p38调节活化蛋白激酶绿色荧光蛋白融合载体的构建及表达

目的构建在哺乳动物细胞中表达的PRAK绿色荧光蛋白融合表达载体.方法将克隆在pET-14b上的PRAK亚克隆到绿色荧光蛋白载体DEGFP-C2上,随后转染Hela细胞,并在荧光显微镜下观察.结果重组质粒经酶切、PCR和测序鉴定正确无误,并在Hela细胞中得到高量表达.融合蛋白发出的绿色荧光表明EGFP-PRAK主要分布在细胞核中.结论成功构建了PRAK绿色荧光蛋白融合载体,该载体能在哺乳动物细胞中进行表达,为研究PRAK的细胞内定位和移位提供了一个重要的工具.     

p38调节活化蛋白激酶绿色荧光蛋白融合载体的构建及表达

目的 构建在哺乳动物细胞中表达的PRAK绿色荧光蛋白融合表达载体。方法 将克隆在pET-14b上的PRAK亚克隆到绿色荧光蛋白载体pEGFP-C2上,随后转染Hela细胞,并在荧光显微镜下观察。结果 重组质粒经酶切、PCR和测序鉴定正确无误,并在Hela细胞中得到高量表达。融合蛋白发出的绿色荧光表明EGFP-PRAK主要分布在细胞核中。结论 成功构建了PRAK绿色荧光蛋白融合载体,该载体能在哺乳动物细胞中进行表达,为研究PRAK的细胞内定位和移位提供了一个重要的工具。     

PRAK不同突变体的构建、表达及细胞内定位的研究

目的:构建p38调节/激活蛋白激酶(PRAK)不同突变体的绿色荧光蛋白融合表达载体,并在真核细胞中表达后,观察这些突变体在细胞内的定位情况.方法:将克隆在绿色荧光蛋白载体pEGFP-C2上的野生型PRAK通过定点突变技术构建其无活性突变体PRAK(T182A)、活性突变体PRAK(T182D)、无激酶活性突变体PRAK(KM)、核定位信号缺失突变体PRAK(NLSm)及核输出信号缺失突变体PRAK(NESm),随后转染NIH3T3细胞,并在荧光显微镜下观察其表达和细胞内定位情况.结果:经测序鉴定各种PRAK不同突变体正确无误后,在NIH3T3细胞中得到高量表达;融合蛋白发出的绿色荧光表明,在静息状态下,野生型PRAK(WT)、PRAK(182A)、PRAK(182D)、PRAK(KM)和PRAK(NESm)主要分布于细胞核内,而PRAK(NLSm)在细胞中均匀分布;在受到NaAsO2刺激后,PRAK(WT)和PRAK(KM)移位出核,而PRAK(182A)、PRAK(182D)和PRAK(NESm)失去了移位出核的能力,PRAK(NLSm)则与刺激前无明显差异.结论:成功构建了PRAK不同突变体的绿色荧光蛋白融合表达载体并在真核细胞中进行了表达,且不同的突变体能够影响PRAK的细胞内定位.     

GFP-HPV16 E2及其删除突变体融合蛋白在真核细胞中的表达与定位

目的构建人乳头瘤病毒16型E2(HPV16 E2)及其N端(TAD)、C端(DBD)删除突变体与增强型绿色荧光蛋白(GFP)融合蛋白的真核表达载体,观察其在Hela细胞中的表达与定位。方法HPV16 E2基因经PCR扩增后,与pMD-T载体连接,经蓝白斑筛选、PCR、双酶切鉴定及序列分析后,将E2基因亚克隆至pEGFP-C1真核表达载体中,构建荧光蛋白融合表达载体pEGFP-C1/HPV16 E2。PCR扩增TAD、DBD基因片段,将其双酶切后插入pEGFP-C1,构建荧光蛋白融合表达载体pEGFP-C1/TAD及pEGFP-C1/DBD。将3种质粒转染Hela细胞,在荧光显微镜下观察融合蛋白的表达与定位。结果重组载体经PCR、双酶切鉴定及测序证明插入片段序列正确,且在Hela细胞中能表达目的蛋白;GFP-E2融合蛋白在细胞核与细胞质中都有表达,但主要分布于细胞核;而GFP-DBD融合蛋白仅在细胞核内;GFP-TAD融合蛋白仅在细胞质中。结论构建的绿色荧光蛋白融合表达载体pEGFP-C1/HPV16 E2、pEGFP-C1/TAD及pEGFP-C1/DBD均在Hela细胞中表达,并确定了各自在细胞内的定位。     

pEGFP-HPV16 E6重组质粒的构建及其在Hela细胞中的表达定位

目的 构建以绿色荧光蛋白(green fluorescence protein,GFP)为报告基因的重组表达质粒pEGFP-HPV16 E6.方法 利用脂质体转染体外培养的Hela细胞,在活细胞状态下用荧光显微镜直接观察pEGFP～HPV16 E6融合蛋白在细胞中的分布和定位,用Western blot方法验证其蛋白的表达.结果 在空载体pEGFP-C2转染组中,Hela细胞内绿色荧光呈弥散分布;重组质粒pEGFP-HPV16 E6转染组中,绿色荧光集中在细胞核中.结论 pEGFP-HPV16 E6融合基因真核表达载体在真核细胞Hela中获得了表达,细胞所表达的融合蛋白具有HPV16 E6和EGFP的双重活性,可用荧光显微镜直接观察其表达情况及亚细胞定位,为HPV16 E6的功能研究提供了线索.     

人BNIP3基因在Hela细胞中的表达及定位

目的：构建BNIP3-HA融合蛋白的真核表达载体,观察BNIP3在Hela细胞中表达及其定位。方法：采用两步克隆法将HA和BNIP3的编码序列以融合表达的形式克隆到载体pcDNA3上,随后转染Hela细胞。BNIP3经Alexa Fluor488免疫荧光标记,线粒体用MitoFluor Red589染色后在荧光显微镜下观察BNIP3的表达和定位。结果：重组质粒经酶切、聚合酶链反应（PCR）和测序鉴定构建正确,并在Hela细胞中能够表达,在荧光显微镜下观察,BNIP3-HA融合蛋白分布于线粒体。结论：成功构建BNIP3-HA融合蛋白表达载体并在Hela细胞线粒体中表达。     

p38 MAPK红色荧光蛋白融合载体的构建及表达

目的构建在哺乳动物细胞中表达的p38丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)红色荧光蛋白(RFP)融合表达载体.方法将克隆在pcDNA3上的FLAG标记的p38 MAPK亚克隆到红色荧光蛋白载体pDsRed1-N1上,随后转染HeLa细胞.在荧光显微镜下观察结果.结果重组质粒经酶切、PCR和测序证明正确无误,并在HeLa细胞中得到高量表达.融合蛋白发出的红色荧光表明p38 MAPK弥散分布于细胞质中,细胞核中也有一定的分布.结论成功构建了p38 MAPK红色荧光蛋白融合载体,该载体能在哺乳动物细胞中进行表达,为研究p38MAPK的细胞内定位提供了一个重要的工具.     

MK2不同突变体的构建、表达及细胞内定位的研究

目的:为了研究MAPK激活蛋白激酶2 (MAPK-activated protein kinase 2, MK2)细胞内定位与其功能的关系,构建了MK2不同突变体的绿色荧光蛋白融合表达载体并观察这些突变体在细胞内的定位情况. 方法:将克隆在绿色荧光蛋白载体pEGFP-C2上的野生型MK2(WT)通过定点突变技术构建其无活性突变体MK2(320A)和活性突变体MK2(320E),转染NIH3T3细胞,并在荧光显微镜下观察其细胞内定位情况.结果:各种MK2不同突变体经测序鉴定正确后,在NIH3T3细胞中得到高量表达.融合蛋白发出的绿色荧光表明,在静息状态下,MK2(WT)主要分布于细胞核内,MK2(320E)主要分布于细胞质内,而MK2(320A)在细胞核和细胞质中都有分布.在受到紫外线(UV)刺激后,MK2(WT)和MK2(320A)移位出核,而MK2(320E)的细胞内定位则没有发生明显的改变.结论:成功构建了绿色荧光蛋白标记的MK2不同突变体并在真核细胞中进行了表达,观察到不同突变体对MK2细胞内定位的影响.     

p38MAPK红色荧光蛋白融合载体的构建及表达

目的 构建在哺乳动物细胞中的表达的p38丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）红色荧光蛋白（RFP）融合表达载体。方法 将克隆在pcDNA3上的FLAG标记的p38MAPK亚克隆到红色荧光蛋白载体pDsRed1-N1上，随后转染HeLa细胞。在荧光显微镜下观察。结果 结果 重组质粒经酶切，PCR和测序证明正确无误，并在HeLa细胞中得到高量表达，融合蛋白发出的红色荧光表明p38MAPK弥散分布于细胞质中，细胞核中也有一定的分布。结论 成功构建了p38MAPK红色荧光蛋白融合载体。该载体能在哺乳动物细胞中进行表达，为研究p38MAPK的细胞内定位提供了一个重要的工具。     

F10基因与绿色荧光蛋白融合载体的构建及亚细胞定位

目的：构建F10基因与绿色荧光蛋白的融合蛋白表达载体，进而观察F10基因编码蛋白在细胞内的定位情况。方法：运用RT—PCR技术从葡萄胎组织中分离F10基因的完整ORF，构建pEGFP-N2／F10和pEGFP—C2／F10的融合表达载体，以1Apofect AMINE2000为介导剂，将重组载体转染入人乳腺癌细胞MCF-7，并在荧光显微镜和共聚焦显微镜下观察表达的融合蛋白。结果：显微镜下观察到，GFP／F10融合蛋白呈不规则的颗粒状、环状分布于细胞核，或细胞浆，或者在核浆中均有分布，而且在细胞浆中主要分布在细胞器中。而对照的pEGFP蛋白均匀分布在整个细胞浆和细胞核。结论：F10蛋白在细胞的不同周期分布不同，或在细胞核，或在细胞胞浆中，或者在核浆中均有分布。     

绿色荧光蛋白表达质粒的构建及鉴定

目的构建能表达绿色荧光蛋白的载体———pCDNA3.1-GFP。方法使用基因重组方法从质粒pGreenlantern中获取绿色荧光蛋白基因片段,克隆入PCDNA3.1的多克隆区,构建成PCDNA3.1-GFP,通过限制性核酸内切酶NotI与BamHI对所建质粒进行分析后,转染HepG2细胞并观察绿色荧光蛋白表达。结果经限制性内切酶及转染HepG2细胞表达鉴定,证实成功构建了PCDNA3.1-GFP。结论成功构建成携有绿色荧光蛋白报告基因哺乳动物表达载体,该质粒可用于融合表达目的蛋白,并将目的蛋白表达定位。     

人精子蛋白17增强型绿色荧光蛋白共表达卵巢癌细胞模型的建立

目的:建立人精子蛋白17(hSp17)与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)共表达的卵巢癌细胞模型. 方法:用PCR方法获取hSp17基因片段,Hind Ⅲ/Kpn I双酶切、T4 DNA连接酶连接的方法将hSp17基因片段克隆至含报告基因EGFP的真核表达载体pEGFP-N1中,脂质体介导转染卵巢癌细胞HO8910,荧光倒置显微镜观察及Westernblot检测转染细胞中hSp17/EGFP融合蛋白的表达,G418筛选稳定表达的细胞株. 结果:酶切和测序结果均证实pEGFP-N1/hSp17重组质粒的构建完全正确.荧光观察与Western blot均证实了hSp17/EGFP蛋白的共表达,且成功筛选出稳定表达的细胞株. 结论:成功构建hSp17/EGFP共表达的卵巢癌细胞模型,为研究hSp17异常表达对肿瘤细胞生物学行为的影响,以及hSp17为靶标的肿瘤诊断和生物治疗奠定基础.     

端粒酶逆转录酶基因启动子调控的肿瘤细胞特异表达载体的构建和鉴定

目的 利用端粒酶逆转录酶基因启动子,构建能在人肿瘤细胞中特异表达目的基因的表达载体。方法 通过PCR方法从pEGFP-N1质粒中扩增出绿色荧光蛋白基因并克隆到逆转录病毒载体pLNCX的多克隆位点上,命名为pLNCX-EGFP。设计含有特定酶切位点的引物,从人基因组中扩增出端粒酶逆转录酶基因启动子序列,将该序列片段定向克隆到已用限制性内切酶切除巨细胞病毒启动子的pLNCX-EGFP载体上,构建成端粒酶逆转录酶基因启动子调控的含有绿色荧光蛋白报告基因的表达载体pLNT-EGFP。将该表达载体pLNT-EGFP瞬时转染高表达端粒酶活性的HLF细胞株和不表达端粒酶活性的WI38细胞株,以检测端粒酶逆转录酶基因启动子的转录活性。结果 表达载体pLNT-EGFP经酶切、测序分析证实与设计的完全一致。细胞瞬时转染结果表明,pLNT-EGFP能特异地在端粒酶阳性细胞中高效表达绿色荧光蛋白报告基因,而在端粒酶阴性细胞中不表达报告基因。结论 成功构建了由端粒酶逆转录酶基因启动子调控的肿瘤细胞靶向表达载体。     

人DDR2基因pShuttle-CMV穿梭载体的构建及表达

目的:构建带有flag标签的人DDR2 pShuttle-CMV载体, 检测其真核表达并观察DDR2分子的亚细胞分布. 方法:以含有人全长DDR2 cDNA的质粒为模板,用PCR方法扩增DDR2基因的C-端(DDR2-C),并在其C末端带上含24 bp的flag标签,Nco I/EcoR V酶切后亚克隆入含有DDR2全长序列的pMD18-T载体,即替换掉原有DDR2序列的C-端,引入flag标签,测序正确后再克隆入pShuttle-CMV表达载体,酶切鉴定正确后采用脂质体法瞬时转染HEK293细胞,Western Blot检测DDR2-flag在细胞中的表达. 瞬时转染Hela细胞,通过间接免疫荧光法观察DDR2分子在细胞内的分布情况. 结果:测序及酶切显示DDR2-flag/pShuttle-CMV载体构建符合预期;脂质体法转染HEK293细胞,24 h后用Western Blot方法检测到目的蛋白的表达;对转染了目的载体的细胞应用FITC标记的抗体进行间接免疫荧光实验,激光共聚焦显微镜观察到DDR2分子主要分布于细胞质与细胞膜. 结论:成功构建并表达了C-末端带flag标签的DDR2真核表达载体,使其在真核细胞中表达,并观察到其亚细胞分布.     

柯萨奇病毒B4双siRNA表达载体的构建及表达

目的：构建以柯萨奇病毒B4的1A和2A基因为靶基因并带有绿色荧光蛋白标志的可表达发夹结构的双链siRNA的表达载体pU6/double-siRNA/Neo/GFP/1A /2A。方法：选择柯萨奇病毒B4的1A和2A区基因21 bp为靶序列分别合成65 bp的互补片段并克隆到pSilencer2.1U6 Neo 和pGCsi-U6/Neo/GFP质粒中,经限制性内切酶消化、琼脂糖凝胶电泳分离、回收DNA片段,及连接酶连接构建双siRNA表达质粒pU6/double-siRNA/Neo/GFP/1A/2A;将构建的载体转染Hela细胞后,荧光显微镜观察荧光的表达。结果：限制性内切酶消化、琼脂糖凝胶电泳检测重组质粒pU6/double-siRNA/Neo/GFP/1A/2A,有正确的特异性片段,DNA测序也证明其具有正确序列;将该重组质粒转染入Hela细胞后,重组质粒构建成功并在真核细胞内表达GFP,表达时间可达15 d以上。结论：针对柯萨奇病毒B4的1A和2A基因的双siRNA表达载体pU6/double-siRNA/Neo/GFP/1A /2A构建成功,并可在真核细胞内持续表达15 d以上。     

Max作用蛋白1-0缺失突变体的构建、表达及细胞内定位的研究

目的:构建Max作用蛋白1-0(Max interacting protein1-0,Mxi1-0)缺失突变体的真核表达载体并观察这些突变体在细胞内的定位情况,为研究Mxi1-0细胞内定位与其功能的关系奠定基础。方法:以野生型Mxi1-0真核表达质粒为模板,聚合酶链式反应扩增出5种类型Mxi1-0缺失突变体的基因片段,克隆至增强绿色荧光蛋白真核表达载体,经酶切和测序鉴定后,利用脂质体将重组质粒转染小鼠胚胎成纤维细胞株(NIH3T3)。Western blot检测融合蛋白的表达,荧光显微镜下观察融合蛋白细胞内定位情况。结果:各种Mxi1-0缺失突变体经测序鉴定正确后,在NIH3T3中得到表达。免疫荧光结果表明,脯氨酸富集结构域(PRD)突变体在细胞质和细胞核中均有分布,与Sin3结合域高度同源结构域(tSID)突变体主要分布于细胞质,在细胞核中有少量分布;PRD-tSID突变体及△PRD突变体分布于细胞质,而△PRD-tSID突变体主要分布于细胞核。结论:成功构建了5种人Mxi1-0缺失突变体的真核表达载体,并初步观察这些突变体在细胞内的定位情况,为探寻Mxi1-0在细胞内定位机制及功能奠定了基础。     

前列腺癌上调表达基因BRP44的蛋白细胞定位及功能预测研究

目的 了解GFP-BRP44融合蛋白的细胞定位,初步预测BRP44的功能.方法 构建BRP44与GFP的融合表达真核载体,脂质体介导法转染高表达该基因的前列腺癌细胞株LNCaP,激光共聚焦显微镜观察融合蛋白的细胞定位.生物信息学方法对基因BRP44进行序列分析及功能预测.结果 成功构建GFP-BRP44融合蛋白的真核表达载体,pEG-FP-BRP44融和蛋白在LNCaP细胞核及细胞质均有表达.与单纯GFP相比,融合蛋白在细胞质的表达相比细胞核更强.功能预测提示基因BRP44可能是一个受oct-1等转录因子调控,主要在细胞线粒体发挥基因调节作用的可溶性蛋白.结论 BRP44蛋白可能主要在细胞质发挥作用.