hTERT启动子的克隆及在MCF7乳腺癌细胞中的特异转录活性

背景与目的：利用肿瘤特异性启动子增强肿瘤细胞中治疗基因的转录选择性是达到基因治疗靶向性的有效途径。人端粒酶催化亚基（hTERT）在大部分肿瘤细胞中呈特异性高表达，有可能成为肿瘤特异性启动子。本文扩增了hTERT基因启动子并分别克隆于报告基因重组质粒pEGFP-1和pGL3-Basic，检测并证实hTERT启动子在乳腺癌细胞MCF7中的特异转录活性。方法：采用套式PCR法扩增hTERT启动子，将其分别克隆到含报告基因增强绿色荧光蛋白（EGFP）的重组质粒pEGFP-1和含Luciferase的重组质粒pGL3-Basic，经脂质体分别转染人乳腺正常上皮细胞系HBL100和乳腺癌细胞MCF7，荧光显微镜观察EGFP的表达情况，并测定两种细胞中荧光素酶转录表达差异。结果：与正常细胞HBL100相比，hTERT启动子在MCF7细胞呈现强的绿色荧光表达；荧光素酶活性检测与其一致，hTERT启动子在MCF7乳腺癌细胞的荧光素酶相对活性RLU／U值（33784）约相当于HBL100细胞中（2400）的15倍。结论：hTERT启动子在乳腺癌MCF7细胞中具有很强的特异性，为进一步开发肿瘤的特异性基因治疗奠定实验基础。     

肿瘤端粒酶靶向腺病毒载体的表达活性

目的　构建针对端粒酶阳性肿瘤的特异性腺病毒载体 ,研究其介导目的基因在肿瘤细胞内的定向表达能力。方法　将端粒酶逆转录酶 (hTERT )启动子克隆入质粒 pDC3 12的多克隆位点构成外源基因表达盒 ,在基因表达盒上下游分别插入 1个绝缘子序列 ,构建针对端粒酶阳性肿瘤的特异性腺病毒载体pSG TPE ;采用Luciferase报告基因进行hTERT启动子的活性分析 ;以pSG TPE携带绿色荧光蛋白 (EGFP)报告基因 ,重组腺病毒AdTPE EGFP ,观察其介导EGFP在肿瘤细胞内的定向表达能力 ,并与CMV启动子控制的腺病毒AdCMV EGFP作对照。结果　hTERT启动子在正常细胞内几乎没有活性 ,而在肿瘤细胞内的活性与SV 40启动子相近。腺病毒AdTPE EGFP能介导EGFP在肿瘤细胞内定向而稳定表达 ,在正常细胞内不表达 ,而对照腺病毒AdCMV EGFP在肿瘤和正常细胞内均表达EGFP。结论　靶向端粒酶阳性肿瘤的腺病毒载体 pSG TPE ,不但提高了对基因表达调控的特异性 ,而且降低了对正常细胞毒性作用。绝缘子的应用隔断了外源基因表达盒和病毒基因表达调控序列之间的互相干扰 ,进一步提高目的基因的表达效率。该载体对肿瘤的靶向基因治疗具有重要的应用价值。     

E2F1对 TFDP3 表达的调控及其对前列腺癌PC3细胞凋亡的影响

目的：构建含TFDP3基因启动子和荧光素酶报告基因的重组载体pGL3-TFDP3-promoter,观察E2F1对TFDP3转录及表达的调控作用以及TFDP3对E2F1诱导肿瘤细胞凋亡的影响。方法：以人前列腺癌PC3细胞系基因组DNA为模板,PCR扩增TFDP3启动子序列并克隆入荧光素酶报告基因载体,与E2F1表达载体pCMV-E2F1-HA瞬时单独或共同转染PC3细胞,测定荧光素酶活性以观察E2F1对TFDP3启动子的调控作用,Western blotting检测pCMV-E2F1-HA转染对PC3细胞内TFDP3表达的影响,流式细胞术检测TFDP3与E2F1相互作用对前列腺癌细胞凋亡的影响。结果：成功构建TFDP3基因启动子重组质粒pGL3-TFDP3-promoter,与E2F1表达载体pCMV-E2F1-HA共转染PC3细胞后,TFDP3启动子诱导的荧光素酶活性较单独转染pGL3-TFDP3-promoter显著升高[（1.14±0.06）vs（0.61±0.05）, P<0.05]。转染pCMV-E2F1-HA的PC3细胞的TFDP3蛋白表达是未转染细胞的2.7倍[（0.24±0.03）vs（0.09±0.02）, P<0.05]。pCMV-E2F1-HA转染后PC3细胞凋亡率较未转染组显著上升[（7.10±0.003）% vs（2.66±0.001)%,P<0.05],而pCMV-E2F1-HA与pcDNA3.1-TFDP3共转染后细胞凋亡率较pCMV-E2F1-HA组显著下降[（4.92±0.002）% vs（7.10±0.003）%,P<0.05]。结论：E2F1可增强TFDP3启动子的活性,增加TFDP3蛋白的表达,其可能通过此机制抑制E2F1诱导的前列腺癌细胞凋亡。     

不同截短型癌基因AEG-1启动子活性分析

目的:分析不同截短型癌基因AEG-1启动子活性,证实与E6/E7表达相关的转录调控因子对AEG-1启动子活性的影响。方法:以宫颈癌HeLa细胞基因组DNA为模版,扩增AEG-1启动子全长序列（-2710/-491）,并应用本实验室改造的启动子活性研究专用绿色荧光蛋白报告载体构建pGL3-basic-EGFP/AEG-1质粒,通过转染HeLa细胞及血管内皮细胞ECV304检测启动子活性。同时,根据AEG-1启动子序列上与E6/E7作用相关的转录调控因子结合位点位置,设计不同截短型AEG-1启动子序列引物,应用pGL3-basic-EGFP载体构建不同截短型AEG-1启动子载体,并分别转染细胞检测启动子活性。结果:AEG-1启动子全长序列pGL3-basic-EGFP/AEG-1载体转染HeLa细胞可见明显绿色荧光蛋白表达,而在血管内皮细胞ECV304中表达为痕量。包含不同转录调控因子C-Myc、SP1、NF-κB、E2F结合位点的不同截短型AEG-1启动子载体在肿瘤细胞中有活性但存在差异。结论:AEG-1启动子为肿瘤特异性启动子,含有与E6/E7表达相关的转录调控因子NF-κB、E2F结合位点的启动子序列为影响AEG-1基因启动子活性的关键区域。     

hTERT启动子克隆及其肿瘤细胞特异性的研究

目的:探讨克隆人端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子对肿瘤细胞特异性的意义.方法:全基因合成hTERT启动子核心序列TP258,克隆入T载体,构建pUCmT-TP258测序;Sal Ⅰ BamH Ⅰ酶切pUCmT-TP258,将其片断插入pGL3-Basic/Xho I Bgl Ⅱ位点,构建pGL3-TP258质粒载体.将pGL3-Basic、pGL3-control和pGL3-TP258转染培养的人结肠癌细胞株(CaCo-2)、人乳腺癌细胞株(MCF-7)、原代肾癌细胞(RCC)和人正常成纤维细胞(UFC、BJ、MRC-5),测定Luciferase活性,计算其相对活性.结果:在端粒酶阳性的肾癌细胞RCC、结肠癌细胞CaCo-2和乳腺癌细胞MCF-7中,TP258启动子相对活性很高,分别为32.40±15.32、37.70±6.38和12.80±7.28;而在正常的UFC、BJ和MRC-5细胞中,TP258活性很低,分别是0.40±0.14、0.26±0.13和0.38±0.05,两组闻差异有统计学意义,P=0.003 5.结论:hTERT核心启动子TP258在肿瘤细胞中活性明显高于在正常细胞中的活性,具有肿瘤特异性.TP258可以介导基因在肿瘤中的定向表达,实现基因表达的靶向性.     

MTS1基因β启动子E2F1结合位点序列突变重组质粒的构建与表达

目的：深入研究MTS1基因β启动子的转录激活与E2F1转录因子的相互作用关系，阐明该转录水平的调控机制。方法：用PCR定点突变方法或酶切连接法，构建β启动子0.38kb SacⅡ-Sac I酶切片段中E2F1 A，B，C任意2个位点或3个位点均突变的pGL3重组质粒。用脂质体介导的基因瞬时转染法，将构建的重组质粒转染MTS1基因双等位缺失的急性T淋巴细胞白血病Jurkat细胞，检测pGL3重组质粒中荧光素酶报告基因的表达。结果：构建的E2F1 A，B，C结合位点突变的重组质粒经Sac I或Nae I酶切鉴定和DNA序列分析得到证实。与E2F1位点野生型重组质粒比较，突变型重组质粒在Jurkat细胞中荧光素酶报告基因的表达量减少，以3个位点均突变的重组质粒为明显。结论：构建的E2F1 A，B，C2个或3个结合位点均突变重组质粒成功，可通过基因转染用于研究MTS1基因的功能试验中；MTS1基因β启动子的转录活性可能与E2F1转录因子的反式激活有关。     

人脂肪酸合成酶FAS启动子的克隆及其在几种肿瘤细胞中的转录活性分析

目的:克隆人脂肪酸合成酶基因FAS启动子的序列,构建重组荧光素酶表达载体pGL3-FAS,并分析其在几种肿瘤细胞中的转录活性,为其作为肿瘤靶向基因治疗的工具提供依据。方法:以人基因组DNA为模板,PCR扩增FAS启动子区680bp活性序列,经测序鉴定正确后,克隆至荧光素酶表达载体pGL3-enhancer中,构建成重组荧光素酶表达载体pGL3-FAS。将pGL3-FAS通过脂质体转染胃癌细胞系SGC-7901、人宫颈癌细胞系Hela、人乳腺癌细胞系SKBR3、人肝癌细胞系HepG2以及NIH3T3成纤维细胞系中,应用荧光素酶检测系统测定荧光素酶活性,通过内参校正得到相对转录活性。结果:成功扩增出大小约为680bp的FAS启动子序列,经测序鉴定与Genebank报道的一致。经酶切鉴定,成功构建重组荧光素酶表达载体pGL3-FAS。瞬时转染pGL3-FAS,发现其在SGC-7901、Hela、SKBR3、HepG2细胞中均具有较强的荧光素酶活性,且荧光素酶活性高于强启动子SV40驱动的pGL3-control载体;而在正常成纤维细胞中,转录活性较低。结论:FAS启动子在肿瘤细胞中具有强转录活性,而在正常细胞中转录活性很低,具有良好的肿瘤靶向性,为肿瘤靶向基因治疗提供理论依据。     

hTERT启动子的克隆及hTERT启动子/SV40增强子在食管癌细胞中的转录活性

目的 克隆hTERT启动子核心序列,研究hTERT启动子/SV40增强子在食管癌细胞中的联合转录活性。 方法 以人基因组DNA为模板,PCR扩增hTERT启动子核心片段;将其分别插入荧光素酶基因报告质粒pGL3-Basic和pGL3-Enhancer中,构建hTERT启动子调控的表达载体pGL3-hTERTp和由hTERT启动子/SV40增强子联合调控的表达载体pGL3-hTERTp-SV40en,将上述重组质粒分别瞬时转染食管癌细胞Eca-109、EC1和人胚肺成纤维细胞MRC-5,用荧光素酶检测试剂盒检测转染细胞中荧光素酶基因的表达水平并以此计算hTERT启动子和hTERT启动子/SV40增强子在各种细胞中的转录活性。结果 克隆出长213 bp的hTETR启动子核心片段,DNA测序结果与GenBank中hTERT启动子的碱基序列完全一致;成功构建真核表达载体pGL3-hTERTp和pGL3-hTERTp-SV40en;hTETR启动子在食管癌细胞Eca-109和EC1中均有转录活性,在MRC-5细胞中无明显转录活性;hTERT启动子/SV40增强子在食管癌细胞Eca-109和EC1中的转录活性显著高于hTETR启动子的单独转录活性。结论 hTERT启动子在食管癌细胞中具有靶向性转录活性,SV40增强子能显著增强hTERT启动子在食管癌细胞中的转录活性,有可能作为肿瘤靶向性基因治疗的转录调控元件。     

人类生存蛋白启动子的克隆及其在淋巴瘤细胞中的转录活性研究

  目的　克隆人类生存蛋白（Survivin）核心启动子,研究Survivin启动子在人类淋巴瘤细胞Ramos和健康人肝脏细胞Chang Liver中的转录活性。方法　以人类肠基因组DNA为模板,PCR扩增Survivin启动子987 bp片段,将其通过酶切位点连入pGL3-Basic载体构建pGL3-Survivin荧光素酶报告基因载体,通过脂质体转染法转染Ramos和Chang Liver 细胞,通过检测荧光素酶表达水平,比较Survivin启动子在这两种细胞中的转录活性。结果　成功克隆出987 bp的Survivin启动子;双酶切、PCR检测和DNA测序证实pGL3-Survivin载体构建成功;荧光素酶活性检查显示：Survivin启动子在Ramos细胞中的转录活性为阳性对照CMV启动子活性的4.5 %,明显高于在Chang Liver细胞中的0.19 %,在淋巴瘤细胞中具有较高特异性,且在淋巴瘤细胞中的活性明显高于阴性对照pGL3-Basic的0.086 %。结论　Survivin启动子在淋巴瘤细胞中具有较高的特异性,可以作为淋巴瘤细胞基因转染的肿瘤特异性启动子使用。     

转录因子STAT5A启动子荧光素酶报告基因质粒的构建及鉴定

目的： 利用分子克隆的方法构建转录因子STAT5A启动子荧光素酶报告基因质粒并鉴定其效应。方法： 以乳腺癌MCF7细胞基因组DNA为模板,采用PCR方法扩增STAT5A基因的启动子序列,并将其克隆至荧光素酶报告基因质粒pGL3-Enhancer中,经过菌液扩增、酶切、测序等方法获得目的质粒,并通过双荧光报告基因实验进一步验证其功能。结果： 构建的STAT5A启动子荧光素酶报告基因质粒pGL3-STAT5A-pro-luc-E序列正确,且具有转录活性。在双荧光报告基因实验中发现重组载体pGL3-STAT5A-pro-luc-E荧光素酶的相对活性约为阴性对照pGL3-Enhancer的8倍（P<0.01）,而pGL3-STAT5A-pro-N-luc-E荧光素酶的相对活性约是阴性对照pGL3-Enhancer的6倍（P<0.01）。结论： 本项目成功构建了转录因子STAT5A启动子荧光素酶报告基因质粒,为进一步研究STAT信号转导及转录激活蛋白信号通路提供了重要的研究工具。     

食管平滑肌瘤10例临床治疗体会

我院１９７５年６月～１９９０年７月共收治食管平滑肌瘤１０例，占同期食管肿瘤总数的０．１９２％（１０／１０９２）。位于食管上段２例，中段５例，下段３例。Ｘ线食管钡餐造影是诊断本病的主要方法。行食管粘膜外肿瘤摘除９例，食管部分切除１例，效果良好。本文就其诊断与手术治疗进行了讨论。     

仙人掌原液毒性的初步研究

背景与目的： 研究仙人掌原液的毒性。 材料与方法： 小鼠急性毒性试验、Ames试验、小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验、小鼠精子畸形试验、大鼠30 d喂养试验。 结果： 仙人掌原液雌、雄小鼠LD50均大于20.0 g/kg,属无毒物质;Ames试验、微核试验和精子畸形试验结果均为阴性;大鼠30 d喂养试验结果显示该样品30 d喂养对大鼠各项观察指标未见毒性作用。结论： 在本次实验条件下,仙人掌原液为无毒物质,未显示有遗传毒性和亚急性毒性作用。     

中晚期贲门癌148例的外科治疗

目的　总结贲门癌手术治疗影响生存率的因素 ,提供今后工作参考。方法　对 14 8例经手术治疗的贲门癌患者进行术后并发症、绝对生存率的X2 检验。结果　本组切除率为 94.5 9% ,近半胃切除占 72 .14 % ,1、3、5年生存率分别为 67.9%、45 %和 2 4.3 %。病期、外侵程度和淋巴结转移等因素对 5年生存率有显著影响 (P <0 .0 1)。术后并发症以吻合口瘘及肺癌并发症为多见 ,其发生率为 3 .6% ,手术死亡率 1.4%。结论　提高生存率的关键在于早期诊断 ,根治手术和术后积极综合治疗。     

胆囊癌29例分析

目的探索胆囊癌的防治方法。方法分析29例胆囊癌病人临床资料、治疗方法及结果。结果术前诊断明确者21例，剖腹探查发现已属晚期，9例为Ⅳ期行根治术，12例为Ⅴ期未行根治术，均于术后1年内死亡。术前怀疑胆囊癌者5例，剖腹探查冰冻切片证实为Ⅴ期及Ⅳ期者各1例，Ⅴ期未行根治术，Ⅳ期行根治术，均于术后1年内死亡；Ⅲ期者3例，行胆囊癌根治术分别于术后10月、13月、17月死亡。2例术中冰冻切片发现的Ⅱ期胆囊癌，行胆囊癌根治术，分别于术后23月、26月死亡。1例意外胆囊癌属Ⅰ期胆囊癌，术后5年半死亡。结论要减少胆囊癌危害，重在及时治疗胆囊结石。     

仙人掌原毒性的初步研究

背景与目的:研究仙人掌原液的毒性。材料与方法:小鼠急性毒性试验、Ames试验、小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验、小鼠精子畸形试验、大鼠30 d喂养试验。结果:仙人掌原液雌、雄小鼠LD50均大于20.0 g／kg,属无毒物质;Ames试验、微核试验和精子畸形试验结果均为阴性;大鼠30 d喂养试验结果显示该样品30 d喂养对大鼠各项观察指标未见毒性作用。结论:在本次实验条件下,仙人掌原液为无毒物质,未显示有遗传毒性和亚急性毒性作用。     

Management of intracranial metastases of differentiated carcinoma of thyroid

Summary Brain metastases in differentiated carinoma of the thyroid is a rare occurrence. We treated five documented cases of carcinoma of thyroid with brain metastases out of 400 cases of thyroid cancer treated between 1972 to 1993. 4 were females out of which one was pregnant during the appearance of brain metastases. All cases were treated with thyroidectomy, and radioiodine as primary therapy. Brain metastases developed 6 months to 11 years following treatment of the primary and were treated with radiotherapy and suppressive levothyroxine. We observed the beneficial effect of suppressive thyroxine and the poor prognosis associated with pregnancy and withdrawl of thyroid replacement therapy. 3 of the 5 patients are alive 12–23 months after treatment for brain metastases, while 2 patients died at 4 months and 7 years post brain metastases due to pulmonary and hepatic failure, respectively.     

Clinico-Pathological Study of 50 Cases of Tumours of Larynx

Otoacoustic emissions have been advocated in the management of otitis media with effusion. However, otoacoustic emissions cannot differentiate different types of hearing loss. This study was conducted to find factor that can differentiate otitis media with effusion from other common causes of hearing loss in children. Children were enrolled in the study and divided in four groups consisting of 25 ears each after pure tone and impedance audiometry: (1) Otitis media with effusion group, (2) Normal ear group, (3) Sensory-neural hearing loss group, (4) Chronic suppurative otitis media group. Otoacoustic emissions were recorded and results were analyzed statistically. The normal hearing group had significant difference from other groups but total band reproducibility of transient evoked otoacoustic emissions did not show any statistical difference in the cases groups. In distortion product otoacoustic emissions, group 1 showed significant difference from group 3 and group 1 had significant difference from all other groups at 4 kHz. The study did not find any factor that differentiates otitis media with effusion from other diseases. Although, distortion product otoacoustic emissions can indicate otitis media with effusion but impedance audiometry should be the main tool in the management of otitis media with effusion.     

乳腺叶状囊肉瘤320例诊治分析

目的探讨乳腺叶状囊肉瘤临床诊断和治疗方法。方法回顾分析经手术病理确诊为乳腺叶状囊肉瘤的320例患者的诊断和治疗情况。结果行乳腺X片检查121例,B超检查25例,近红外检查21例,针吸细胞学检查42例;15例(12.4%)乳腺X片检查及3例(14.3%)近红外检查诊断为乳腺叶状囊肉瘤。临床诊断正确率为17.5%(56/320),误诊率为82.5%(264/320)。随访253例患者,其中局部复发45例(17.8%),远处转移死亡13例(5.1%)。结论乳腺叶状囊肉瘤诊断需常规病理检查,治疗宜行局部广泛切除或全乳切除。     

胆囊腺瘤癌变的相关因素分析

目的:探讨胆囊腺瘤癌变与临床因素的相关性。方法:应用ROC曲线,计算胆囊腺瘤癌变的肿瘤大小临界值。应用χ2独立性检验,计算胆囊腺瘤癌变与临床因素的相关性、临床表现与肿瘤位置的相关性。结果:肿瘤良恶性临界值为2.27 cm。胆囊腺瘤癌变与患者的性别、年龄、是否合并结石无明显相关性（P＞0.05）,而与肿瘤大小、肿瘤数目、形态、超声下是否有血流(P＜0.05)等临床病理特征有明显相关性。临床症状与肿瘤是否位于胆囊颈部有明显相关性(P＜0.05)。结论:胆囊腺瘤在超声扫描下表现为单发、无蒂、有血流、直径大于2.27 cm,应高度怀疑已有恶变。肿瘤位于胆囊颈部可引起右上腹胀痛、疼痛向右背部放射、恶心呕吐等临床表现。