中可见膜被基质小泡，某些基质小泡内含针状晶体。结论 体外连续培养的人牙髓细胞可向成牙本质细胞分化，此过程可作为研究体内牙髓损伤修复细胞增殖、分化的体外模型。     

肾上腺髓质素对人牙髓干细胞增殖和分化的影响

目的 探讨肾上腺髓质素（adrenomedullin,ADM）对人牙髓干细胞（dental pulp stem cells,DPSCs）增殖、成牙本质分化能力的影响。方法 体外培养的人DPSCs传至第3代,培养液中加入不同浓度ADM（10^-6、10^-7及10^-8 mol/L）处理细胞24 h,并设置空白对照组。流式细胞术检测细胞周期及细胞凋亡,定量PCR和蛋白质印迹法检测成牙本质分化标记物碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）的mRNA及蛋白表达。结果 细胞周期检测结果显示,3种浓度ADM干预DPSCs后G₂/S/M期细胞比例均较空白对照组上升（P<0.05）,但各干预组间差异无统计学意义; 细胞凋亡检测结果显示,3种浓度ADM干预组的Annexin Ⅴ⁺/PI^-标示细胞比例均较空白对照组下降（P<0.05）,但各干预组间差异无统计学意义; 定量PCR及蛋白质印迹检测结果显示,DPSCs中ALP mRNA及蛋白表达较空白对照组上升（P<0.01）,但各干预组间差异无统计学意义。结论 ADM具有促进DPSCs的增殖、抑制凋亡及促其向成牙本质分化的作用。     

年龄对人牙髓细胞原代培养的影响

目的　探讨从不同年龄人获得的牙髓组织与细胞游出之间的关系 ,以提高牙髓细胞原代培养的成功率。方法　采用组织块酶解法对 2 0个来自不同年龄志愿者的恒牙牙髓进行牙髓细胞的原代培养。结果　牙髓年龄与其原代培养时细胞游出率之间有负相关关系 (r=- 0 .78987) ,年轻恒牙牙髓细胞游出率高。结论在人牙髓细胞的原代培养时尽量采用年轻恒牙     

体外培养人牙髓细胞的初步实验观察

目的 经过人牙髓细胞的培养,获得足够量的传代细胞,为进一步的实验提供基础;观察人牙髓细胞的形态、结构。方法 组织块法、酶消化法联合应用体外培养人牙髓细胞;应用倒置相差显微镜、透射电镜观察人牙髓细胞的形态与结构。结果 体外培养人牙髓细胞成功率低;人牙髓细胞呈成纤维细胞形。结论 培养的人牙髓细胞维持了体内牙髓细胞的形态结构,可以用来进行牙髓生物学、牙科材料毒理学等研究。     

年龄对人牙髓细胞原代培养的影响

目的 探讨从不同年龄人获得的牙髓组织与细胞游出之间的关系。以提高牙髓细胞原代培养的成功率。方法 采用组织块酶解法对20个来自不同年龄志愿者的恒牙牙髓进行牙髓细胞的原代培养。结果 牙髓年龄与其原代培养时细胞游出率之间有负相关关系（r=-0.78987)，年轻恒牙牙髓细胞游出率高。结论 在人牙髓细胞的原代培养时尽量采用年轻恒牙。     

人牙髓干细胞的体外分离、培养及鉴定

目的 体外分离、培养及鉴定人牙髓干细胞,构建人牙髓干细胞系.方法 采用组织块酶消化法获取原代细胞,通过有限稀释克隆法纯化细胞;流式细胞仪检测细胞表面标记物;分别进行矿化诱导和成脂诱导,观察诱导后细胞矿化结节和脂滴形成情况.结果 原代培养后5～7d有细胞从组织边缘爬出,有限稀释法获得相对纯化均一的牙髓干细胞;流式细胞仪分析细胞表面抗原,CD29、CD90、CD105、CD146、STRO-1表达阳性,CD34及CD45表达阴性;矿化诱导的细胞茜素红染色镜下见矿化结节形成,成脂诱导的细胞油红O染色镜下见脂滴形成.结论 分离所得的细胞具有人牙髓干细胞的生物学特性,成功构建人牙髓干细胞系.     

DAPT对人牙髓细胞Notch信号通路和细胞增殖的影响

目的:探讨γ-分泌酶抑制剂3,5-二氟苯乙酰-L-丙氨酰-S-苯基甘氨酸t-丁酯{N-[N-(3,5-difluorophena-cetyl-L-alanyl)]-S-phenylglycine t-butyl ester,DAPT}对人牙髓细胞Notch信号通路是否有抑制作用,及对牙髓细胞增殖能力的影响。方法:收集临床上完整拔除的健康前磨牙或第三磨牙,采用酶消化法进行人牙髓细胞的原代培养和传代培养。从第4代开始在正常培养基中加入终浓度为5μmol/L的γ-分泌酶抑制剂DAPT,选择第4、8、10代细胞为检测细胞,采用实时荧光定量RT-PCR方法和基因芯片检测Notch信号通路相关基因的表达变化,用四甲基偶氮唑盐(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)法测定细胞活性,绘制牙髓细胞增殖曲线,评价牙髓细胞的增殖状况。结果:加入DAPT后,实验组牙髓细胞Notch信号通路的下游基因Hes1、Hey1、NR4A2表达下降,同时,第8、10代牙髓细胞的增殖减慢,与对照组相比,差异有统计学意义。结论:γ-分泌酶抑制剂DAPT能有效抑制体外培养人牙髓细胞的Notch信号通路,使人牙髓细胞增殖减慢,影响细胞的正常生命周期。     

CGRP影响人牙髓干细胞增殖分化的研究

目的 研究降钙素基因相关肽(CGRP)对人牙髓干细胞增殖分化的调控作用,并初步探讨CGRP的调控信号通路.方法 首先获取健康的牙髓,体外培养并筛选牙髓干细胞;采用MTT法检测不同浓度的CGRP对牙髓干细胞的增殖作用,获取适宜的作用浓度;利用茜素红染色法观察CGRP作用下牙髓干细胞形成矿化结节的效果;在实时定量RT-PCR法及免疫印迹法检测CGRP作用下牙髓干细胞中Ⅰ型胶原(Col-1)、转录因子Runx2的mRNA和蛋白表达水平;最后利用实时定量RT-PCR法检测MAPK信号通路抑制剂作用下CGRP对牙髓干细胞中Ⅰ型胶原、Runx2 mRNA表达水平的影响.结果 经过筛选培养获得生长稳定的牙髓干细胞;MTT法检测可知CGRP可促进牙髓干细胞的增殖,在CGRP的浓度达到10-7 mol/L时效果最显著;在CGRP作用牙髓干细胞28 d后,经茜素红染色可见矿化结节;经实时定量RT-PCR法和免疫印迹法检测可知CGRP作用下牙髓干细胞中Col-1、Runx2的mRNA和蛋白表达水平得到显著提高;MAPK信号通路中ERK激酶通路能够调控CGRP作用下牙髓干细胞中Runx2表达的水平,ERK激酶和p38通路能够调控CGRP作用下牙髓干细胞中Col-1表达的水平.结论 CGRP能够促进牙髓干细胞的增殖分化,这一作用受到MAPK信号通路的调控.     

人牙髓细胞的体外培养及生物学特性研究

目的:从年轻恒牙的牙髓组织中分离培养牙髓细胞,研究其表型及生物学特性.方法:选取因正畸或阻生拔除的年轻健康双尖牙或第三磨牙,取出牙髓,组织块酶消化法分离培养人牙髓细胞,免疫细胞化学检测第3代人牙髓细胞表面标志,并对体外培养的人牙髓细胞的矿化能力进行研究.结果:体外培养的人牙髓细胞表达Ⅰ型胶原及波形丝蛋白,少数细胞增殖可...     

IGF-1、bFGF对人牙髓干细胞的体外诱导分化的影响

目的研究IGF-1、bFGF对人牙髓干细胞分化的影响.方法酶消化法获得人牙髓干细胞,形态学观察,计算细胞克隆形成率;第3代牙髓干细胞,以IGF-1、bFGF细胞因子诱导,免疫组化染色和RT-PCR方法检测牙本质涎蛋白(dentin sialoprotein, DSP)、牙本质基质蛋白1(dentin matrix protein 1, DMP-1)和牙本质涎磷蛋白(dentin sialophosphoprotein, DSPP)的mRNA的表达.结果人牙髓干细胞呈集落状生长,在体外具有一定的克隆形成能力,经细胞因子刺激后细胞表达DSP、DMP-1蛋白和DSPP的mRNA.结论人牙髓组织中有呈克隆样生长的成体干细胞,IGF-1、bFGF可诱导人牙髓干细胞定向分化.     

碱性成纤维细胞生长因子对体外培养人羊膜间充质干细胞增殖的影响

目的观察不同浓度碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对体外培养人羊膜间充质干细胞(HAMSCs)增殖的影响,以探索体外培养HAMSCs的最适条件。方法分离、培养HAMSCs,选取第3代细胞进行鉴定及检测。实验组将bFGF分为0.1、0.5、1、5、10、20、40、80ng/ml共8个浓度组;阴性对照组只加HAMSCs,不加bFGF;空白对照组只加培养基。各组孵育48h后加入Am-Blue试剂,继续孵育,待培养基由靛青蓝色开始变成粉红色时取出用酶标仪测量各组的吸光度(OD),重复3次实验。结果 0.5、1、5、10、20、40、80ng/ml浓度组与对照组相比,差异均有统计学意义(P<0.05);10ng/ml组与0.5、1、5ng/ml组相比,差异均有统计学意义(P<0.05);10ng/ml组与40、80ng/ml组相比,差异无统计学意义(P=0.067),表明bFGF促增殖作用最强的最小浓度为10ng/ml。结论 bFGF能够促进HAMSCs增殖,且促增殖作用最强的最小浓度为10ng/ml。     

富血小板纤维蛋白对人牙髓干细胞增殖、凋亡 及碱性磷酸酶活性的影响

目的 探讨富血小板纤维蛋白（PRF）对人牙髓干细胞增殖、凋亡及碱性磷酸酶活性的影响及机制。 方法 从人牙髓组织中分离出人牙髓干细胞（hDPSCs）,hDPSCs 随机分为对照组及实验组,CCK8 实验检测PRF 刺激hDPSCs 第0、1、3、5 及7 天时细胞增殖情况;RT-PCR 检测PRF 刺激hDPSCs 第0、3、7 及14 天时 碱性磷酸酶（ALP）的mRNA 表达情况;流式细胞仪检测PRF 刺激hDPSCs 7 d 后细胞的凋亡情况,Western blotting 检测活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3（Cleaved Caspase-3）、p38、p-p38 蛋白表达。结果 实验组第1 天时细胞的增殖与对照组比较,差异无统计学意义（P >0.05）,第3、5、7 天时细胞的增殖均高于 对照组,差异有统计学意义（P <0.05）;实验组第3 天时ALP mRNA 表达与对照组比较,差异无统计学意义（P > 0.05）,第7 和14 天时ALP mRNA 表达均高于对照组,差异有统计学意义（P <0.05）;细胞的凋亡率及 Cleaved Caspase-3 蛋白、p-p38 蛋白表达实验组与对照组比较,差异有统计学意义（P <0.05）,实验组细胞的 凋亡率及Cleaved Caspase-3 蛋白表达均下降,p-p38 蛋白表达上调,p38 蛋白表达两组间比较差异无统计学意 义（P >0.05）。结论 PRF 可促进hDPSCs 的增殖,上调ALP 的mRNA 表达,抑制其凋亡,其机制与激活p38 信号通路有关。     

氯化锂对牙髓干细胞增殖与分化的影响

目的 检测氯化锂对人牙髓干细胞（dental pulp stem cells, DPSCs)细胞增殖与分化的影响。方法 收集18~25岁患者因正畸拔除的健康完整前磨牙或智齿,用改良组织块法分离培养牙髓干细胞;利用免疫荧光染色与流式细胞术对分离培养的细胞进行细胞来源鉴定;利用细胞计数试剂盒（CCK-8）测定不同浓度氯化锂对牙髓干细胞增殖的影响,选择适宜浓度的氯化锂对牙髓干细胞进行矿化诱导培养,利用茜素红染色观察矿化结节形成以及荧光定量PCR实验研究氯化锂对牙髓干细胞分化的影响。结果 流式细胞术及免疫组化染色结果显示原代人牙髓干细胞来源与标志物与间充质干细胞表现一致;CCK-8法检测结果表明2.5mmol/L的氯化锂对牙髓干细胞增殖具有促进作用;选用该浓度下的氯化锂对牙髓干细胞进行矿化诱导培养,茜素红染色与荧光定量PCR结果显示,氯化锂对牙髓干细胞牙向分化具有促进作用。结论 一定浓度的氯化锂对牙髓干细胞细胞增殖与细胞分化具有促进作用。     

酶消化组织块法培养人牙髓细胞

目的建立用酶消化组织块培养人牙髓细胞的方法。方法用酶消化组织块进行人牙髓细胞体外培养,倒置显微镜和透射电镜分别观察牙髓细胞形态、生长情况和超微结构,取第5代牙髓细胞测定生长曲线、免疫组化法鉴定组织来源,并检测其矿化能力。结果用酶消化组织块培养的人牙髓细胞成纤维细胞样,接种4天大部分组织块能有效贴附于培养瓶壁,第7天可见组织块边缘有细胞延展生长,第14天复层生长,呈网状,可顺利传代;牙髓细胞抗波形蛋白染色阳性,抗角蛋白染色阴性;细胞I型胶原染色阳性,连续培养的牙髓细胞可形成矿化结节,符合牙髓细胞的形态学特征和生物学特性。结论酶消化组织块培养人牙髓细胞方法简单可行,具有较高的成功率。     

人乳牙牙髓干细胞体外成骨特性的实验研究

目的研究人乳牙牙髓干细胞体外成骨特性。方法从健康儿童滞留乳牙牙髓组织中分离培养乳牙牙髓干细胞(SHED)后,经流式细胞仪分选出两组细胞。A组:CD34+/CD117+双阳性表达的细胞,B组:剩余的混杂细胞。研究两组细胞各自成骨特性:运用流式细胞仪分选标记干细胞,以免疫细胞化学技术,荧光定量PCR技术检测成骨细胞标记物,并做矿化染色。结果分离培养的细胞呈成纤维细胞样生长,经分选的A、B两组细胞在第30天时免疫细胞化学检测发现均有成骨细胞的标记物RUNX-2、OC、BSP表达,在培养第40天时运用荧光定量PCR检测分析发现A、B两组细胞表达RUNX-2、OC、BSPmRNA基因水平的差异有显著性意义:A组高于B组;在第50天A、B两组细胞运用VonKossa's染色法和茜素红染色法检测,结果显示A组细胞呈阳性表达,B组细胞呈阴性表达。结论纯化后的CD34+/CD117+双阳性表达的SHED具有体外自行成骨特性。     

腺病毒介导表皮生长因子体外转染人牙髓干细胞对其凋亡的影响

目的通过体外培养人牙髓干细胞(Human dental pulp stem cells,hDPSCs),观察重组腺病毒介导的表皮生长因子(Recombinant adenovirus mediated epidermal growth factor,rAd-EGF)转染至hDPSCs后对其凋亡的影响。方法 rAd-EGF转染hDPSCs后,采用RT-PCR检测EGF mRNA的表达情况,用流式细胞仪Annexin V-FITC/PI法检测hDPSCs的凋亡情况。结果在一定时间内,rAd-EGF转染入hDPSCs,实验组hDPSCs中EGF mRNA的表达水平相对于阴性对照组与空白组均明显上调(P<0.05),并且同阴性对照组与空白组比较,实验组hDPSCs体外凋亡指数明显降低(P<0.05)。结论 rAd-EGF转染入hDPSCs,EGF mRNA的表达量增加,在短期内对其凋亡具有抑制作用。